專利名稱：一種用于生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的發(fā)酵菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于發(fā)酵柳枝稷類木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的菌劑。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人類對石油、天然氣、煤炭等不可再生化石能源的需求越來越大，由此產(chǎn)生了能源安全、石油消耗、全球變暖等諸多問題。這些問題促使世界各國加快了對安全、清潔、可再生的替代能源的研究。燃料乙醇是當前研究和應(yīng)用都取得很大進展的一種清潔的可替代能源，但目前其生產(chǎn)主要依賴于淀粉和糖類原料，這兩種原料利用涉及到與人畜爭糧爭地的問題，由此帶來的糧食價格上漲問題已經(jīng)顯現(xiàn)。開發(fā)糧食以外的廉價原料對制取燃料乙醇技術(shù)意義重大。柳枝稷(Panicum virgatum)是一種多年生草本C4作物，屬木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)原料之一。具有產(chǎn)量高、耐瘠薄、投入低，適應(yīng)性強等諸多特點。在過去近20年的時間里， 已先后被美國、加拿大、歐盟各國作為一種生產(chǎn)能源潛力巨大的替代材料進行研發(fā)利用，我國已開展了柳枝稷的引種及生長特性調(diào)查工作，但柳枝稷生物乙醇轉(zhuǎn)化工作才剛剛起步， 還未見專門利用柳枝稷生產(chǎn)纖維素酶及半纖維素酶的菌劑。將柳枝稷等木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇的過程包括原料預(yù)處理、酶水解、糖發(fā)酵、木質(zhì)素的分離、乙醇的回收及純化等步驟。目前，在這些轉(zhuǎn)化的每一步都存在著諸多的技術(shù)及成本限制。水解是其中的關(guān)鍵性步驟之一，纖維素酶及半纖維素酶以其作用條件溫和、污染少等特點在木質(zhì)纖維素乙醇轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用，但目前酶生產(chǎn)成本高、轉(zhuǎn)化效率低嚴重制約著纖維素乙醇轉(zhuǎn)化的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用，成為產(chǎn)業(yè)化技術(shù)的瓶頸。傳統(tǒng)的纖維素酶和半纖維素酶的生產(chǎn)主要是在自然界中篩選優(yōu)良的產(chǎn)酶單菌株， 再通過一定的誘變手段，獲得工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)酶菌種。但自然環(huán)境中木質(zhì)纖維素的降解是多種微生物協(xié)同完成的，這些微生物相互共生，形成一個穩(wěn)定的微生態(tài)體系。在特定的生態(tài)系統(tǒng)中，微生物之間互相協(xié)同作用，也互相制約，使得產(chǎn)生的水解酶之間的比例處于一種最適降解的狀態(tài)，而產(chǎn)酶的微生物一旦從其微生態(tài)體系中分離出來，就會破壞這個最佳比例。因此以自然環(huán)境中木質(zhì)纖維素降解為基礎(chǔ)，構(gòu)建自體穩(wěn)定的復(fù)合型發(fā)酵菌劑生產(chǎn)纖維素及半纖維素酶是解決問題的關(guān)鍵。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供一種生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的發(fā)酵菌劑。本發(fā)明所提供的菌劑的活性成分包括Achromobacter xylosoxidans、 Alcaligenesfaecalis、Fusarium sporotrichioides、Fusarium poae。所述發(fā)酵菌劑中，所述 Achromobacter xylosoxidans、Alcaligenes faecalis、Fusarium sporotrichioides、Fusarium poae 的集落形成單位數(shù)目比為 (4-6) (1-3) (6-10) (1-2)，具體為 4 1 6 1 或 6 3 10 2。
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PJf 述 Achromobacter xylosoxidans 具體可為 Achromobacter xylosoxidans ATCC15173 Jjfi^Alcaligenes faecalis 具體可為 Alcaligenes faecalis ATCC15554 ；所述 Fusarium sporotrichioides 具體可為 Fusarium sporotrichioides ATCC26533 ；所述 Fusarium poae 具體可為 Fusarium poae ATCC15654 ；本發(fā)明所提供的纖維素酶生產(chǎn)菌劑的活性成分也可僅由AchromcAacter xylosoxidansATCC15173、Alcaligenes faecalis ATCCl5554ΛFusarium sporotrichioides ATCC26533、Fusarium poae ATCC15654 組成。所述發(fā)酵菌劑中，所述 Achromobacter xylosoxidans、Alcaligenes faecalis、 Fusarium sporotrichioides、Fusarium poae 可分另Ij獨立包裝，也可混合在一起。