淡紫紫孢菌及其協(xié)同生物質(zhì)修復(fù)污染水體重金屬的方法與流程

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一株淡紫紫孢菌及其協(xié)同生物質(zhì)修復(fù)污染水體重金屬的方法。
背景技術(shù)：
：隨著人類社會工業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生化用品的增加，重金屬污染的問題日漸尖銳，已經(jīng)成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題之一。重金屬污染會造成農(nóng)田土壤肥力退化，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)降低，而且加快環(huán)境水質(zhì)惡化，并通過食物鏈，最終影響到人類健康。鎘是一種毒性很大的重金屬，其化合物也大都屬于毒性物質(zhì)。鎘用途很廣，顏料、合金、電鍍、電池、冶金等都要用到鎘。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，“三廢”的排放、污水灌溉及農(nóng)藥、除草劑和化肥的使用越來越多，土壤和水體中鎘的含量顯著增加，植物和環(huán)境系統(tǒng)中的cd污染問題日趨嚴(yán)峻，從而使農(nóng)產(chǎn)品的安全性受到嚴(yán)重威脅。正是由于這樣一些原因，國際和國內(nèi)對于重金屬污染及其防治的研究已經(jīng)成為環(huán)境、化學(xué)、生命科學(xué)等相交叉的重點和熱點研究領(lǐng)域，相關(guān)應(yīng)用性研究側(cè)重于分析重金屬污染的來源、防治措施和環(huán)境修復(fù)等方面。目前國內(nèi)外治理重金屬污染，主要采用離子交換、化學(xué)沉淀、溶劑提取等傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法。由于需要復(fù)雜的設(shè)施設(shè)備以及破壞土層結(jié)構(gòu)，物理化學(xué)修復(fù)法的投資成本較高，并且它們還會影響土壤或水體本生的母質(zhì)性質(zhì)甚至?xí)茐耐寥阑蛩w生物的多樣性，所以對于大面積受污染的土壤或水體不宜使用。生物修復(fù)技術(shù)因其獨有的優(yōu)勢逐漸被推到人們的關(guān)注范圍之內(nèi)。生物修復(fù)是指一切以生物為主體來治理環(huán)境污染的技術(shù)。它包括利用動物、植物和微生物吸收、轉(zhuǎn)化、降解土壤和水體中的污染物，使環(huán)境中污染物的濃度降低，或?qū)⑽廴疚镛D(zhuǎn)化為其他無污染物質(zhì)，以及使污染物穩(wěn)定化，避免其向環(huán)境中擴散。在環(huán)境保護(hù)研究方面，微生物修復(fù)也成為很多研究者的興趣所在。針對微生物對重金屬抗性和富集的研究是利用微生物修復(fù)重金屬污染的一個很好的途徑。cn103409346a公開了一種重金屬抗性果膠桿菌np22，其活化后可制備重金屬吸附劑，對重金屬鎘的最大吸附量可達(dá)到113mg/g；cn103952333b公開了一種具有鎘耐性的假單胞菌tcd-1，其對包括鎘、鉛和鎳的多種重金屬均具有耐性，在重金屬鎘污染的濕潤土壤中添加該菌液，其能修復(fù)鎘對水稻生長的抑制作用。目前為止，大多數(shù)文獻(xiàn)公開的微生物修復(fù)重金屬污染對象為土壤，對于重金屬污染的水體環(huán)境的微生物修復(fù)研究較少；另外，對于利用淡紫紫胞菌在重金屬污染水體中的修復(fù)作用至今未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種淡紫紫孢菌及其協(xié)同生物質(zhì)修復(fù)污染水體重金屬的方法。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一株淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13169，保藏日期為2016年10月27日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼為100101。本發(fā)明還提供了一種重金屬污染水體修復(fù)劑，其包括如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)。本發(fā)明提供的重金屬污染水體修復(fù)劑中，除了包括所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)外，還可以包括生物質(zhì)。本發(fā)明中，將生物質(zhì)與所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)共同培養(yǎng)于污染水體中時，二者具有協(xié)同增效作用，其能夠由單獨使用淡紫紫孢菌實現(xiàn)接近35％的鎘去除效率提升到62％以上的鎘去除效率。