專利名稱：一種從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)中分離提取纖維素酶的方法，尤其涉及一種從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法。
背景技術(shù)：
纖維素類資源是世界上最廉價(jià)、儲(chǔ)量最豐富的可再生資源。我國是個(gè)農(nóng)業(yè)大國，小麥秸桿等木質(zhì)纖維素儲(chǔ)量更是豐富。在許多農(nóng)村小麥秸桿等甚至多被焚燒，這不僅造成了環(huán)境的嚴(yán)重污染還造成了木質(zhì)纖維素原料的大量浪費(fèi)。因此，如何將這種可再生資源合理利用成了急需應(yīng)對的難題，在解決這一問題上各國工作者做了大量研究。目前，由纖維素酶酶解木質(zhì)纖維素制成燃料乙醇是能大規(guī)模利用木質(zhì)纖維素的最有效方法之一，同時(shí)也是新能源方面研究的熱點(diǎn)。如美國提出到2020年生物質(zhì)燃料油取代全國燃油消耗量10%，歐盟委員會(huì)提出20%的運(yùn)輸燃料由燃料乙醇等生物燃料替代等計(jì)劃。但木質(zhì)纖維素制乙醇仍存在生產(chǎn)成本高，與傳統(tǒng)能源相比沒有太大優(yōu)勢及產(chǎn)率低等缺陷。其中，纖維素酶的生產(chǎn)成本居高不下是導(dǎo)致木質(zhì)纖維素制乙醇生產(chǎn)成本難以降低的主要因素之一。因此，為了促進(jìn)木質(zhì)纖維素的合理利用及新能源的開發(fā)，降低纖維素酶的生產(chǎn)成本成了最亟待解決的難題。在從發(fā)酵液中分離提取纖維素酶的工業(yè)級(jí)制備方面，柱層析分離方式由于高成本與操作的復(fù)雜性等原因很難有效的放大到工業(yè)規(guī)模。目前，工業(yè)中纖維素酶的分離方法主 要有硫酸銨鹽析和乙醇沉淀等。但是硫酸銨鹽析后會(huì)產(chǎn)生大量的鹽較難除去與回收，而乙醇沉淀的成本又相對較高，從而制約了木質(zhì)纖維素原料及纖維素酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對一般提取纖維素酶方法的弊端，提供一種從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，本發(fā)明采用改進(jìn)的單寧沉淀法分離提取經(jīng)產(chǎn)纖維素酶微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶，并采用真空冷凍干燥法制備成粉末狀纖維素酶產(chǎn)品，使纖維素酶的回收率能夠達(dá)到90-95%，具有用時(shí)短、能耗小、操作簡單、纖維素酶收率高的優(yōu)點(diǎn)，克服了分離提取纖維素酶階段在整個(gè)木質(zhì)纖維素制乙醇工藝中成本過高、操作復(fù)雜等難題，適用于纖維素酶工業(yè)化大規(guī)模制備。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，包括以下步驟步驟一、發(fā)酵液澄清，將產(chǎn)纖維素酶微生物發(fā)酵140 200h左右的發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，得到發(fā)酵澄清液；步驟二、單寧沉淀，將所述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，同時(shí)調(diào)節(jié)所述發(fā)酵澄清液的PH值至4. O 6. 0，將一定量的單寧溶液加入攪拌罐中的發(fā)酵澄清液中，并持續(xù)攪拌一定時(shí)間，進(jìn)行纖維素酶的沉淀；步驟三、沉淀收集，將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵澄清液進(jìn)行壓濾，收集沉淀，得到所述纖維素酶。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，步驟一中用板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，包括以下步驟步驟一、一級(jí)壓濾，將所述發(fā)酵液用裝有5 10層紗布的板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，得到一級(jí)濾液；步驟二、二級(jí)壓濾，將得到的所述一級(jí)濾液用裝有I 10 μ m濾布的板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，得到所述發(fā)酵澄清液。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，對步驟一中得到的所述發(fā)酵澄清液和步驟三中經(jīng)單寧沉淀收集到的纖維素酶沉淀分別用濾紙酶活力測定方法測定其纖維素酶活力。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，所述單寧溶液的配 置方法為按照每100L發(fā)酵澄清液中加入400_1000g單寧的比率，根據(jù)發(fā)酵液的體積，將相應(yīng)量濃度為3 10g/L的單寧用檸檬酸緩沖液進(jìn)行溶解，得到單寧溶液，其中，所述檸檬酸緩沖液PH值為4. O 6. O。