本發(fā)明的發(fā)酵菌劑可以為液體制劑，包括甘油和EDTA，所述活性成分、甘油和 EDTA 的配比為(1-1. 2) XIOiiCFU (1-5) g 甘油Ig EDTA。本發(fā)明的發(fā)酵菌劑可以為固體制劑。在上述液體菌劑中加入吸附載體，如草炭或柳枝稷粉或秸稈粉，即可獲得固體制劑，所述活性成分和吸附載體的配比為 1 X IO6CFU (1-5) g 吸附載體。本發(fā)明所述菌劑可以發(fā)酵柳枝稷生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶。本發(fā)明所制備的菌劑優(yōu)先但不僅限于利用柳枝稷生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶，其發(fā)酵基質(zhì)還包括農(nóng)作物秸稈等木質(zhì)纖維素材料。所述菌劑具有高度的協(xié)同作用，自體形成穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，能在發(fā)酵體系中快速繁殖產(chǎn)酶，且操作簡易、成本低廉。
具體實施例方式實施例1、發(fā)酵菌劑中活性成分的篩選MCD 培養(yǎng)基的組成(g/L) =NaNO3 2g，KH2PO4 lg，MgSO4 · 7H20 lg，KCl 0. 5g，F(xiàn)eSO4 0. Olg,瓊脂15g，柳枝稷(唯一碳源)IOgo對于液體培養(yǎng)基，將柳枝稷粉碎過2mm篩后加入到培養(yǎng)基內(nèi)，其余成分相同。將0. 5g的最初用于篩選的樣品(樣品來源腐爛枯枝、枯葉、腐爛柳枝稷)分別接入到IOOml的Modified Czapek Dox (MCD)瓊脂內(nèi)。30°C培養(yǎng)14d后，將0. 05g長滿微生物的柳枝稷被轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。選取柳枝稷迅速變軟，纖維素、半纖維素降解迅速的培養(yǎng)物，篩選活性成分。通過分子生態(tài)學(xué)方法建立16S rDNA、26S rDNA D1/D2區(qū)克隆文庫對上述獲得的培養(yǎng)物進行研究，結(jié)果表明，上述培養(yǎng)物中的組成菌主要為AchromcAacter xylosoxidans, Alcaligenes faecalis、Fusarium sporotrichioides、Fusarium poae。實施例2、產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的發(fā)酵菌劑。一、菌劑的制備Achromobacter xylosoxidans ATCCl5173 ；Alcaligenes faecalis ATCCl5554 ； Fusarium sporotrichioides ATCC26533 ；Fusarium poae ATCC15654均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。菌株來源分別為土壤、糞便、豆殼及大麥種子。菌株活化Achromobacter xylosoxidans ATCC15173 禾口 Alcaligenes faecalisATCC15554分別接種到營養(yǎng)瓊脂(每升培養(yǎng)基組成蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂 15g，蒸溜水 1000ml，pH 7.4)上，27 °C 培養(yǎng) 2d ；將 Fusarium sporotrichioidesATCC26533和Fusariumpoae ATCC15654分別接種到PDA (每升培養(yǎng)基組成馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH自然)上，27°C培養(yǎng)4d。將已經(jīng)活化的菌株分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中AchromcAacter xylosoxidansATCC15173 和 Alcaligenes faecalis ATCC15554 分別接種于 50ml 營養(yǎng)肉湯 (每升培養(yǎng)基組成蛋白陳10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH 7.4)中，150rpm振蕩培養(yǎng) 2d ；將 Fusarium sporotrichioides ATCC26533 禾口 Fusarium poae ATCC15654 分另1J接種至 1J 50ml PDA 液體培養(yǎng)基中，150rpm 振蕩培養(yǎng) 4d。取 Achromobacter xylosoxidans ATCC15173 4ml、Alcaligenes faecalisATCC15554 1ml、Fusarium sporotrichioides ATCC26533 6ml、Fusarium poae ATCC15654 Iml進行混合，使四種菌的最終集落形成單位數(shù)目比為4 :1:6: 1，該混合培養(yǎng)液中的集落形成單位數(shù)目為IX 108CFU/ml。將上述混合發(fā)酵液、甘油和EDTA按照IX 10、1 5g Ig的配比混合，得到液體菌劑A。二、產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶菌劑的活性取制備好的液體菌劑A Iml接種于IOOml MCD培養(yǎng)基中，在27°C下150rpm振蕩培養(yǎng)6d，轉(zhuǎn)接入IL發(fā)酵罐中，接種量為10%，溫度為2749°C，pH為6.0，溶氧(DO)控制在 30% -50%，每隔24h取樣(發(fā)酵上清液)，按照如下方法測定酶活。纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)活性測定方法采用DNS方法測定，吸取0. 5ml酶液加入試管中，再加入Iml 的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液(lg CMC-Na溶于100ml ρΗ4· 8 的0. 05Μ檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液)，60°C保溫30min。加入;3mlDNS試劑，沸水浴加熱5min， 用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，測定其產(chǎn)生的還原糖量。一個酶活力單位(U)定義為每分鐘水解CMC-Na產(chǎn)生1 μ g葡萄糖所需酶量。半纖維素酶的測定方法吸取0.5ml酶液加入試管中，再加入Iml 的木聚糖溶液(Ig木聚糖溶于100ml pH6.0的0.05M的檸檬酸-磷酸二氫鈉溶液)，60°C保溫5min。加入;3mlDNS試劑，沸水浴加熱5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，測定其產(chǎn)生的還原糖量。一個酶活力單位(U)定義為每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1 μ g木糖所需酶量。上述方法重復(fù)三次，結(jié)果如下表所示，表中的數(shù)據(jù)為每ml發(fā)酵液所產(chǎn)生的酶活的平均值士標準差。菌劑A發(fā)酵柳枝稷產(chǎn)纖維素酶活性及半纖維素酶活性
發(fā)酵時間(d)纖維素酶活性(U/ml)半纖維素酶活性(U/ml)1144.3 ±5.72443.6±15.92188.5±4.13036.0±22.33208.4±3.23378.5±27.54346.8 ±8.43251.6±29.45399.3 ±6.53104.2±19.86423.5±9.73044.7±16.2 實施例3、產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的發(fā)酵菌劑。
一、菌劑的制備Achromobacter xylosoxidans ATCC15173 ；Alcaligenes faecalis ATCC15554 ； Fusarium sporotrichioides ATCC26533 ；Fusarium poae ATCC15654均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。菌株來源分別為土壤、糞便、豆殼及大麥種子。菌株活化參見實施例2將已經(jīng)活化的菌株分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中AchromcAacter xylosoxidans ATCC15173 和 Alcaligenes faecalis ATCC15554 分別接種于 50ml 營養(yǎng)肉湯中，150rpm 振蕩培養(yǎng) 2d ；將 Fusarium sporotrichioides ATCC26533 禾口 Fusariumpoae ATCC15654分別接種到50mlPDA液體培養(yǎng)基中，150rpm振蕩培養(yǎng)4d。取Achromobacter xylosoxidans ATCC15173 6ml、Alcaligenes faecalis ATCC15554 3ml、Fusarium sporotrichioides ATCC26533 10ml、Fusariumpoae ATCC15654 2ml 進行混合，使四種菌的最終集落形成單位數(shù)目比為6 3 10 2，該混合培養(yǎng)液中的集落形成單位數(shù)目為 1. 2X108CFU/ml。將上述混合發(fā)酵液、甘油和EDTA按照IX l(fml 5g Ig的配比混合，得到液體菌劑B。二、產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶菌劑的活性取制備好的產(chǎn)酶菌劑B Iml接種于IOOml MCD培養(yǎng)基中，在27°C下150rpm振蕩培養(yǎng)6d，轉(zhuǎn)接入IL發(fā)酵罐中，接種量為10%，溫度為27-四1，？!1為5.0-6.0，溶氧(DO)控制在30% -50%，每隔24h取樣(發(fā)酵上清液)，按照如下方法測定酶活。纖維素酶活性及半纖維素酶活性測定參照實施例2。上述方法重復(fù)三次，結(jié)果如下表所示，表中的數(shù)據(jù)為每ml發(fā)酵液所產(chǎn)生的酶活的平均值士標準差。菌劑B發(fā)酵柳枝稷產(chǎn)纖維素酶活性及半纖維素酶活性
發(fā)酵時間(d)纖維素酶活性(U/ml)半纖維素酶活性(U/ml)1137.3 ±4.32400.1 ±20.22174.8±2.82988.3 ±19.33196.1 ±6.63107.4±20.54312.7±9.13^K).6±30.75376.6±10.23044.9 ±28.16421.6±8.53010.0±30.6實施例4、菌劑發(fā)酵稻秸產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶。一、菌劑的制備Achromobacter xylosoxidans ATCC15173 ；Alcaligenes faecalis ATCC15554 ； Fusarium sporotrichioides ATCC26533 ；Fusarium poae ATCC15654均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。菌株來源分別為土壤、糞便、豆殼及大麥種子。參照實施例3制備液體菌劑B。二、產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶菌劑的活性