本發(fā)明中對生物質(zhì)不做特殊限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的生物質(zhì)材料均可用于本發(fā)明，不過，優(yōu)選的生物質(zhì)是玉米秸稈與苜蓿干草的混合物，二者的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1，此配比下能使鎘的去除效率至少達(dá)到62％以上。本發(fā)明提供的重金屬污染水體修復(fù)劑，其用于修復(fù)重金屬鎘。本發(fā)明還提供了如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)在修復(fù)污染水體重金屬中的用途。本發(fā)明還提供了如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)協(xié)同生物質(zhì)在修復(fù)污染水體重金屬中的用途。本發(fā)明中，所述生物質(zhì)優(yōu)選秸稈粉，進(jìn)一步優(yōu)選玉米秸稈和苜蓿干草的混合物，所述玉米秸稈和苜蓿干草的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1。通過將所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)協(xié)同生物質(zhì)用于鎘污染水體中，培養(yǎng)第5天時，鎘離子的去除率可達(dá)到62％以上。與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：本發(fā)明提供的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)能夠降解重金屬污染水體中的鎘離子，其協(xié)同生物質(zhì)在溶液體系中培養(yǎng)5天時可使鎘離子的去除率達(dá)到62％以上。附圖說明圖1是本發(fā)明的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)對鎘離子模擬體系中可溶性鎘離子的去除效率；圖2是本發(fā)明的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)協(xié)同生物質(zhì)對鎘離子模擬體系中可溶性鎘離子的去除效率。下面對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。具體實施方式為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。實施例1淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)的獲得和鑒定1、土樣來源土樣采自湖南省桂陽縣某廢棄礦。2、試劑與儀器2.1試劑氯化鎘(cdcl2·2.5h2o)、氯化鈉，分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯浸粉、葡萄糖、蛋白胨，分析純，購自北京奧博星(aobox)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。2.2儀器臺式冷凍恒溫?fù)u床thz-c-1，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；臺式高速微量(冷凍型)離心機d3024r，美國賽洛捷克(scilogex)公司；石墨爐原子吸收儀aa-6800，日本shimadzu公司。3、方法3.1菌種的篩選3.1.1真菌培養(yǎng)基配方馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(pdb)：馬鈴薯浸粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨10g，氯化鈉5g；將各組分溶于1升蒸餾水中滅菌備用；馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(pda)：馬鈴薯浸粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉6克；將各組分溶于1升蒸餾水中滅菌倒平板；3.1.2篩選方法(1)取10g土樣至90ml無菌水中，加入適量玻璃珠，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)20min，制成土壤懸液，取出后靜置；(2)取5ml土壤懸液上清加入到含2mmol/lcdcl2的pdb培養(yǎng)基中，同樣條件下分別振蕩培養(yǎng)24h和72h；(3)取3ml步驟(2)所得菌懸液于新鮮滅菌的含4mmol/lcdcl2的pdb培養(yǎng)基中，同樣條件下分別振蕩培養(yǎng)24h和72h；(4)取3ml步驟(3)所得菌懸液于新鮮滅菌的含10mmol/lcdcl2pdb培養(yǎng)基中，同樣條件下分別振蕩培養(yǎng)24h和72h；(5)將步驟(4)所得菌懸液梯度稀釋10倍、100倍和1000倍，分別涂布于含不同濃度cdcl2(4mmol/l、6mmol/l、8mmol/l、10mmol/l)的pda固體平板培養(yǎng)基上，并置于28℃的恒溫箱中倒置培養(yǎng)；(6)觀察平板上真菌菌落生長狀況，純化單菌落，轉(zhuǎn)接pda斜面培養(yǎng)基保藏。