專利名稱：一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物及其鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬鯖屬魚類的鑒別技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物和鑒別方法。
背景技術(shù)：
日本鯖(S. japonicus)與澳洲鯖(S. australasicus)在中國漁業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位，其分類依據(jù)主要是傳統(tǒng)的分類方法，利用“日本鯖腹部無斑點，澳洲鯖腹部具斑點” 作為鑒別二者的最重要依據(jù)。由于兩者形態(tài)特別相似，而且二者往往存在中間過渡類型，使得傳統(tǒng)的分類方法不容易區(qū)分兩者，這也導(dǎo)致兩者的分類地位一直存有爭議。日本鯖和澳洲鯖的不易區(qū)分，直接導(dǎo)致在漁業(yè)資源調(diào)查中，經(jīng)常將二者作為一種漁業(yè)資源進行統(tǒng)計。顯然，這對于有效管理和可持續(xù)利用日本鯖和澳洲鯖漁業(yè)資源十分不利。在過去的數(shù)十年中，學(xué)者往往都是用形態(tài)可數(shù)性狀和PCR-RFLP技術(shù)來鑒別鯖科魚類，但上述各方法在種類鑒定時都存在一定的缺陷。例如由于中間過渡類型的存在，使得基于形態(tài)斑點有無的方法，很難區(qū)分日本鯖和澳洲鯖；BAKER等利用第一背鰭棘數(shù)和第一背鰭與第二背鰭間的脈間骨(interneural bone)(澳洲鯖30 33 ；日本鯖26 29) 數(shù)目區(qū)分印度洋及紅海的澳洲鯖和日本鯖。但二者脈間骨數(shù)目相近，該方法容易出現(xiàn)計數(shù)錯誤。FUT0SHI利用PCR-RFLP技術(shù)鑒別日本鯖，澳洲鯖以及大西洋鯖。但該方法首先需自行設(shè)計特異性引物，然后通過繁瑣的軟件尋找合適的限制性內(nèi)切酶特異性的切割三種魚類 DNA,并且電泳檢測才能顯示最終結(jié)果。為有效管理和可持續(xù)利用日本鯖和澳洲鯖漁業(yè)資源，有必要查明日本鯖、澳洲鯖二者的差異，建立準(zhǔn)確高效的線粒體控制區(qū)(D-Ioop)鑒別標(biāo)記，從而為有效管理和合理的開發(fā)利用兩種鯖魚資源提供理論基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物和鑒別方法， 該方法簡單、快速、準(zhǔn)確、高效。本發(fā)明的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物，引物序列為FP :5，-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3，；RP :5，-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3，。本發(fā)明的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，包括(1)提取日本鯖與澳洲鯖肌肉組織中總基因組DNA ；(2) PCR擴增反應(yīng)引物序列為FP :5，-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3，；RP :5，-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3，；(3) PCR產(chǎn)物測序及校對將上述PCR產(chǎn)物用含EB (溴化乙錠)的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，在測序儀上進行雙向測序，其測序引物仍為PCR擴增引物，測序結(jié)果經(jīng)校對拼接后，用軟件進行比對，獲得一致序列；
(4) D-Ioop堿基矩陣的構(gòu)建通過軟件統(tǒng)計兩種鯖魚的變異位點，找出各自的固定位點，構(gòu)建堿基矩陣。所述步驟⑴采用酚氯仿法抽提DNA。所述步驟O)中的PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系包括100ngDNA模板，0.2mmol/L dNTPs，引物各 1. Oumo 1/L, 4. Ommo 1/L MgCl2, 5. OuLlOXreaction buffer (反應(yīng)緩沖液)，2U Taq聚合酶，然后加去離子水至終體積50uL。所述步驟O)中的擴增程序如下94°C預(yù)變性5min ；94 °C變性45s，52 °C退火 lmin，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0所述步驟(3)優(yōu)選使用Clustal X軟件比對。所述步驟(4)優(yōu)選使用MEGA4. O軟件統(tǒng)計變異位點。通過本發(fā)明方法獲得D-Ioop全序列后，第4位，日本鯖全部為C，而澳洲鯖全部為 T，這第4位就是兩種鯖魚的鑒別標(biāo)記。MCDONALD和KREITMAN將種內(nèi)個體間無堿基差異而種間有明顯堿基差異的位點， 定義為固定位點(fixation site)，并將其作為種間差異的標(biāo)志，用以區(qū)分種內(nèi)差異和種間差異。利用固定位點鑒別物種簡單，快速，準(zhǔn)確，其最突出的優(yōu)點是只需建立一個“堿基矩陣”就能高效的區(qū)別相似物種。本發(fā)明針對日本鯖與澳洲鯖的線粒體D-Ioop序列，采用通用引物順利擴增出二者基因組DNA，并成功構(gòu)建堿基矩陣。后利用多個日本鯖與澳洲鯖的D-Ioop進行驗證，均說明本發(fā)明所構(gòu)建的堿基矩陣可以準(zhǔn)確的用于判別日本鯖與澳洲鯖。這種堿基矩陣技術(shù)簡單快速，有望應(yīng)用到兩種鯖屬魚類的檢測中，在漁業(yè)資源調(diào)查中發(fā)揮重要作用。有益效果本發(fā)明方法只需利用一對引物通過常規(guī)PCR反應(yīng)即能順利擴增出線粒體控制區(qū) (D-Ioop)，利用構(gòu)建好的固定位點堿基矩陣可以簡單、快速、準(zhǔn)確、高效的鑒別這兩種鯖屬魚類。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1本發(fā)明中的日本鯖與澳洲鯖均為在海南文昌清瀾港收集。一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物，引物序列為FP :5，-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3，；RP :5，-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3，。一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，包括(1)采用酚氯仿法抽提日本鯖與澳洲鯖肌肉組織中總基因組DNA ；O) PCR擴增反應(yīng)引物序列為FP :5，-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3，；RP :5，-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3，；PCR 的反應(yīng)體系包括100ngDNA 模板，0. 2mmol/L dNTPs,引物各 1. Oumol/L，4. 