取制備好的產(chǎn)酶菌劑B接種于100ml MCD(碳源由柳枝稷更換為收獲籽粒后的稻秸)培養(yǎng)基中，在下150rpm振蕩培養(yǎng)6d，轉(zhuǎn)接入IL發(fā)酵罐中(稻秸為唯一碳源)，接種量為10%，溫度為27-29°C, pH為5. 0-6.0，溶氧(DO)控制在30%-50%，每隔24h取樣 (發(fā)酵上清液)，按照如下方法測定酶活。纖維素酶及半纖維素酶活測定參照實施例2。菌劑B發(fā)酵稻秸產(chǎn)纖維素酶活性和半纖維素酶活性
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的發(fā)酵菌劑，它的活性成分包括AchromcAacter xylosoxidans、Alcaligenes faecalis、Fusarium sporotrichioides、Fusarium poae0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌劑，其特征在于所述Achromobacterxylosoxickns、 Alcaligenes faecalis、Fusarium sporotrichioides、Fusariumpoae 的集落形成單位數(shù)目比為(4-6) (1-3) (6-10) (1-2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于所述Achromobacterxylosoxickns、 Alcaligenes faecalis、Fusarium sporotrichioides、Fusariumpoae 的集落形成單位數(shù)目比為4 1 6 1 或 6 3 10 2。
4.根據(jù)權(quán)利1-3中任一所述菌劑，其特征在于所述Achromobacterxylosoxickns為 Achromobacter xylosoxidans ATCC15173 ；所述 Alcaligenes faecalis 為 Alcaligenes faecalis ATCC15554 ；所述 Fusarium sporotrichioides 為 Fusarium sporotrichioides ATCC26533 ；所述 Fusarium poae 為 Fusarium poae ATCC15654。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中包括甘油和EDTA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于所述活性成分、甘油和EDTA的配比為 (1-1. 2) XIOiiCFU (1-5) g 甘油Ig EDTA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中包括吸附載體，所述吸附載體為草炭或柳枝稷粉或秸稈粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的菌劑，其特征在于所述活性成分和吸附載體的配比為 1 X IO6CFU (1-5) g 吸附載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的菌劑，其特征在于AchromcAacterxylosoxidans ATCC15173、Alcaligenes faecalis ATCC15554、Fusarium sporotrichioides ATCC26533、 Fusarium poae ATCC15654分別獨立包裝或混合在一起。
10.權(quán)利要求1-9中任一所述的菌劑發(fā)酵柳枝稷、農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用天然木質(zhì)纖維素材料產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的菌劑。該產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的菌劑活性成分為Achromobacter xylosoxidans、Alcaligenes faecalis、Fusarium sporotrichioides、Fusarium poae。本發(fā)明的用于產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的菌劑中的微生物具有高度的協(xié)同作用，自體形成穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)。本發(fā)明中的菌劑為專門針對于能源作物柳枝稷開發(fā)，但不僅限于利用柳枝稷生產(chǎn)纖維素酶及半纖維素酶，還可用于廢棄農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)纖維素酶及半纖維素酶。
文檔編號C12N1/00GK102161971SQ201110107458
公開日2011年8月24日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者吳昊, 李玉花, 楊洪巖 申請人:吳昊, 李玉花, 楊洪巖