3.2菌種分子生物學(xué)鑒定(1)取出3.1.2保藏的真菌斜面，用接種環(huán)取0.5cm×0.5cm左右大小菌絲塊接入新鮮滅菌的pdb培養(yǎng)基(250ml錐形瓶盛裝50ml培養(yǎng)液)，于28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)48h；(3)按照全式金dna提取試劑盒中的說明書操作，提取真菌總dna；(4)真菌dna按照表1-2的反應(yīng)條件(引物見表1-1)擴增后送上海生物工程有限公司測序；(5)完成序列在ncbi數(shù)據(jù)庫比對鑒定，并通過mega6分析軟件建立菌種發(fā)育進(jìn)化樹，最終確定菌種的分類地位。表1-1表1-2篩選目標(biāo)真菌的its序列如下：tcccttgcagcagctgttctgccgctcgagcggtgcacaatgtgctctgattgcggcgattacccctccttgcacagtcaaaattttctgtgacttgtcgccagctttgtgtggggctcattaccccgccacgctgcacaggtgtctcatttgcccctcaacaccaaaaattcgcacggagcaccaacagcatgctgacgcgtgagataacaggaagccgccgagctcggcaagggttccttcaagtacgcgtgggtccttgacaagctcaaggccgagcgtgagcgtggtatcaccatcgacattgccctctggaagttcgagactcccaagtactatgtcaccgtcattggtacgtcgactcgcgcgagactggtcgcaatttccacgtcgctaacgtgcttgaacagacgctcccggccaccgtgacttcatcaagaacatgatcactggtacctcccaggctgactgcgctatcctcattatcgctgccggcactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctgctcgcctacaccctcggtgttaagcagctcatcgtcgctatcaacaagatggacaccaccaagtggtctgaggcccgtttccaggagatcatcaaggagacctccaacttcatcaagaaggtcggctacaaccccaagaccgtcgctttcgtccccatctctggtttccacggcgacaacatgctttccccctccaccaactgcccctggtacaagggctgggagaaggagaccaaggctggcaagtccaccggcaagaccctccttgaggccatcgactccatcgagccccccaagcgccccagcgacaagcccctccgccttccccttcaggatgtgtacaagatcggcggtatcggcacagtccctgtcggccgtatcgagactggtgtcatcaagcccggcatggtcgtgaccttcgctccttccaacgtcaccaccgaagtcaagtccgttgagatgcaccacgagcagctctccgagggtgtccccggtgacaacgtcggcttcaacgtcaagaacgtctccgtcaaggagatccgtcgtggcaacgtcgccggtgactccaagaacgacccccctctgggtgccgcttctttcgatgcccaggtcatcgtcctcaaccaccccggccagg將測得的菌株序列通過blast程序與genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的its序列進(jìn)行同源性比對分析，查找相同或相似的核苷酸序列，然后利用序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件mega6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在mega軟件中，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法使用neighbor-joining法，堿基替代模型選擇kimura雙參數(shù)模型，進(jìn)化樹可靠性檢驗選用自展檢驗(bootstrap)1000次重復(fù)檢測，dna序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦于相同的加權(quán)值。目標(biāo)真菌經(jīng)分析鑒定為淡紫紫胞菌(purpureocilliumlilacinum)。