0 mmol/LMgCl2,5. OuLlOXreaction buffer, 2U Taq 聚合酶，然后加去離子水至終體積 50uL ；擴增程序如下94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，52°C退火lmin，72°C延伸lmin， 共35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin ；(3) PCR產(chǎn)物測序及校對將上述PCR產(chǎn)物用含EB (溴化乙錠)的0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，在測序儀上進行雙向測序，其測序引物仍為PCR擴增引物，測序結(jié)果經(jīng)校對拼接后，用Clustal X 軟件進行比對，獲得一致序列；(4) D-Ioop堿基矩陣的構(gòu)建通過MEGA4. O軟件統(tǒng)計兩種鯖魚的變異位點，找出各自的固定位點，構(gòu)建堿基矩陣，如下所示日本鯖與澳洲鯖控制區(qū)(D-Ioop)序列固定位點堿基矩陣[1111122222222344455555][80179922344446703724688][497732409967895170930367]日本鯖 01 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 02 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 03 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 04 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 05 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 07 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 08 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 09 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 11 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 12 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 13 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 15 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 16 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT日本鯖 19 CGATTCCATGTTATATGTTCTTGT澳洲鯖01 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖02 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖03 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖04 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖05 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖06 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖07 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖08 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC澳洲鯖09 TATCATATCACCGCCGTCAGCCAC使用說明在獲得D-Ioop全序列后，第4位，日本鯖全部為C，而澳洲鯖全部為T，這第4位就是兩種鯖魚的鑒別標(biāo)記。其它位點依次類推。
權(quán)利要求
1.一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物，其特征在于引物序列為，F(xiàn)P :5，-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’ ；RP :5，-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’。
2.一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，包括(1)提取日本鯖與澳洲鯖肌肉組織中總基因組DNA ；O) PCR擴增反應(yīng)引物序列為，F(xiàn)P :5，-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’ ；RP :5，-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’ ；(3)PCR產(chǎn)物測序及校對將上述PCR產(chǎn)物用含EB(溴化乙錠)的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，在測序儀上進行雙向測序，其測序引物仍為PCR擴增引物，測序結(jié)果經(jīng)校對拼接后，用軟件進行比對， 獲得一致序列；(4)D-Ioop堿基矩陣的構(gòu)建通過軟件統(tǒng)計兩種鯖魚的變異位點，找出各自的固定位點，構(gòu)建堿基矩陣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于所述步驟⑴ 采用酚氯仿法抽提DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于所述步驟(2) 中的PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系包括100ngDNA模板，0. 2mmol/L dNIPs，引物各1. Oumo 1/L, 4. Ommo 1/L MgCl2, 5. OuLlOXreaction buffer, 2U Taq 聚合酶，然后加去離子水至終體積 50uLo
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于所述步驟(2) 中的擴增程序如下94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35 個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于所述步驟(3) 使用Clustal X軟件比對。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于所述步驟⑷ 使用MEGA4. O軟件統(tǒng)計變異位點。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于在獲得 D-Ioop全序列后，第4位，日本鯖全部為C，而澳洲鯖全部為T，第4位即為兩種鯖魚的鑒別標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物及其鑒別方法，引物序列為FP5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’鑒別方法，包括提取日本鯖與澳洲鯖肌肉組織中總基因組DNA；PCR擴增反應(yīng)；PCR產(chǎn)物測序及校對；D-loop堿基矩陣的構(gòu)建。本發(fā)明方法簡單、快速、準(zhǔn)確、高效的鑒別這兩種鯖屬魚類。
文檔編號C12N15/11GK102304562SQ20111010729
公開日2012年1月4日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者程起群, 鄭將臣, 黃昊 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所