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，步驟二中所述攪拌的轉(zhuǎn)速為50 200r/min。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，步驟三中所述持續(xù)攪拌的時(shí)間為I 5h。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，步驟一中所述加入檸檬酸緩沖液的量為使所述單寧完全溶解的量。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，步驟三中可將收集的沉淀經(jīng)真空冷凍干燥制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，所述真空冷凍干燥的條件是真空度為9 19Pa，溫度為-45 _55°C，抽真空12 36h直至成粉術(shù)狀無水分時(shí)為止。優(yōu)選的是，所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，所述的調(diào)節(jié)pH的酸堿選擇2mol/L濃度的H2SO4和NaOH。本發(fā)明具有以下有益效果通過采用改進(jìn)的單寧沉淀法分離提取經(jīng)產(chǎn)纖維素酶微生物液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶，并采用真空冷凍干燥法制備成粉末狀纖維素酶產(chǎn)品，使纖維素酶的回收率能夠達(dá)到90-95%，具有用時(shí)短、能耗小、操作簡單、纖維素酶收率高的優(yōu)點(diǎn)，克服了分離提取纖維素酶階段在整個(gè)木質(zhì)纖維素制乙醇工藝中成本過高、操作復(fù)雜等難題，適用于纖維素酶工業(yè)化大規(guī)模制備。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明做詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說明書后能夠據(jù)以實(shí)施。一種從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，包括以下步驟步驟一、發(fā)酵液澄清，將產(chǎn)纖維素酶的微生物發(fā)酵140 200h左右的發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，得到發(fā)酵澄清液；本發(fā)明所述產(chǎn)纖維素酶微生物為里氏木霉。步驟二、單寧沉淀,將所述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中，以50 200r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，調(diào)節(jié)所述發(fā)酵澄清液的PH值至4. O 6. 0，將一定量的單寧加入到所述發(fā)酵澄清液中，并持續(xù)攪拌I 5h，進(jìn)行纖維素酶的沉淀，其中所述的調(diào)節(jié)pH的酸堿選擇2mol/L濃度的 H2SO4 和 NaOH。步驟三、沉淀收集，將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵澄清液進(jìn)行壓濾，收集沉淀，得到所述纖維素酶。可將收集的纖維素酶沉淀經(jīng)真空冷凍干燥制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。所述真空冷凍干燥的條件是真空度為9 19Pa，溫度為-45 _55°C，抽真空12 36h直至成粉末狀無水分時(shí)為止。所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，步驟一中用板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，包括以下步驟步驟一、一級(jí)壓濾，將所述里氏木霉發(fā)酵液用裝有5 10層紗布的板框壓濾機(jī)進(jìn) 行壓濾，得到一級(jí)濾液；步驟二、二級(jí)壓濾，將得到的所述一級(jí)濾液用裝有I 10 μ m濾布的板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，得到所述發(fā)酵澄清液。所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，對步驟一中得到的所述發(fā)酵澄清液和步驟三中經(jīng)單寧沉淀收集到纖維素酶沉淀分別用濾紙酶活力測定方法測定其纖維素酶活力。通過先后兩步測定所述纖維素酶的酶活力，經(jīng)過計(jì)算可得到酶活收率。所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法中，步驟二中所述單寧溶液的配置方法為按照每100L發(fā)酵澄清液中加入400_1000g單寧的比率，根據(jù)發(fā)酵液的體積，將相應(yīng)量濃度為3 10g/L的單寧用檸檬酸緩沖液進(jìn)行溶解，得到單寧溶液，其中，所述檸檬酸緩沖液PH值為4. O 6. O ;所述加入檸檬酸緩沖液的量為使所述單寧完全溶解的量。本發(fā)明提供的采用單寧沉淀分離提取發(fā)酵液中纖維素酶的方法具有以下突出特
占-
^ \\\ ·單寧作為纖維素酶的沉淀劑，是應(yīng)用單寧能與纖維素酶蛋白通過氫鍵結(jié)合的原理，并且這種氫鍵的結(jié)合具有可逆性。通過實(shí)驗(yàn)測定，由于其無效吸附少等原因，在相同條件下這種與單寧結(jié)合的纖維素酶的酶解秸桿率要高于相同酶活單位數(shù)的發(fā)酵液，因此具有很高的應(yīng)用性。同時(shí)單寧既是纖維素酶的沉淀劑也是在制成粉末狀產(chǎn)品時(shí)纖維素酶的保護(hù)劑和防腐劑，因此能進(jìn)一步的減少成本。本發(fā)明操作工藝簡單可行、投入設(shè)備成本低、能耗小、收率高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中分離提取纖維素酶。下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明實(shí)施例I :將由里氏木霉液體深層發(fā)酵200h的發(fā)酵液先經(jīng)過裝有5層紗布的板框壓濾機(jī)壓濾進(jìn)行一級(jí)澄清，再經(jīng) ο μ m的濾布進(jìn)行二級(jí)澄清。。調(diào)節(jié)澄清后發(fā)酵液的pH為4. 0，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為200r/min。稱取3g/L單寧并用pH4. O檸檬酸緩沖液充分溶解后一次性加入到攪拌罐中，攪拌均勻后靜置lh。將單寧沉淀后的發(fā)酵液經(jīng)裝有10 μ m濾布板框壓濾收集沉淀，采用真空冷凍干燥機(jī)在真空度llPa，-50°C條件下凍干30h制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測定發(fā)酵液酶活，測得酶活收率為75%。實(shí)施例2:將由里氏木霉液體深層發(fā)酵200h的發(fā)酵液先經(jīng)過裝有5層紗布的板框壓濾機(jī)壓濾進(jìn)行一級(jí)澄清，再經(jīng) ο μ m的濾布進(jìn)行二級(jí)澄清。調(diào)節(jié)澄清后發(fā)酵液的pH為4. 5，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為150r/min。稱取5g/L單寧并用PH4. 5檸檬酸緩沖液充分溶解后一次性加入到攪拌罐中，持續(xù)攪拌2h。將單寧沉淀后的發(fā)酵液經(jīng)裝有10 μ m濾布板框壓濾收集沉淀，采用真空冷凍干燥機(jī)在真空度llPa，_50°C條件下凍干30h制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測定發(fā)酵液酶活，測得酶活收率為82%。
實(shí)施例3 將由里氏木霉液體深層發(fā)酵200h的發(fā)酵液先經(jīng)過裝有5層紗布的板框壓濾機(jī)壓濾進(jìn)行一級(jí)澄清，再經(jīng) ο μ m的濾布進(jìn)行二級(jí)澄清。調(diào)節(jié)澄清后發(fā)酵液的pH為5. 0，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為lOOr/min。稱取7g/L單寧并用PH5. O檸檬酸緩沖液充分溶解后緩慢均勻的流加到攪拌罐中，持續(xù)攪拌4h。將單寧沉淀后的發(fā)酵液經(jīng)裝有IOym濾布板框壓濾收集沉淀，采用真空冷凍干燥機(jī)在真空度llPa，-50°C條件下凍干30h制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測定發(fā)酵液酶活，測得酶活收率為89%。實(shí)施例4 將由里氏木霉液體深層發(fā)酵200h的發(fā)酵液先經(jīng)過裝有5層紗布的板框壓濾機(jī)壓濾進(jìn)行一級(jí)澄清，再經(jīng) ο μ m的濾布進(jìn)行二級(jí)澄清。調(diào)節(jié)澄清后發(fā)酵液的pH為5. 0，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為50r/min。稱取5g/L單寧并用pH5. O檸檬酸緩沖液充分溶解后在2h內(nèi)緩慢流加到攪拌罐中，并繼續(xù)緩慢攪拌lh。將單寧沉淀后的發(fā)酵液經(jīng)裝有10 μ m濾布?jí)簽V收集沉淀，采用真空冷凍干燥機(jī)在真空度llPa，-50°C條件下凍干30h制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測定發(fā)酵液酶活，測得酶活收率為92%。盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，包括以下步驟 步驟一、發(fā)酵液澄清，將產(chǎn)纖維素酶微生物發(fā)酵140 200h左右的發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，得到發(fā)酵澄清液； 步驟二、單寧沉淀，將所述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，同時(shí)調(diào)節(jié)所述發(fā)酵澄清液的PH值至4. O 6. 0，將一定量的單寧溶液加入攪拌罐中的發(fā)酵澄清液中，并持續(xù)攪拌一定時(shí)間，進(jìn)行纖維素酶的沉淀； 步驟三、沉淀收集，將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵澄清液進(jìn)行壓濾，收集沉淀，得到所述纖維素酶。
2.如權(quán)利要求I所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，步驟一中用板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，包括以下步驟 步驟一、一級(jí)壓濾，將所述發(fā)酵液用裝有5 10層紗布的板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，得到一級(jí)濾液； 步驟二、二級(jí)壓濾，將得到的所述一級(jí)濾液用裝有I 10 μ m濾布的板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，得到所述發(fā)酵澄清液。
3.如權(quán)利要求I或2所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，對步驟一中得到的所述發(fā)酵澄清液和步驟三中經(jīng)單寧沉淀收集到的纖維素酶沉淀分別用濾紙酶活力測定方法測定其纖維素酶活力。
4.如權(quán)利要求I所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，所述單寧溶液的配置方法為 按照每100L發(fā)酵澄清液中加入400-1000g單寧的比率，根據(jù)發(fā)酵液的體積，將相應(yīng)量濃度為3 10g/L的單寧用檸檬酸緩沖液進(jìn)行溶解，得到單寧溶液，其中，所述檸檬酸緩沖液pH值為4. O 6. O。
5.如權(quán)利要求I所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，步驟二中所述攪拌的轉(zhuǎn)速為50 200r/min。
6.如權(quán)利要求I所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，步驟二中所述持續(xù)攪拌的時(shí)間為I 5h。
7.如權(quán)利要求I或4所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，步驟一中所述加入檸檬酸緩沖液的量為使所述單寧完全溶解的量。
8.如權(quán)利要求I所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，步驟三中可將收集的沉淀經(jīng)真空冷凍干燥制得粉術(shù)狀纖維素酶產(chǎn)品。
9.如權(quán)利要求I或8所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，所述真空冷凍干燥的條件是真空度為9 19Pa，溫度為-45 _55°C，抽真空12 36h直至成粉術(shù)狀無水分時(shí)為止。
10.如權(quán)利要求I所述的從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)pH的酸堿選擇2mol/L濃度的H2SO4和NaOH。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從微生物發(fā)酵液中提取纖維素酶的方法，包括以下步驟發(fā)酵液澄清將由產(chǎn)纖維素酶微生物發(fā)酵140～200h左右的發(fā)酵液先經(jīng)過壓濾得到發(fā)酵澄清液，將發(fā)酵澄清液轉(zhuǎn)移至不銹鋼攪拌罐中；單寧沉淀先調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速將澄清后的發(fā)酵液攪拌，同時(shí)調(diào)節(jié)pH在4.0-6.0范圍內(nèi)，然后將一定量的單寧用檸檬酸緩沖液充分溶解后緩慢均勻的加入到攪拌罐中并持續(xù)攪拌一定時(shí)間。沉淀收集及制備將經(jīng)單寧沉淀后的發(fā)酵液用板框壓濾機(jī)壓濾收集沉淀，然后用真空冷凍干燥機(jī)凍干制成粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。通過本發(fā)明的方法提取纖維素酶的用時(shí)短、能耗小、操作簡單，纖維素酶蛋白收率能達(dá)到90～95％。
文檔編號(hào)C12R1/885GK102876648SQ20121041297
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者宗志友, 馬立娟, 赫榮琳, 李晨, 賈文娣, 陳樹林 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所