實施例2淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)對鎘的去除效率1.1試驗方法(1)菌種制備：取出保藏的菌種斜面，用接種環(huán)取0.5cm×0.5cm大小菌絲塊接入到含10mmol/lcd2+的50ml滅菌pdb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時；(2)4mmol/lcd2+溶液制備：稱取182.8mg的cdcl2·2.5h2o于250ml三角瓶中，加入100ml無菌水中，超聲中充分溶解；(3)含鎘廢水生物去除模擬體系構(gòu)建：將培養(yǎng)24h的菌液按照千分之一的濃度加入4mmol/lcd2+水體中，于28℃、200r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。分別檢測1d、2d、3d、4d、5d時cd2+含量，每個時間點做三個重復(fù)，并設(shè)置不加菌液的空白對照；(4)水體中鎘離子待測樣制備：觀察水體中菌株生長狀態(tài)，于每個時間點取出對應(yīng)的三個重復(fù)轉(zhuǎn)移至100ml離心管(離心管提前稱重)，10000r/min離心10min，上清液收集用于鎘離子的檢測。1.2去除效率的測定利用上述步驟1.1-(3)中制備的待測樣，測量五個時間點所對應(yīng)水體的cd2+含量。測量儀器為石墨爐原子吸收儀aa-6800，結(jié)果取三個重復(fù)的平均值，分別以時間點和cd2+濃度為橫縱坐標(biāo)繪制鎘離子濃度變化曲線，評價該菌株對cd2+的去除效果，其結(jié)果具體如表2和圖1所示。表2時間(day)對照(ppm)處理(ppm)去除率(％)14.05353.424315.5224.08553.076524.7034.07252.757532.2944.07052.743532.6054.08252.654234.99通過表2可以看出，利用鎘離子模擬體系，實施例1中得到的淡紫紫孢菌菌株在處理1天后，鎘離子濃度由原來的4.0535ppm變?yōu)?.4243ppm，去除率為15.52％，處理3天后，鎘離子濃度由4.0725ppm變?yōu)?.7575ppm，去除率為32.29％，處理5天后，鎘離子濃度由4.0825變?yōu)?.6542ppm，去除率達(dá)到34.99％，證明該淡紫紫孢菌菌株可以用于含鎘離子的廢水處理，并在5天內(nèi)具有近35％以上的去除率。實施例3淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)與生物質(zhì)的鎘協(xié)同去除效率1.1試驗方法(1)菌種制備：取出保藏的菌種斜面，用接種環(huán)取0.5cm×0.5cm大小菌絲塊接入到含10mmol/lcd2+的50ml滅菌pdb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時；(2)4mmol/lcd2+溶液制備：稱取182.8mg的cdcl2·2.5h2o于250ml三角瓶中，加入100ml無菌水中，超聲中充分溶解；(3)含鎘廢水生物去除模擬體系構(gòu)建：以cdcl2·2.5h2o配制4mmol/lcd2+溶液(無菌水)，將培養(yǎng)24小時的菌液按照千分之一的濃度加入4mmol/lcd2+水體中，同時按照反應(yīng)體系質(zhì)量比的5％加入秸稈粉(由玉米秸稈和苜蓿干草按質(zhì)量比1:1混合)，于28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)。分別檢測1d、2d、3d、4d、5d時cd2+含量，每個時間點做三個重復(fù)，并設(shè)置不加菌液的空白對照；(4)水體中鎘離子待測樣制備：觀察水體中菌株生長狀態(tài)，于每個時間點取出對應(yīng)的三個重復(fù)轉(zhuǎn)移至100ml離心管(離心管提前稱重)，10000r/min離心10min，上清液收集用于鎘離子的檢測。1.2去除效率的測定利用上述步驟1.1-(3)中制備的待測樣，測量五個時間點所對應(yīng)水體的cd2+含量。測量儀器為石墨爐原子吸收儀aa-6800，結(jié)果取三個重復(fù)的平均值，分別以時間點和cd2+濃度為橫縱坐標(biāo)繪制鎘離子濃度變化曲線，評價該菌株對cd2+的去除效果，其結(jié)果具體如表3和圖2所示。表3時間(day)對照(ppm)處理(ppm)去除率(％)14.05353.092423.7124.08552.968127.3534.07252.749332.4944.07051.861854.2654.08251.517162.84通過表3可以看出，利用重金屬模擬體系，實施例1中得到的淡紫紫孢菌菌株協(xié)同秸稈粉在處理1天后，鎘離子濃度由原來的4.0535ppm變?yōu)?.0924ppm，去除率為23.71％，處理3天后，鎘離子濃度由原來的4.0855ppm變?yōu)?.7493ppm，去除率為32.49％，處理5天后，鎘離子濃度由原來的4.0825ppm變?yōu)?.5171ppm，去除率達(dá)到62.84％。由上述結(jié)果還可以看出，對比實施例2單獨采用淡紫紫孢菌菌株的情況，該淡紫紫孢菌菌株與生物質(zhì)協(xié)同作用可將鎘去除率提高至62％以上，說明其與生物質(zhì)二者之間具有協(xié)同增效作用，可以獲得更好的鎘去除效果。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁12