芽孢桿菌屬物種的絲氨酸蛋白酶的制作方法

本公開涉及從芽孢桿菌屬的物種(bacillusspp.)克隆的絲氨酸蛋白酶及其變體。含有絲氨酸蛋白酶的組合物適合用于清潔織物和硬表面，以及用于各種工業(yè)應(yīng)用。絲氨酸蛋白酶是具有啟動(dòng)蛋白質(zhì)肽鍵水解的活性位點(diǎn)絲氨酸的酶(ec編號(hào)3.4.21)?；谒鼈兊慕Y(jié)構(gòu)，存在兩大類絲氨酸蛋白酶：胰凝乳蛋白酶樣(胰蛋白酶樣)和枯草桿菌蛋白酶樣。原型枯草桿菌蛋白酶(ec編號(hào)3.4.21.62)最初從枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)獲得。枯草桿菌蛋白酶及其同源物是merops分類方案的s8肽酶家族的成員。家族s8的成員在其氨基酸序列中具有順序?yàn)閍sp、his和ser的催化三聯(lián)體。盡管在工業(yè)酶領(lǐng)域很久以來就已經(jīng)知道絲氨酸蛋白酶，但是仍然需要適合于特定條件和用途的另外的絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明的組合物和方法涉及從芽孢桿菌屬的物種克隆的重組絲氨酸蛋白酶及其變體。含有絲氨酸蛋白酶的組合物適合用于清潔織物和硬表面，以及用于各種工業(yè)應(yīng)用。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是bspe04637進(jìn)化枝枯草桿菌蛋白酶的重組多肽或其活性片段。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:31)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序1”)。在其他實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:32)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序2”)。在又進(jìn)一步的實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:33)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序3”)。在又另一個(gè)實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:34)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序4”)。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:35)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序5”)。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:36)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序6”)。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpyydxxgh(seqidno:37)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序7”)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的重組多肽或其活性片段。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，條件是所述多肽或其活性片段不包括bad02409或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，重組多肽具有蛋白酶活性或枯草桿菌蛋白酶活性，特別是酪蛋白水解活性。在一些實(shí)施例中，重組多肽在6至12的ph范圍內(nèi)保留其最大蛋白酶活性的至少50％。在一些實(shí)施例中，重組多肽在60℃至80℃的溫度范圍內(nèi)保留其最大蛋白酶活性的至少50％。在一些實(shí)施例中，重組多肽在洗滌劑組合物(包括自動(dòng)餐具洗滌劑和衣物洗滌劑)中具有清潔活性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是包含表面活性劑和上述重組多肽的組合物。在一些實(shí)施例中，表面活性劑選自：非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兼性離子表面活性劑、兩性表面活性劑、半極性非離子表面活性劑及其組合。在一些實(shí)施例中，組合物是洗滌劑組合物，例如衣物洗滌劑、織物軟化洗滌劑、餐具洗滌劑和硬表面清潔洗滌劑。在一些實(shí)施例中，組合物進(jìn)一步包含至少一種鈣離子和/或鋅離子、至少一種穩(wěn)定劑、至少一種漂白劑、磷酸鹽或硼酸鹽。在一些實(shí)施例中，組合物不含磷酸鹽和/或不含硼酸鹽。在一些實(shí)施例中，組合物是顆粒、粉末、固體、棒狀、液體、片劑、凝膠、糊狀或單位劑量組合物。在一些實(shí)施例中，組合物進(jìn)一步包含選自以下的一種或多種另外的酶或酶衍生物：?；D(zhuǎn)移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜膠酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、軟骨素酶、角質(zhì)酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶、透明質(zhì)酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木質(zhì)素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果膠裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠酶、戊聚糖酶、過氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、還原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金屬蛋白酶、另外的絲氨酸蛋白酶及其組合。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是一種清潔的方法，該方法包括使表面或物品與上文所列組合物接觸。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是用于生產(chǎn)重組多肽的方法，該方法包括用包含編碼上述重組多肽的多核苷酸的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。附圖簡(jiǎn)述圖1提供了用于表達(dá)bspe04637蛋白酶的質(zhì)粒圖。圖2提供了bspe04637蛋白酶對(duì)dmc底物的蛋白酶活性的圖。圖3a至3f提供了包含bspe04637和swt183_1430046的枯草桿菌蛋白酶的muscle多重序列比對(duì)。圖4提供了包括bspe04637和swt183_1430046蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶的系統(tǒng)發(fā)生樹。圖5示出了在枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝中發(fā)現(xiàn)的序列基序變化的潛在結(jié)構(gòu)后果。描述了與來自芽孢桿菌屬物種的重組絲氨酸蛋白酶有關(guān)的組合物和方法。組合物和方法部分地基于如下觀察：在堿性反應(yīng)條件和升高的溫度下重組bspe04637和swt_1430046等在表面活性劑存在下具有蛋白酶活性。bspe04637和swt_1430046的這些特性使這些蛋白酶非常適合用于清潔織物和硬表面，以及用于紡織品、皮革和羽毛處理。新的蛋白酶也非常適合包含在用于蛋白質(zhì)降解的組合物中，包括但不限于衣物和餐具洗滌劑。在詳細(xì)地描述本發(fā)明的組合物和方法之前，為了清楚起見定義以下術(shù)語(yǔ)。未定義的術(shù)語(yǔ)和縮寫應(yīng)當(dāng)符合本領(lǐng)域中所使用的常規(guī)含義。除非本文另有定義，否則本文所使用的全部科技術(shù)語(yǔ)都具有如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。除非另有說明，本公開的實(shí)踐涉及通常用于分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程和微生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)。盡管與本文所述方法和材料類似或等同的任何方法和材料可用于本公開的實(shí)踐，但是本文描述了一些合適的方法和材料。通過參考作為一個(gè)整體的說明書，更全面地描述下面即將定義的術(shù)語(yǔ)。除非上下文另有明確指示，如本文所使用的，單數(shù)“一個(gè)/一種”(a/an)和“該/所述”(the)包括復(fù)數(shù)。除非另有說明，否則核酸序列從左至右以5'至3'取向?qū)懗?；并且氨基酸序列從左至右以氨基至羧基取向?qū)懗?。?yīng)當(dāng)理解的是，在沒有相反的指示的情況下，本公開不限于本文所述的具體方法、方案和試劑。在本說明書全文中給出的每一最大數(shù)值限度旨在包括每一較低數(shù)值限度，如同此類較低數(shù)值限度在本文中明確寫出一樣。在本說明書全文中給出的每一最小數(shù)值限度將包括每一較高數(shù)值限度，如同此類較高數(shù)值限度在本文中明確寫出一樣。在本說明書全文中給出的每一數(shù)值范圍將包括落入此類較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一較窄數(shù)值范圍，如同此類較窄數(shù)值范圍在本文中全部明確寫出一樣。如本文使用的，關(guān)于數(shù)值，術(shù)語(yǔ)“約”是指數(shù)值的+/-0.5的范圍，除非術(shù)語(yǔ)在上下文中另有具體定義。例如，短語(yǔ)“約6的ph值”是指ph值為從5.5至6.5，除非ph值另有具體定義。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”(protease和proteinase)是指具有分解蛋白質(zhì)和肽的能力的酶。蛋白酶具有通過在形成蛋白質(zhì)的肽或多肽鏈中將氨基酸連接在一起的肽鍵的水解進(jìn)行“蛋白水解”的能力。蛋白酶作為蛋白質(zhì)消化酶的這種活性被稱為“蛋白水解活性”。存在許多熟知的程序用于測(cè)量蛋白水解活性。例如，蛋白水解活性可以通過分析各自蛋白酶水解合適底物的能力的比較試驗(yàn)來確定?？捎糜诜治龅鞍酌富虻鞍姿饣钚缘氖纠缘孜锇ǖ幌抻诙谆业鞍?西格瑪公司(sigma)c-9801)、牛膠原(西格瑪公司(sigma)c-9879)、牛彈性蛋白(西格瑪公司(sigma)e-1625)和牛角蛋白(icn生物醫(yī)學(xué)公司902111)。使用這些底物的比色測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的(參見例如wo99/34011和美國(guó)專利號(hào)6,376,450)。pna肽基測(cè)定(參見例如，德爾瑪(delmar)等人，分析生物化學(xué)(analbiochem)，99:316-320，1979)還可用于確定活性酶濃度。該測(cè)定測(cè)量當(dāng)酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對(duì)硝基苯胺(suc-aapf-pna)時(shí)釋放對(duì)硝基苯胺的速率。在分光光度計(jì)上在410nm下測(cè)量來自水解反應(yīng)的黃色的生成速率并且該速率與活性酶濃度成正比。另外，在280納米(nm)處的吸光度測(cè)量可以用于確定純化蛋白質(zhì)樣品中的總蛋白質(zhì)濃度。底物/蛋白質(zhì)濃度的活性給出了酶比活性。關(guān)于多肽的術(shù)語(yǔ)“變體”是指與指定的野生型、親本或參比多肽不同的多肽，因?yàn)樗ㄒ环N或多種天然存在的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。類似地，關(guān)于多核苷酸，術(shù)語(yǔ)“變體”是指在核苷酸序列中與指定的野生型、親本或參比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、親本或參比多肽或多核苷酸的身份將從上下文中顯而易見。如本文使用的，“芽孢桿菌屬”包括如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的“芽孢桿菌”屬內(nèi)的所有物種，包括但不限于：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽胞桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌(b.halodurans)、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、吉氏芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。據(jù)認(rèn)識(shí)，芽孢桿菌屬繼續(xù)經(jīng)歷分類學(xué)重組。因此，該屬旨在包括已重新分類的物種，包括但不限于：例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)(現(xiàn)在稱為“嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)”)或多粘芽孢桿菌(b.polymyxa)(現(xiàn)在是“多粘類芽孢桿菌(paenibacilluspolymyxa)”)的此類生物體。在脅迫環(huán)境條件下的抗性內(nèi)生孢子的產(chǎn)生被認(rèn)為是芽孢桿菌屬的定義性特性，盡管這個(gè)特征也適用于最近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬(amphibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(anoxybacillus)、短芽孢桿菌屬、線性桿菌屬(filobacillus)、薄壁芽孢桿菌屬(gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌屬(halobacillus)、類芽孢桿菌屬、需鹽芽孢桿菌屬(salibacillus)、耐熱芽孢桿菌屬(thermobacillus)、脲芽胞桿菌屬(ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬(virgibacillus)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“突變”是指對(duì)參比氨基酸或核酸序列進(jìn)行的改變。該術(shù)語(yǔ)旨在涵蓋取代、插入和缺失。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”是指用于將一個(gè)或多個(gè)核酸引入或轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞或組織中的核酸構(gòu)建體。典型地，載體用于將外源dna引入細(xì)胞或組織中。載體包括質(zhì)粒、克隆載體、噬菌體、病毒(例如病毒載體)、粘粒、表達(dá)載體、穿梭載體等。典型地，載體包括復(fù)制起點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和可選擇標(biāo)記。典型地，將載體插入靶細(xì)胞的過程被稱為轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明包括：包含可操作地連接到合適的前序列(例如分泌、信號(hào)肽序列等)的編碼絲氨酸蛋白酶多肽(例如，前體或成熟絲氨酸蛋白酶多肽)的dna序列的載體，該載體能夠在合適的宿主中實(shí)現(xiàn)dna序列的表達(dá)，以及重組多肽鏈的折疊和易位。如本文使用的，在將核酸序列引入細(xì)胞中的上下文中，術(shù)語(yǔ)“引入”是指適合于將核酸序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的任何方法。這種引入方法包括但不限于：原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、電穿孔、綴合和轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)化是指由攝取、任選的基因組摻入和遺傳物質(zhì)(例如dna)的表達(dá)引起的細(xì)胞的遺傳改變。如本文使用的，當(dāng)核酸與另一個(gè)核酸序列一起置于功能關(guān)系時(shí)，該核酸與另一個(gè)核酸序列“可操作地連接”。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接到核苷酸編碼序列。如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被定位以便促進(jìn)編碼序列的翻譯，該核糖體結(jié)合位點(diǎn)可以可操作地連接到編碼序列。典型地，“可操作地連接的”dna序列是連續(xù)的。然而，增強(qiáng)子不需要是連續(xù)的。通過在方便的限制位點(diǎn)處連接來實(shí)現(xiàn)連接。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則可以按照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“基因”是指編碼多肽并且包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域的多核苷酸(例如，dna區(qū)段)。在一些情況下，基因包括個(gè)體編碼區(qū)段(外顯子)之間的間隔序列(內(nèi)含子)。如本文使用的，“重組體”當(dāng)關(guān)于細(xì)胞使用時(shí)，典型地表明細(xì)胞已經(jīng)通過引入外源核酸序列而被修飾，或者細(xì)胞衍生自如此修飾的細(xì)胞。例如，重組細(xì)胞可以包含在天然(非重組)形式的細(xì)胞中不以相同形式存在的基因，或者重組細(xì)胞可以包含已經(jīng)被修飾并且重新引入細(xì)胞中的天然基因(發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞的天然形式中)。重組細(xì)胞可以包含細(xì)胞內(nèi)源的核酸，該核酸已經(jīng)被修飾而不從細(xì)胞中除去該核酸；此類修飾包括通過基因替換、位點(diǎn)特異性突變以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的相關(guān)技術(shù)獲得的那些。重組dna技術(shù)包括用于在體外生產(chǎn)重組dna并且將該重組dna轉(zhuǎn)移到其可以被表達(dá)或傳播的細(xì)胞中從而生產(chǎn)重組多肽的技術(shù)。多核苷酸或核酸的“重組”(recombination和recombining)通常是指裝配或組合兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核苷酸鏈或片段以產(chǎn)生新的多核苷酸或核酸。如果在其天然狀態(tài)下或當(dāng)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法操縱時(shí)，核酸或多核苷酸可以被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以生產(chǎn)多肽或其片段，那么將該核酸或多核苷酸稱為“編碼”該多肽。這樣的核酸的反義鏈也被稱為編碼該序列。術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”和“宿主細(xì)胞”是指對(duì)于包含感興趣的dna序列的表達(dá)載體而言合適的宿主。“蛋白質(zhì)”或“多肽”包含氨基酸殘基的聚合序列。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換地使用。在本公開全文中使用了符合iupac-iub生物化學(xué)術(shù)語(yǔ)聯(lián)合委員會(huì)(jointcommissiononbiochemicalnomenclature，jcbn)而定義的氨基酸的單字母和3字母代碼。單字母x是指二十個(gè)氨基酸中的任一個(gè)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多肽可以由多于一種核苷酸序列編碼。突變可以由親本氨基酸的單個(gè)字母代碼命名，隨后是位置編號(hào)，然后是變體氨基酸的單個(gè)字母代碼。例如，將在位置87處的甘氨酸(g)突變?yōu)榻z氨酸(s)表示為“g087s”或“g87s”。當(dāng)描述修飾時(shí)，位置后面在括號(hào)中列出的氨基酸表示由任何列出的氨基酸在該位置處的取代清單。例如，6(l,i)意指位置6可以被亮氨酸或異亮氨酸取代。有時(shí)，在序列中，將斜線(/)用于定義取代，例如，f/v表示特定位置，在該位置處可以具有苯丙氨酸或纈氨酸。“前序列”或“前肽序列”是指在信號(hào)肽序列與成熟蛋白酶序列之間的、蛋白酶的正確折疊和分泌所必需的氨基酸序列；它們有時(shí)被稱為分子內(nèi)伴侶。前序列或前肽序列的切割導(dǎo)致成熟的活性蛋白酶。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶通常表達(dá)為前酶。術(shù)語(yǔ)“信號(hào)序列”和“信號(hào)肽”是指可以參與蛋白質(zhì)的成熟或前體形式的分泌或定向轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸殘基序列。典型地，信號(hào)序列位于前體或成熟蛋白序列的n-末端。信號(hào)序列可以是內(nèi)源的或外源的。成熟蛋白質(zhì)中一般不存在信號(hào)序列。典型地，在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)后，信號(hào)序列通過信號(hào)肽酶從蛋白質(zhì)切割。術(shù)語(yǔ)“成熟”形式的蛋白質(zhì)、多肽或肽是指沒有信號(hào)肽序列和前肽序列的蛋白質(zhì)、多肽或肽的功能形式。術(shù)語(yǔ)“前體”形式的蛋白質(zhì)或肽是指具有可操作地連接到該蛋白質(zhì)的氨基或羰基末端的原序列的成熟形式的蛋白質(zhì)。前體還可以具有可操作地連接到原序列的氨基末端的“信號(hào)”序列。前體還可以具有涉及翻譯后活性的另外的多肽(例如，從其切割的多肽以留下成熟形式的蛋白質(zhì)或肽)。關(guān)于氨基酸序列或核酸序列，術(shù)語(yǔ)“野生型”表示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“天然存在的”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的任何物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、氨基酸或核酸序列)。相反，術(shù)語(yǔ)“非天然存在”是指在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)的任何物質(zhì)(例如，在實(shí)驗(yàn)室中生產(chǎn)的重組核酸和蛋白質(zhì)序列、或野生型序列的修飾)。如本文使用的，關(guān)于氨基酸殘基位置，“對(duì)應(yīng)于”(correspondingto或correspondsto)或“對(duì)應(yīng)”是指在蛋白質(zhì)或肽中所列舉位置處的氨基酸殘基，或類似于、同源于或等同于蛋白質(zhì)或肽中所列舉殘基的氨基酸殘基。如本文使用的，“對(duì)應(yīng)區(qū)域”通常是指相關(guān)蛋白質(zhì)或參比蛋白質(zhì)中的類似位置。術(shù)語(yǔ)“衍生自”和“獲自”不僅是指由所討論的生物體的菌株生產(chǎn)或可以由其生產(chǎn)的蛋白質(zhì)，而且是指由從此類菌株分離的dna序列編碼并且在含有此類dna序列的宿主生物體中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。另外，該術(shù)語(yǔ)是指由合成的和/或cdna來源的dna序列編碼并且具有所討論的蛋白質(zhì)的鑒定特征的蛋白質(zhì)。舉例來說，“來源于芽孢桿菌屬的蛋白酶”是指具有由芽孢桿菌屬天然生產(chǎn)的蛋白水解活性的那些酶，以及絲氨酸蛋白酶，如由芽孢桿菌屬來源生產(chǎn)但是通過使用遺傳工程技術(shù)由用編碼絲氨酸蛋白酶的核酸轉(zhuǎn)化的其他宿主細(xì)胞生產(chǎn)的那些。在兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語(yǔ)“同一性”是指在兩個(gè)序列中的核酸或氨基酸在比對(duì)最大對(duì)應(yīng)關(guān)系時(shí)相同，如使用以下描述的或本領(lǐng)域已知的序列比較或分析算法測(cè)量的。如本文使用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“pid”是指蛋白質(zhì)序列同一性。百分比同一性可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定。有用的算法包括blast算法(參見阿特休爾(altschul)等人，分子生物學(xué)雜志(jmolbiol)，215:403-410，1990；以及卡林(karlin)和阿特休爾(altschul)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(procnatlacadsciusa)，90:5873-5787，1993)。blast程序使用多個(gè)搜索參數(shù)，其中大部分設(shè)置為默認(rèn)值。ncbiblast算法按照生物相似性找到最相關(guān)的序列，但是不推薦用于少于20個(gè)殘基的查詢序列(阿特休爾(altschul)等人，核酸研究(nucleicacidsres)，25:3389-3402，1997；以及謝弗(schaffer)等人，核酸研究(nucleicacidsres.)29:2994-3005，2001)。核酸序列搜索的示例性默認(rèn)blast參數(shù)包括：相鄰字長(zhǎng)閾值＝11；e值截止值(cutoff)＝10；打分矩陣(scoringmatrix)＝nuc.3.1(匹配＝1，錯(cuò)配＝-3)；空位開放(gapopening)＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默認(rèn)blast參數(shù)包括：字長(zhǎng)大?。?；e值截止值＝10；打分矩陣＝blosum62；空位開放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同殘基的數(shù)值除以“參比”序列的殘基總數(shù)(包括由程序?yàn)樽罴?最大比對(duì)創(chuàng)建的任何空位)來確定。blast算法將“參比”序列稱為“查詢”序列。如本文使用的，“同源蛋白質(zhì)”或“同源蛋白酶”是指在一級(jí)、二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)中具有不同相似性的蛋白質(zhì)。當(dāng)比對(duì)蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)同源性可以是指線性氨基酸序列的相似性。蛋白質(zhì)序列的同源搜索可以使用來自ncbiblast的blastp和psi-blast使用閾值(e值截止值)0.001進(jìn)行。(阿特休爾(altschulsf)、邁德(maddetl)、謝弗(shafferaa)、張(zhangj)、張(zhangz)、米勒(millerw)、李普曼(lipmandj)，空位blast和psiblast：新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序(gappedblastandpsiblastanewgenerationofproteindatabasesearchprograms)，核酸研究(nucleicacidsres)1997年第1組；25(17):3389-402)。使用該信息，可以將蛋白質(zhì)序列分組?？梢允褂冒被嵝蛄袠?gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹?？梢栽诶鐅ectorntiadvance套件的程序中輸入氨基酸序列，并且可以使用鄰接(neighborjoining，(nj))法創(chuàng)建引導(dǎo)樹(斎藤(saitou)和內(nèi)伊(nei)，分子生物學(xué)與進(jìn)化(molbiolevol)，4:406-425，1987)?？梢允褂冕槍?duì)序列距離的木村(kimura)校正并且忽略具有空位的位置來計(jì)算樹結(jié)構(gòu)。程序例如alignx可以在系統(tǒng)發(fā)生樹上顯示的分子名稱之后的括號(hào)內(nèi)顯示計(jì)算的距離值。了解分子之間的同源性可以揭示分子的進(jìn)化歷史以及它們的功能信息；如果新測(cè)序的蛋白質(zhì)與已經(jīng)表征的蛋白質(zhì)同源，則存在新蛋白質(zhì)的生物化學(xué)功能的強(qiáng)烈指示。兩個(gè)實(shí)體之間最基本的關(guān)系是同源性；如果兩個(gè)分子來源于共同的祖先，則它們被稱為是同源的。同源分子或同系物可以分為兩類，旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一個(gè)物種內(nèi)的同系物。旁系同源物在它們的詳細(xì)生物化學(xué)功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物種內(nèi)并且具有非常相似或完全相同功能的同系物。蛋白質(zhì)超家族是可以推斷出共同祖先的蛋白質(zhì)的最大分組(進(jìn)化枝)。通常這個(gè)共同祖先是基于序列比對(duì)和機(jī)械相似性。典型地，超家族包含幾個(gè)在該家族內(nèi)顯示序列相似性的蛋白質(zhì)家族。基于merops蛋白酶分類系統(tǒng)，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)宗族”通常用于蛋白酶超家族。clustalw算法是序列比對(duì)算法的另一個(gè)實(shí)施例(參見湯普森(thompson)等人，核酸研究(nucleicacidsres)，22:4673-4680，1994)。clustalw算法的默認(rèn)參數(shù)包括：空位開放罰分＝10.0；空位延伸罰分＝0.05；蛋白質(zhì)重量矩陣＝blosum系列；dna重量矩陣＝iub；延遲發(fā)散序列％＝40；空位分隔距離＝8；dna轉(zhuǎn)換重量＝0.50；列表親水殘基＝gpsndqekr；使用負(fù)性矩陣＝關(guān)；切換特殊殘基罰分＝開；切換親水罰分＝開；以及切換結(jié)束空位分隔罰分＝關(guān)。在clustal算法中，包括在任一末端發(fā)生的缺失。例如，500個(gè)氨基酸的多肽的任一末端(或多肽內(nèi))具有5個(gè)氨基酸缺失的變體相對(duì)于“參比”多肽具有99％(495/500個(gè)相同殘基×100)的百分比序列同一性。這樣的變體將被與該多肽具有“至少99％的序列同一性”的變體所涵蓋。當(dāng)核酸或多核苷酸至少部分或完全地與其他組分(包括但不限于例如其他蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等)分離時(shí)，該核酸或多核苷酸是“分離的”。類似地，當(dāng)多肽、蛋白質(zhì)或肽至少部分或完全地與其他組分(包括但不限于例如其他蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等)分離時(shí)，該多肽、蛋白質(zhì)或肽是“分離的”。以摩爾計(jì)，在組合物中分離的種類比其他種類更豐富。例如，分離的種類可以包含存在的所有大分子種類的至少約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、或約100％(以摩爾計(jì))。優(yōu)選地，將感興趣的種類純化至基本均一性(即，通過常規(guī)檢測(cè)方法不能在組合物中檢測(cè)到污染物種類)。可以分別使用本領(lǐng)域熟知的許多技術(shù)例如核酸或蛋白質(zhì)樣品的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著通過染色后可視化來確定純度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技術(shù)例如高效液相色譜法(hplc)或類似方法來純化物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“純化的”如應(yīng)用于核酸或多肽時(shí)通常表示基本上不含其他組分的核酸或多肽，如通過本領(lǐng)域熟知的分析技術(shù)確定的(例如，純化的多肽或多核苷酸在電泳凝膠、色譜洗脫液和/或經(jīng)歷密度梯度離心的介質(zhì)中形成離散的帶)。例如，在電泳凝膠中產(chǎn)生基本上一條帶的核酸或多肽是“純化的”。純化的核酸或多肽是至少約50％純的，通常是至少約約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約99.5％、約99.6％、約99.7％、約99.8％或更加純的(例如，以摩爾計(jì)的重量百分比)。在相關(guān)意義上，當(dāng)在應(yīng)用純化或富集技術(shù)之后存在一種分子的濃度的大幅度增加時(shí)，對(duì)于該分子而言組合物被富集了。術(shù)語(yǔ)“富集”是指化合物、多肽、細(xì)胞、核酸、氨基酸或其他特定物質(zhì)或組分以高于起始組合物的相對(duì)或絕對(duì)濃度存在于組合物中。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“功能測(cè)定”是指提供蛋白質(zhì)活性指示的測(cè)定法。在一些實(shí)施例中，該術(shù)語(yǔ)是指其中針對(duì)以其通常的能力發(fā)揮功能的能力來分析蛋白質(zhì)的測(cè)定系統(tǒng)。例如，在蛋白酶的情況下，功能測(cè)定涉及確定蛋白酶水解蛋白質(zhì)底物的有效性。術(shù)語(yǔ)“清潔活性”是指在本公開的蛋白水解、水解、清潔或其他過程期間主要的條件下由絲氨酸蛋白酶多肽或參比蛋白酶實(shí)現(xiàn)的清潔性能。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽或參比蛋白酶的清潔性能可以通過使用用于清潔在物品或表面上的一種或多種不同酶敏感性污漬(例如，由食物、草地、血液、墨汁、奶、油和/或卵蛋白引起的污漬)的各種測(cè)定來確定。變體或參比蛋白酶的清潔性能可以通過使在物品或表面上的污漬經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件并且通過使用各種色譜、分光光度計(jì)或其他定量方法來評(píng)估污漬除去的程度來確定。示例性清潔測(cè)定和方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于在wo99/34011和us6,605,458(兩者通過引用結(jié)合在此)中描述的那些，以及包括在下面所提供的實(shí)施例中的那些清潔測(cè)定和方法。術(shù)語(yǔ)絲氨酸蛋白酶多肽或參比蛋白酶的“清潔有效量”是指在特定清潔組合物中達(dá)到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此類有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，并且基于許多因素，例如所使用的特定蛋白酶、清潔應(yīng)用、清潔組合物的具體組成、以及是否需要液體或干燥(例如，顆粒、片劑、棒狀)組合物等。術(shù)語(yǔ)“清潔輔助材料”是指除了本公開的絲氨酸蛋白酶多肽之外在清潔組合物中包含的任何液體、固體或氣體物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，本公開的清潔組合物包括一種或多種清潔輔助材料。典型地，取決于清潔組合物的具體類型和形式(例如液體、顆粒、粉末、棒狀、糊狀、噴霧、片劑、凝膠、泡沫或其他組合物)來選擇每種清潔輔助材料。優(yōu)選地，每種清潔輔助材料與在組合物中使用的蛋白酶相容。清潔組合物和清潔配制品包括適合于清潔、漂白、消毒和/或滅菌任何物體、物品和/或表面的任何組合物。此類組合物和配制品包括但不限于例如液體和/或固體組合物，包括清潔或洗滌劑組合物(例如液體、片劑、凝膠、棒狀、顆粒和/或固體衣物清潔劑或洗滌劑組合物)和精細(xì)織物洗滌劑組合物；硬表面清潔組合物和配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金屬臺(tái)面和窗戶；地毯清潔劑；爐灶清潔劑；織物清新劑；織物軟化劑；以及紡織品、衣物增效清潔或洗滌劑組合物，衣物添加劑清潔組合物和洗衣預(yù)去污(pre-spotter)清潔組合物；餐具洗滌組合物，包括手洗或手動(dòng)餐具洗滌組合物(例如“手洗”或“手動(dòng)”餐具洗滌劑)和自動(dòng)餐具洗滌組合物(例如“自動(dòng)餐具洗滌劑”)。本發(fā)明還可使用單一劑量單位形式，包括但不限于丸劑、片劑、囊形片(gelca)或其他單一劑量單位例如預(yù)先測(cè)量的粉末或液體。除非另有說明，否則如本文使用的清潔組合物或清潔配制品包括顆?；蚍勰┬问降耐ㄓ玫幕蛑毓赶礈靹貏e是清潔洗滌劑；液體、顆粒、凝膠、固體、片劑、糊劑或單位劑量形式的通用洗滌劑，特別是所謂的重垢液體(hdl)洗滌劑或重垢干燥(hdd)洗滌劑類型；液體精細(xì)織物洗滌劑；手洗或手動(dòng)餐具洗滌劑，包括高泡型的那些；手洗或手動(dòng)餐具洗滌劑、自動(dòng)餐具洗滌劑、或餐具或桌面器具洗滌劑，包括用于家庭和機(jī)構(gòu)使用的各種片劑、粉末、固體、顆粒、液體、凝膠和沖洗助劑類型；液體清潔和消毒劑，包括抗菌手洗類型，清潔棒、漱口水、假牙清潔劑、洗車香波、地毯香波、浴室清潔劑；用于人類和其他動(dòng)物的毛發(fā)香波和/或毛發(fā)染發(fā)劑；沐浴露和泡沫浴和金屬清潔劑；以及清潔助劑，例如漂白添加劑和“去污棒(stain-stick)”或預(yù)處理類型。在一些實(shí)施例中，顆粒組合物是處于“緊密”形式；在一些實(shí)施例中，液體組合物是處于“濃縮”形式。如本文使用的，“織物清潔組合物”包括手洗和機(jī)洗衣物洗滌劑組合物，其包括衣物添加劑組合物和適合用于帶有污漬的織物(例如衣服、亞麻制品和其他紡織材料)的浸泡和/或預(yù)處理的組合物。如本文使用的，“非織物清潔組合物”包括非紡織品(即非織物)表面清潔組合物，包括但不限于例如手洗或手動(dòng)或自動(dòng)餐具洗滌劑組合物、口腔清潔組合物、假牙清潔組合物、隱形眼鏡清潔組合物、傷口清創(chuàng)組合物和個(gè)人清潔組合物。如本文使用的，關(guān)于旨在用于清潔污染或骯臟物體(包括特定織物和/或非織物物體或物品)的洗滌介質(zhì)中的組合物，使用術(shù)語(yǔ)“洗滌劑組合物”或“洗滌劑配制品”。本公開的此類組合物不限于任何特定的洗滌劑組合物或配制品。實(shí)際上，在一些實(shí)施例中，本公開的洗滌劑包含本公開的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽，另外還包含一種或多種表面活性劑、一種或多種轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、助洗劑(例如助洗劑鹽)、漂白劑、漂白活化劑、上藍(lán)劑、熒光染料、結(jié)塊抑制劑、掩蔽劑、酶活化劑、抗氧化劑和/或增溶劑。在一些情況下，助洗劑鹽是硅酸鹽和磷酸鹽的混合物，優(yōu)選具有比磷酸鹽(例如三聚磷酸鈉)更多的硅酸鹽(例如偏硅酸鈉)。本公開的一些組合物，例如但不限于清潔組合物或洗滌劑組合物，不包含任何磷酸鹽(例如磷酸鹽或磷酸鹽助洗劑)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“漂白”是指處理材料(例如織物、衣物、紙漿等)或表面持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間和/或在適當(dāng)?shù)膒h和/或溫度條件下處理材料(例如織物、衣物、紙漿等)或表面以實(shí)現(xiàn)該材料的增白(即變白)和/或清潔。適合于漂白的化學(xué)品的實(shí)施例包括但不限于例如clo2、h2o2、過酸、no2等。如本文使用的，蛋白酶(例如，本公開的絲氨酸蛋白酶多肽)的“洗滌性能”是指與不添加絲氨酸蛋白酶多肽至組合物的洗滌劑相比，絲氨酸蛋白酶多肽對(duì)洗滌提供另外的清潔性能的貢獻(xiàn)。在相關(guān)洗滌條件下比較洗滌性能。在一些測(cè)試系統(tǒng)中，其他相關(guān)因素，例如洗滌劑組合物、泡沫濃度(sudconcentration)、水硬度、洗滌力學(xué)、時(shí)間、ph和/或溫度能按以下這樣的方式進(jìn)行控制：模仿在某些細(xì)分市場(chǎng)(例如手洗或手動(dòng)餐具洗滌、自動(dòng)餐具洗滌、餐具清潔、桌面器具清潔、織物清潔等)中對(duì)于家庭應(yīng)用典型的一種或多種條件。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“相關(guān)洗滌條件”表示在手洗餐具洗滌、自動(dòng)餐具洗滌或衣物洗滌劑細(xì)分市場(chǎng)中實(shí)際用于家庭中的條件，特別是洗滌溫度、時(shí)間、洗滌力學(xué)、泡沫濃度、洗滌劑類型和水硬度。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“消毒”是指從表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或殺死微生物。本公開并不旨在限于任何特定表面、物品或待除去的一種或多種污染物或微生物。本文清潔組合物的“緊密”形式最好通過密度來反映，并且就組合物而言通過無機(jī)填料鹽的量來反映。無機(jī)填料鹽是處于粉末形式的洗滌劑組合物的常規(guī)成分。在常規(guī)洗滌劑組合物中，填料鹽以相當(dāng)大的量存在，典型地為總組合物的約17％至約35％(以重量計(jì))。相比之下，在緊密的組合物中，填料鹽以不超過總組合物的約15％的量存在。在一些實(shí)施例中，填料鹽以不超過組合物(以重量計(jì))的約10％、或更優(yōu)選地約5％的量存在。在一些實(shí)施例中，無機(jī)填料鹽選自硫酸鹽和氯化物的堿鹽和堿土金屬鹽。在一些實(shí)施例中，填料鹽是硫酸鈉。本公開提供了新的絲氨酸蛋白酶。本公開的絲氨酸蛋白酶多肽包括分離的、重組的、基本上純的、或非天然存在的多肽。在一些實(shí)施例中，多肽可用于清潔應(yīng)用中，并且可以并入可用于清潔對(duì)其有需要的物品或表面的方法中的清潔組合物中?？莶輻U菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝的特征在于在位置n56之后的2個(gè)氨基酸殘基插入，其中所述氨基酸位置通過與枯草桿菌蛋白酶bpn'的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)來編號(hào)。該插入發(fā)生在連接形成特征催化三聯(lián)體的一部分的催化性天冬氨酸(d32)和催化性組氨酸(h66)的殘基的跨度中，其中所述氨基酸位置通過與枯草桿菌蛋白酶bspe04637的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)來編號(hào)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是bspe04637進(jìn)化枝枯草桿菌蛋白酶的重組多肽或其活性片段。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:31)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序1”)。在其他實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:32)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序2”)。在又進(jìn)一步的實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:33)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序3”)。在又另一個(gè)實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:34)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序4”)。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:35)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序5”)。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:36)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序6”)。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpyydxxgh(seqidno:37)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸(“基序7”)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝，條件是枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝不包含bad02409或jp2003325186-0001枯草桿菌蛋白酶。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是bspe04637進(jìn)化枝枯草桿菌蛋白酶的重組多肽或其活性片段，條件是所述重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:31)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸，條件是所述枯草桿菌蛋白酶和/或重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在其他實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:32)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸，條件是所述枯草桿菌蛋白酶和/或重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在又進(jìn)一步的實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:33)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸，條件是所述枯草桿菌蛋白酶和/或重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在又另一個(gè)實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:34)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸，條件是所述枯草桿菌蛋白酶和/或重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:35)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸，條件是所述枯草桿菌蛋白酶和/或重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:36)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸，條件是所述枯草桿菌蛋白酶和/或重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝包括含有dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpyydxxgh(seqidno:37)基序的枯草桿菌蛋白酶或重組多肽或其活性片段，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸，條件是所述枯草桿菌蛋白酶和/或重組多肽或其活性片段不包含bad02409或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽是與示例的多肽具有特定程度的氨基酸序列同源性的多肽，例如與選自由seqidno:3、6和9組成的組的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的多肽。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，條件是所述多肽或其活性片段不包括bad02409、wp_026690432、adc50469、ern55058、wp_022626565、wp_026475840、wp_027963976、wp_012957833或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，條件是所述多肽或其活性片段不包括bad02409、wp_026690432、adc50469、ern55058、wp_022626565、wp_026475840、wp_027963976、wp_012957833、wp_035661169、wp_047973355或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，條件是所述多肽或其活性片段不包括bad02409、wp_026690432、adc50469、ern55058、wp_022626565或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，條件是所述多肽或其活性片段不包括bad02409、wp_026690432、adc50469、ern55058、wp_022626565、wp_035661169、wp_047973355或jp2003325186-0001。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，重組多肽或其活性片段包含與seqidno:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，條件是所述多肽或其活性片段不包括bad02409或jp2003325186-0001。如本文所述，同源性可以通過氨基酸序列比對(duì)例如，使用程序例如blast、align、或clustal來確定。在一些實(shí)施例中，該多肽是分離的、重組的、基本上純的或非天然存在的酶，該酶具有蛋白酶活性，例如枯草桿菌蛋白酶活性或酪蛋白水解活性(例如，二甲基酪蛋白水解活性)。還提供了本發(fā)明的多肽酶，該多肽酶具有蛋白酶活性，例如堿性蛋白酶活性，所述酶包括與seqidno:3、6或9的氨基酸序列相差不超過50個(gè)、不超過40個(gè)、不超過30個(gè)、不超過25個(gè)、不超過20個(gè)、不超過15個(gè)、不超過10個(gè)、不超過9個(gè)、不超過8個(gè)、不超過7個(gè)、不超過6個(gè)、不超過5個(gè)、不超過4個(gè)、不超過3個(gè)、不超過2個(gè)、或不超過1個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列(當(dāng)使用任何先前描述的比對(duì)方法進(jìn)行比對(duì)時(shí))。如上文所述，本發(fā)明的變體酶多肽具有酶活性(例如，蛋白酶活性)并且因此可用于清潔應(yīng)用中，該清潔應(yīng)用包括但不限于用于清潔餐具物品、桌面器具物品、織物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墻、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。以下描述了包括本發(fā)明的一種或多種變體絲氨酸蛋白酶多肽的示例性清潔組合物。本發(fā)明的酶多肽的酶活性(例如，蛋白酶活性)可以容易地用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的程序來確定。下面提供的實(shí)施例描述用于評(píng)估酶的活性和清潔性能的方法。可以容易地使用本領(lǐng)域中熟知的程序和/或通過使用在實(shí)施例中列出的程序來確定本發(fā)明的多肽酶在除去污漬(例如，蛋白質(zhì)污漬例如血液/奶/墨汁或蛋黃)、清潔硬表面或清潔衣物、餐具或一種或多種桌面器具物品方面的性能。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽可以在寬范圍的ph條件內(nèi)具有蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽對(duì)作為底物的二甲基酪蛋白具有蛋白酶活性，如在下面的實(shí)施例中顯示的。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽在從約4.0至約12.0的ph處具有蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽在從約6.0至約12.0的ph處具有蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽在從約6.0至約12.0或從約7.0至約12.0的ph處具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽在高于6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0或11.5的ph處具有蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽在低于12.0、11.5、11.0、10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、或6.5的ph處具有蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在從約10℃至約90℃或從約30℃至約80℃的溫度范圍內(nèi)具有蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在從約55℃至約75℃的溫度范圍內(nèi)具有蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽在從約55℃至約75℃的溫度下具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大蛋白酶活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶在高于50℃、55℃、60℃、65℃或70℃的溫度下具有活性。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶在低于75℃、80℃、70℃、65℃、60℃或55℃的溫度下具有活性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在脅迫條件下在50℃20分鐘后具有至少60％的活性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在脅迫條件下在60℃下20分鐘后具有至少20％的活性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在脅迫條件下在75℃下20分鐘后具有至少15％的活性。脅迫條件可以是例如在實(shí)施例中所示的那些條件。在一些實(shí)施例中，脅迫條件為las/edta測(cè)定、tris/edta測(cè)定或omohdl測(cè)定。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在清潔組合物中顯示清潔性能。清潔組合物通常包括對(duì)酶的穩(wěn)定性和性能有害的成分，這些有害的成分使清潔組合物成為酶例如絲氨酸蛋白酶保留功能的惡劣環(huán)境。因此，將酶置于清潔組合物中并且期望酶功能(例如絲氨酸蛋白酶活性，例如通過清潔性能顯示)不是微不足道的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在自動(dòng)餐具洗滌(adw)洗滌劑組合物中顯示清潔性能。在一些實(shí)施例中，adw洗滌劑組合物中的清潔性能包括清潔蛋黃污漬。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在衣物洗滌劑組合物中顯示清潔性能。在一些實(shí)施例中，在衣物洗滌劑組合物中的清潔性能包括清潔血液/奶/墨汁污漬。在每種清潔組合物中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽顯示具有或不具有漂白組分的清潔性能。可以使本發(fā)明的多肽經(jīng)歷各種改變，例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失和/或取代(保守或非保守的)，包括此類改變基本上不改變多肽的酶活性的情況。類似地，本發(fā)明的核酸也可以經(jīng)歷各種變化，例如在一個(gè)或多個(gè)密碼子中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的一個(gè)或多個(gè)取代，這樣使得特定的密碼子編碼相同或不同的氨基酸，導(dǎo)致沉默變異(例如，當(dāng)編碼的氨基酸不被核苷酸突變改變時(shí))或非沉默變異、序列中一個(gè)或多個(gè)核酸(或密碼子)的一個(gè)或多個(gè)缺失、序列中一個(gè)或多個(gè)核酸(或密碼子)的一個(gè)或多個(gè)添加或插入、和/或序列中一個(gè)或多個(gè)核酸(或密碼子)的一個(gè)或多個(gè)截短的切割。與由原始核酸序列編碼的多肽酶相比，核酸序列中的許多這樣的變化本質(zhì)上可能不會(huì)改變所得的編碼的多肽酶的酶活性。還可以對(duì)本發(fā)明的核酸序列進(jìn)行修飾以便包括一個(gè)或多個(gè)密碼子，這種或這些密碼子在一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)(例如，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng))中提供了最佳表達(dá)，同時(shí)，若希望，所述一個(gè)或多個(gè)密碼子仍編碼一個(gè)或多個(gè)相同的氨基酸。本發(fā)明提供分離的、非天然存在的或重組的核酸，其可統(tǒng)稱為編碼本發(fā)明多肽的“本發(fā)明的核酸”或“本發(fā)明的多核苷酸”。本發(fā)明的核酸，包括下面描述的全部，可用于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)(例如，表達(dá))，典型地通過包含編碼感興趣的多肽或其片段的序列的質(zhì)粒表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。如上所討論，多肽包括具有酶活性(例如，蛋白水解活性)的絲氨酸蛋白酶多肽，該多肽可用于清潔應(yīng)用和用于清潔需要清潔的物品或表面(例如物品的表面)的清潔組合物中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸是與所示例的多核苷酸具有特定程度的核酸同源性的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，多核苷酸具有與seqidno:1、4或7具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸同一性的核酸序列。在一些實(shí)施例中，多核苷酸包含選自由seqidno:1、4和7組成的組的核酸序列。在一些實(shí)施例中，多核苷酸具有編碼如下多肽或其活性片段的核酸序列，該多肽或其活性片段與選自由seqidno:3、6和9組成的組的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施例中，多核苷酸具有編碼具有seqidno:3、6或9的多肽或其活性片段的核酸序列。在其他實(shí)施例中，多核苷酸還可以具有與選自由seqidno:1、4和7組成的組的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。如本文所述，同源性可以通過氨基酸序列比對(duì)例如，使用程序例如blast、align、或clustal來確定。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供分離的、重組的、基本上純的、合成衍生的或非天然存在的核酸，該核酸包含編碼在上文標(biāo)題為“本發(fā)明的多肽”的部分和本文的其他地方中描述的本發(fā)明的任何多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了分離的、重組的、基本上純的、合成衍生的或非天然存在的核酸，該核酸包含編碼上文和本文其他地方所描述的本發(fā)明的任何多肽中的兩個(gè)或更多個(gè)的組合的核苷酸序列。本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的核酸，其中所述絲氨酸蛋白酶多肽是具有蛋白水解活性的成熟形式。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶用同源前肽序列重組表達(dá)。在其他實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶用異源前肽序列(例如gg36前肽序列)重組表達(dá)。本發(fā)明的核酸可以通過使用任何合適的合成、操作和/或分離技術(shù)或其組合來產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)核酸合成技術(shù)，例如固相合成技術(shù)來生產(chǎn)。在這樣的技術(shù)中，典型地合成高達(dá)50個(gè)或更多個(gè)核苷酸堿基的片段，然后連接(例如通過酶或化學(xué)連接方法)以基本上形成任何希望的連續(xù)核酸序列。本發(fā)明的核酸的合成還可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來促進(jìn)，包括但不限于使用經(jīng)典的亞磷酰胺方法的化學(xué)合成(參見例如博卡吉(beaucage)等人，四面體快報(bào)(tetrahedronletters)22:1859-69[1981])；或馬瑟斯(matthes)等人描述的方法(參見馬瑟斯(matthes)等人，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志(emboj.)3:801-805[1984])，如典型地在自動(dòng)合成方法中所實(shí)踐的。本發(fā)明的核酸還可以通過使用自動(dòng)dna合成儀來產(chǎn)生。可以從各種商業(yè)來源訂購(gòu)定制的核酸(例如，米德蘭認(rèn)證試劑公司(themidlandcertifiedreagentcompany)、大美國(guó)基因公司(greatamericangenecompany)、操縱子技術(shù)公司(operontechnologiesinc.)和dna2.0)。用于合成核酸和相關(guān)原理的其他技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如，板倉(cāng)(itakura)等人，生物化學(xué)年鑒(ann.rev.biochem.)53:323[1984]；和板倉(cāng)(itakura)等人，科學(xué)(science)198:1056[1984])。如上所述，可用于核酸修飾的重組dna技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。例如，技術(shù)例如限制性內(nèi)切核酸酶消化、連接、逆轉(zhuǎn)錄和cdna生產(chǎn)以及聚合酶鏈反應(yīng)(例如pcr)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和容易使用的。本發(fā)明的核苷酸還可以通過使用一個(gè)或多個(gè)可以與其雜交的寡核苷酸探針或編碼本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸蛋白酶多肽的pcr-擴(kuò)增多核苷酸來篩選cdna文庫(kù)而獲得。用于篩選和分離cdna克隆和pcr擴(kuò)增程序的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且描述于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中。本發(fā)明的一些核酸可以通過例如已知的誘變程序(例如，定點(diǎn)誘變、位點(diǎn)飽和誘變和體外重組)改變天然存在的多核苷酸主鏈(例如，編碼酶或親本蛋白酶的多核苷酸主鏈)來獲得。適合于產(chǎn)生編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的本發(fā)明的修飾多核苷酸的多種方法是本領(lǐng)域已知的，這些方法包括但不限于例如位點(diǎn)飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、缺失誘變、隨機(jī)誘變、定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化、以及各種其他重組方法。本發(fā)明提供了包含本文所述的本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多核苷酸的載體(例如，編碼本文所述的本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸)，包含本發(fā)明的至少一種核酸或多核苷酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒，包含本發(fā)明的至少一種核酸或多核苷酸的分離的、基本上純的或重組的dna構(gòu)建體，包含本發(fā)明的至少一種多核苷酸的分離的或重組的細(xì)胞，以及包含一種或多種這樣的載體、核酸、表達(dá)載體、表達(dá)盒、dna構(gòu)建體、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或其任何組合或混合物的組合物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含具有本發(fā)明的至少一個(gè)核酸或多核苷酸的本發(fā)明的至少一種載體(例如表達(dá)載體或dna構(gòu)建體)的重組細(xì)胞。一些這樣的重組細(xì)胞使用這樣的至少一種載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，盡管其他方法在本領(lǐng)域中是可獲得且已知的。這樣的細(xì)胞典型地稱為宿主細(xì)胞。一些這樣的細(xì)胞包含細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如枯草芽孢桿菌細(xì)胞。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的重組細(xì)胞(例如，重組宿主細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸或多核苷酸的載體。在一些實(shí)施例中，載體是一種表達(dá)載體或表達(dá)盒，其中編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的本發(fā)明的多核苷酸序列可操作地連接到有效基因表達(dá)所需的一個(gè)或另外的核酸區(qū)段(例如與編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子)。載體可以包括轉(zhuǎn)錄終止子和/或能夠通過在含有抗菌劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒感染的宿主細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)維持的選擇基因，例如抗生素抗性基因。表達(dá)載體可以衍生自質(zhì)?；虿《綿na，或在可替代實(shí)施例中，含有兩者的元件。示例性載體包括但不限于pc194、pjh101、pe194、php13(參見哈伍德(harwood)和卡廷(cutting)[編輯]，第3章，用于芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法(molecularbiologicalmethodsforbacillus)，約翰威利父子公司(johnwiley&sons)[1990]；枯草芽孢桿菌的適合的復(fù)制質(zhì)粒包括第92頁(yè)列出的那些)。還參見，佩雷戈(perego)，在枯草芽孢桿菌中用于遺傳操作的整合載體(integrationalvectorsforgeneticmanipulationsinbacillussubtilis)，在：sonenshein等人，[編輯]枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌：生物化學(xué)、生理學(xué)和分子遺傳學(xué)，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(americansocietyformicrobiology)，華盛頓特區(qū)[1993]，pp.615-624)和p2jm103bbi中。為了在細(xì)胞中表達(dá)和生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)(例如，絲氨酸蛋白酶多肽)，包含編碼絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸的至少一個(gè)拷貝(并且在一些情況下包含多個(gè)拷貝)的至少一種表達(dá)載體在適合于絲氨酸蛋白酶表達(dá)的條件下被轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，將編碼絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列(以及在載體中包含的其他序列)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，然而在其他實(shí)施例中，包含編碼絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列的質(zhì)粒載體在細(xì)胞內(nèi)保持為自主的染色體外元件。本發(fā)明提供染色體外核酸元件以及整合到宿主細(xì)胞基因組中的進(jìn)入的核苷酸序列。本文描述的載體可用于生產(chǎn)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽。在一些實(shí)施例中，編碼絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸構(gòu)建體存在于能夠?qū)⒕幋a絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸整合并且任選地?cái)U(kuò)增入宿主染色體中的整合載體上。整合位點(diǎn)的實(shí)施例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一些實(shí)施例中，編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄通過啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)，該啟動(dòng)子是所選前體蛋白酶的野生型啟動(dòng)子。在一些其他實(shí)施例中，啟動(dòng)子與前體蛋白酶是異源的，但是在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能。具體地，用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的合適的啟動(dòng)子的實(shí)施例包括但不限于例如amye、amyq、amyl、psts、sacb、pspac、papre、pveg、phpaii啟動(dòng)子，嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因的啟動(dòng)子、解淀粉芽孢桿菌(ban)淀粉酶基因的啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的啟動(dòng)子、克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的啟動(dòng)子、短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動(dòng)子、蘇云金芽孢桿菌cryiiia的啟動(dòng)子、和地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子。另外的啟動(dòng)子包括但不限于a4啟動(dòng)子，以及噬菌體λpr或pl啟動(dòng)子，以及大腸桿菌lac、trp或tac啟動(dòng)子。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽可以在任何合適的微生物(包括細(xì)菌和真菌)的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽可以在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中生產(chǎn)。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬的物種(bacillusspp.)、鏈霉菌屬的物種(streptomycesspp.)、埃希氏菌屬的物種(escherichiaspp.)、曲霉屬的物種(aspergillusspp.)、木霉屬的物種(trichodermaspp.)、假單胞菌屬的物種(pseudomonasspp.)、棒狀桿菌屬的物種(corynebacteriumspp.)、酵母屬的物種(saccharomycesspp.)和畢赤酵母屬的物種(pichiaspp.)。在一些實(shí)施例中，絲氨酸蛋白酶多肽由芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞生產(chǎn)?？捎糜诒景l(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的生產(chǎn)的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的實(shí)施例包括但不限于：地衣芽孢桿菌、遲緩芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽胞桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、短小芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌，以及芽孢桿菌屬內(nèi)的其他生物體。在一些實(shí)施例中，枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞被用于生產(chǎn)絲氨酸蛋白酶多肽。us5,264,366和4,760,025(re34,606)描述了可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的各種芽孢桿菌屬宿主菌株，盡管可以使用其他合適的菌株?？梢杂糜谏a(chǎn)本發(fā)明絲氨酸蛋白酶多肽的幾種細(xì)菌菌株包括非重組(即野生型)芽孢桿菌屬菌株，以及天然存在的菌株和/或重組菌株的變體。在一些實(shí)施例中，宿主菌株是重組菌株，其中編碼感興趣的多肽的多核苷酸已經(jīng)被引入宿主中。在一些實(shí)施例中，宿主菌株是枯草芽孢桿菌宿主菌株，特別是重組枯草芽孢桿菌宿主菌株。許多枯草芽孢桿菌菌株是已知的，包括但不限于例如1a6(atcc39085)、168(1a01)、sb19、w23、ts85、b637、pb1753至pb1758、pb3360、jh642、1a243(atcc39,087)、atcc21332、atcc6051、mi113、de100(atcc39,094)、gx4931、pbt110、和pep211菌株(參見例如霍克(hoch)等人，遺傳學(xué)(genetics)73:215-228[1973]；還參見美國(guó)專利號(hào)4,450,235和4,302,544，以及ep0134048，其各自通過引用以其整體結(jié)合)。使用枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的(參見例如，palva等人，基因(gene)19:81-87[1982]；法恩斯托克(fahnestock)和費(fèi)希爾(fischer)，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)，165:796-804[1986]；和王(wang)等人，基因(gene)69:39-47[1988])。在一些實(shí)施例中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是包含以下基因中的至少一個(gè)的突變或缺失的芽孢桿菌屬物種：degu、degs、degr和degq。在一些實(shí)施例中，突變是在degu基因中，并且在一些實(shí)施例中，突變?yōu)閐egu(hy)32(參見例如，msadek等人，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)172:824-834[1990]；以及奧爾莫斯(olmos)等人，分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)(mol.gen.gene)253:562-567[1997])。在一些實(shí)施例中，芽孢桿菌屬宿主在scoc4(參見例如考德威爾(caldwell)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)183:7329-7340[2001])；spoiie(參見例如arigoni等人，分子微生物學(xué)(mol.microbiol.)31:1407-1415[1999])；和/或oppa或opp操縱子的其他基因(參見例如，佩雷戈(perego)等人，分子微生物學(xué)(mol.microbiol.)5:173-185[1991])中包含突變或缺失。實(shí)際上，預(yù)期引起與oppa基因突變相同的表型的opp操縱子中的任何突變將可用于本發(fā)明的經(jīng)改變的芽孢桿菌屬菌株的一些實(shí)施例中。在一些實(shí)施例中，這些突變單獨(dú)發(fā)生，而在其他實(shí)施例中，存在突變的組合。在一些實(shí)施例中，可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的改經(jīng)變的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞株是已經(jīng)包含上述基因中的一個(gè)或多個(gè)的突變的芽孢桿菌屬宿主菌株。另外，可使用包含內(nèi)源蛋白酶基因的一個(gè)或多個(gè)突變和/或缺失的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含apre和npre基因的缺失。在其他實(shí)施例中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含5個(gè)蛋白酶基因的缺失，而在其他實(shí)施例中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含9個(gè)蛋白酶基因的缺失(參見例如，us2005/0202535，通過引用結(jié)合在此)。使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，用編碼本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的至少一種核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。利用質(zhì)粒dna構(gòu)建體或載體將核酸(例如dna)引入芽孢桿菌屬細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞并且將這樣的質(zhì)粒dna構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化到這樣的細(xì)胞中的方法是熟知的。在一些實(shí)施例中，質(zhì)粒隨后從大腸桿菌細(xì)胞中分離并且轉(zhuǎn)化到芽孢桿菌屬細(xì)胞中。然而，沒有必要使用介入微生物例如大腸桿菌，并且在一些實(shí)施例中，將dna構(gòu)建體或載體直接引入芽孢桿菌屬宿主中。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常了解將本發(fā)明的核酸序列引入芽孢桿菌屬細(xì)胞的合適方法(參見例如，費(fèi)拉里等人，“遺傳學(xué)”，在：哈伍德(harwood)等人，[編輯]，芽孢桿菌(bacillus)，plenum出版公司[1989]，pp.57-72；桑德斯(saunders)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)157:718-726[1984]；霍克(hoch)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)93:1925-1937[1967]；曼(mann)等人，現(xiàn)代微生物學(xué)(currentmicrobiol.)13:131-135[1986]；holubova，微生物學(xué)大觀(foliamicrobiol.)30:97[1985]；常(chang)等人，分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)(mol.gen.genet.)168:11-115[1979]；vorobjeva等人，fems微生物學(xué)快報(bào)(femsmicrobiol.lett.)7:261-263[1980]；史密斯(smith)等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(appl.env.microbiol.)51:634[1986]；費(fèi)希爾(fisher)等人，微生物學(xué)文獻(xiàn)集(arch.microbiol.)139:213-217[1981]；以及麥克唐納(mcdonald)，普通微生物學(xué)雜志(j.gen.microbiol.)130:203[1984])。實(shí)際上，包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合在內(nèi)的轉(zhuǎn)化方法是熟知的并且適合用于本發(fā)明。本領(lǐng)域已知的用于轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬細(xì)胞的方法包括例如質(zhì)粒標(biāo)記物拯救轉(zhuǎn)化的方法，其涉及通過攜帶部分同源的駐留質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞攝取供體質(zhì)粒(參見，孔滕特(contente)等人，質(zhì)粒(plasmid)2:555-571[1979]；海馬(haima)等人，分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)(mol.gen.genet.)223:185-191[1990]；魏因勞奇(weinrauch)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)154:1077-1087[1983]；以及魏因勞奇(weinrauch)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)169:1205-1211[1987])。在該方法中，進(jìn)入的供體質(zhì)粒在模擬染色體轉(zhuǎn)化的過程中與駐留的“輔助”質(zhì)粒的同源區(qū)重組。除了通常使用的方法之外，在一些實(shí)施例中，用包含編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的核酸的dna構(gòu)建體或載體直接轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(即，在引入宿主細(xì)胞之前，中間細(xì)胞不用于擴(kuò)增或以其他方式處理dna構(gòu)建體或載體)。將本發(fā)明的dna構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞包括本領(lǐng)域已知的將核酸序列(例如dna序列)引入宿主細(xì)胞而不插入宿主基因組的那些物理和化學(xué)方法。此類方法包括但不限于氯化鈣沉淀、電穿孔、裸dna、脂質(zhì)體等。在另外的實(shí)施例中，dna構(gòu)建體或載體與質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化而不插入質(zhì)粒。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，通過本領(lǐng)域已知的方法從經(jīng)改變的芽孢桿菌屬菌株中缺失選擇標(biāo)記(參見斯特爾(stahl)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)158:411-418[1984]；以及palmeros等人，基因(gene)247:255-264[2000])。在一些實(shí)施例中，將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。合適的特定培養(yǎng)條件，例如溫度、ph等是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且詳細(xì)描述于科學(xué)文獻(xiàn)中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽或至少一種核酸的培養(yǎng)物(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)。在一些實(shí)施例中，用編碼本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的至少一個(gè)多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在允許本發(fā)明的蛋白酶表達(dá)的條件下在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后從培養(yǎng)物中回收得到的蛋白酶。在一些實(shí)施例中，通過常規(guī)程序從培養(yǎng)基中回收由細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白酶，該常規(guī)程序包括但不限于例如通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞、借助于鹽(例如硫酸銨)沉淀上清液或?yàn)V液的蛋白質(zhì)組分、層析法純化(例如離子交換、凝膠過濾、親和等)。在一些實(shí)施例中，由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的絲氨酸蛋白酶多肽被分泌到培養(yǎng)基中。編碼純化促進(jìn)結(jié)構(gòu)域的核酸序列可以用于促進(jìn)蛋白質(zhì)的純化。包含編碼絲氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列的載體或dna構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含編碼促進(jìn)絲氨酸蛋白酶多肽純化的純化促進(jìn)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(參見例如，克羅爾(kroll)等人，dna細(xì)胞生物學(xué)(dnacellbiol.)12:441-53[1993])。此類純化促進(jìn)結(jié)構(gòu)域包括但不限于例如金屬螯合肽，例如允許在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊(參見波拉特(porath)，蛋白表達(dá)與純化(proteinexpr.purif.)3:263-281[1992])；允許在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白質(zhì)a結(jié)構(gòu)域；以及在flags延伸/親和純化系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)域。在純化結(jié)構(gòu)域和異源蛋白之間包含可切割的接頭序列例如因子xa或腸激酶(例如，可獲自加利福尼亞州圣地亞哥市英杰公司(invitrogen)的序列)還可用于促進(jìn)純化。用于檢測(cè)和測(cè)量酶的酶活性的測(cè)定法，例如本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽是熟知的。用于檢測(cè)和測(cè)量蛋白酶(例如本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽)的活性的各種測(cè)定法也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。具體地，測(cè)定可用于測(cè)量基于酪蛋白或血紅蛋白的酸可溶性肽的釋放的蛋白酶活性，其作為280nm下的吸光度測(cè)量或使用folin方法進(jìn)行比色測(cè)定。其他示例性測(cè)定涉及顯色底物的溶解(參見例如，沃德(ward)，“蛋白酶(proteinases)”，在：福格蒂(fogarty)(編輯)，微生物酶與生物技術(shù)(microbialenzymesandbiotechnology)，應(yīng)用科學(xué)出版社(appliedscience)，倫敦[1983]，pp.251-317)。其他示例性測(cè)定包括但不限于琥珀酰-ala-ala-pro-phe-對(duì)硝基苯胺測(cè)定(suc-aapf-pna)和2,4,6-三硝基苯磺酸鈉鹽測(cè)定(tnbs測(cè)定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多另外的參考文獻(xiàn)提供了合適的方法(參見例如，威爾斯(wells)等人，核酸研究(nucleicacidsres.)11:7911-7925[1983]：克里斯蒂安松(christianson)等人，分析生物化學(xué)(anal.biochem.)223:119-129[1994]；以及hsia等人，分析生物化學(xué)(anal.biochem.)242:221-227[1999])。可以使用各種方法來確定宿主細(xì)胞中成熟蛋白酶(例如，本發(fā)明的成熟絲氨酸蛋白酶多肽)的生產(chǎn)水平。此類方法包括但不限于例如利用對(duì)蛋白酶特異的多克隆或單克隆抗體的方法。示例性方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、放射免疫測(cè)定(ria)、熒光免疫測(cè)定(fia)和熒光激活細(xì)胞分選(facs)。這些和其他測(cè)定法是本領(lǐng)域熟知的(參見例如，馬多克斯(maddox)等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)158:1211[1983])。在一些其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供了制備或生產(chǎn)本發(fā)明的成熟絲氨酸蛋白酶多肽的方法。成熟的絲氨酸蛋白酶多肽不包括信號(hào)肽或前肽序列。一些方法包括在重組細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如像芽孢桿菌屬細(xì)胞(例如，枯草芽孢桿菌細(xì)胞))中制備或生產(chǎn)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的方法，該方法包括在有利于生產(chǎn)絲氨酸蛋白酶多肽的條件下培養(yǎng)包含重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞，該重組表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的核酸。一些這樣的方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)物中回收絲氨酸蛋白酶多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的方法，該方法包括：(a)將包含編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的核酸的重組表達(dá)載體引入細(xì)胞群體(例如細(xì)菌細(xì)胞，例如枯草芽孢桿菌細(xì)胞)中；并且(b)在有助于生產(chǎn)由表達(dá)載體編碼的絲氨酸蛋白酶多肽的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。一些這樣的方法進(jìn)一步包括：(c)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離絲氨酸蛋白酶多肽。除非另外指出，在此提供的所有組分或組合物水平參照該組分或組合物的活性水平給出，并且不包括可能存在于可商購(gòu)來源中的雜質(zhì)，例如殘余溶劑或副產(chǎn)品。酶組分重量是基于總的活性蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量計(jì)算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于總組合物計(jì)算。本發(fā)明的組合物包括清潔組合物，例如洗滌劑組合物。在例示洗滌劑組合物中，通過按總組合物的重量計(jì)的純酶表示酶水平并且除非另外說明，按總組合物的重量計(jì)表示洗滌劑成分。雖然對(duì)于本發(fā)明的目的不是必需的，但是下文所示的輔助劑的非限制性列表適合用于即時(shí)清潔組合物。在一些實(shí)施例中，摻入這些輔助劑例如以便輔助或增強(qiáng)清潔性能，用于處理待清潔的基材，或者以便改變清潔組合物的美觀性，如香料、色素、染料等的情況。應(yīng)當(dāng)理解，此類輔助劑是本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的補(bǔ)充。這些另外的組分的精確性質(zhì)及其摻入水平將取決于組合物的物理形式和將在使用組合物的清潔操作的性質(zhì)。合適的輔助材料包括但不限于漂白催化劑、其他酶、酶穩(wěn)定系統(tǒng)、螯合劑、熒光增白劑、去污聚合物、染料轉(zhuǎn)移劑、分散劑、泡沫抑制劑、染料、香料、色素、填料鹽、光活化劑、熒光劑、織物調(diào)理劑、可水解表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗收縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、顏色斑點(diǎn)、銀護(hù)理、抗晦暗和/或抗腐蝕劑、堿源、增溶劑、載體、加工助劑、顏料、和ph控制劑、表面活性劑、助洗劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、沉積助劑、分散劑、附加的酶和酶穩(wěn)定劑、催化材料、漂白活化劑、漂白增效劑、過氧化氫、過氧化氫源、預(yù)成型過酸、聚合物分散劑、粘土去除/抗再沉積劑、增白劑、泡沫抑制劑、染料、香料、結(jié)構(gòu)彈性劑、織物軟化劑、載體、助水溶物、加工助劑和/或顏料。除了以下公開，此類其他輔助劑的適合實(shí)施例以及使用水平發(fā)現(xiàn)于us5,576,282；6,306,812；6,326,348；6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014和5,646,101中，其全部通過引用結(jié)合在此。在清潔輔助材料與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽在清潔組合物中不相容的實(shí)施例中，那么使用合適的方法保持清潔輔助材料和一種或多種蛋白酶分離(即彼此不接觸)直到兩個(gè)組分的組合適當(dāng)時(shí)。此類分離方法包括本領(lǐng)域已知的任何合適的方法(例如，囊形片、包封、片劑化、物理分離等)。上述輔助成分可以構(gòu)成余量的本發(fā)明的清潔組合物。本發(fā)明的清潔組合物有利地用于例如洗衣應(yīng)用、硬表面清潔應(yīng)用、餐具洗滌應(yīng)用(包括自動(dòng)餐具洗滌和手洗餐具洗滌)、以及裝飾品應(yīng)用(例如假牙、牙齒、頭發(fā)和皮膚清潔)。本發(fā)明的酶還適合用于隱形眼鏡清潔和傷口清創(chuàng)應(yīng)用。另外，由于在較低溫度溶液中增加有效性的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的酶理想地適合于洗衣應(yīng)用。此外，本發(fā)明的酶可用于顆粒和液體組合物。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽還可用于清潔添加劑產(chǎn)品。在一些實(shí)施例中，可使用低溫溶液清潔應(yīng)用。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的至少一種酶的清潔添加劑產(chǎn)品，當(dāng)希望另外的漂白效果時(shí)，該酶理想地適合于包含在洗滌過程中。此類實(shí)施例包括但不限于低溫溶液清潔應(yīng)用。在一些實(shí)施例中，添加劑產(chǎn)品處于其最簡(jiǎn)單的形式，一種或多種蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施例中，該添加劑被包封于劑型中用于添加至清潔過程中。在一些實(shí)施例中，該添加劑被包封于劑型中用于添加至清潔過程中，其中使用過氧源并且希望得到增加的漂白效果。本發(fā)明可使用任何適合的單一劑量單位形式，包括但不限于丸劑、片劑、囊形片或其他單一劑量單位例如預(yù)先測(cè)量的粉末或液體。在一些實(shí)施例中，包括一種或多種填料或一種或多種載體材料以增加此類組合物的體積。適合的填料或載體材料包括但不限于：硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽的各種鹽以及滑石、粘土等。用于液體組合物的適合的填料或載體材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此類醇的實(shí)施例包括但不限于：甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實(shí)施例中，組合物包含從約5％至約90％的此類材料。酸性填料可用于降低ph值。可替代地，在一些實(shí)施例中，清潔添加劑包括輔助成分，如下面更全面地描述的。本發(fā)明的清潔組合物和清潔添加劑需要有效量的本文提供的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽，該絲氨酸蛋白酶多肽是單獨(dú)的或與其他蛋白酶和/或另外的酶組合。所需的酶水平通過添加本發(fā)明的一種或多種絲氨酸蛋白酶多肽來實(shí)現(xiàn)。典型地本發(fā)明的清潔組合物包含至少約0.0001重量百分比、從約0.0001至約10重量百分比、從約0.001至約1重量百分比、或從約0.01至約0.1重量百分比的至少一種本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽。典型地本文的清潔組合物被配制使得在水性清潔操作中使用期間，洗滌水將具有的ph為從約4.0至約11.5、或甚至從約5.0至約11.5、或甚至從約5.0至約8.0、或甚至從約7.5至約10.5。液體產(chǎn)品配制品典型地被配制成具有從約3.0至約9.0或甚至從約3至約5的ph。顆粒狀洗衣產(chǎn)品典型地被配制成具有從約9至約11的ph。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物可以被配制成在洗滌條件下具有堿性ph，例如從約8.0至約12.0、或從約8.5至約11.0、或從約9.0至約11.0的ph。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物可以被配制成在洗滌條件下具有中性ph，例如從約5.0至約8.0、或從約5.5至約8.0、或從約6.0至約8.0、或從約6.0至約7.5的ph。在一些實(shí)施例中，當(dāng)清潔組合物在20℃下以1:100(wt:wt)溶解于去離子水中時(shí)，可以測(cè)量中性ph條件，使用常規(guī)ph計(jì)進(jìn)行測(cè)量。用于將ph控制在推薦的使用水平的技術(shù)包括使用緩沖液、堿、酸等，并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。在一些實(shí)施例中，當(dāng)一種或多種絲氨酸蛋白酶多肽應(yīng)用于顆粒組合物或液體中時(shí)，希望絲氨酸蛋白酶多肽將處于包封的顆粒的形式以保護(hù)絲氨酸蛋白酶多肽免受儲(chǔ)存期間的顆粒組合物的其他組分之害。另外，包封還是在清潔過程中控制絲氨酸蛋白酶多肽的可用性的手段。在一些實(shí)施例中，包封增強(qiáng)了一種或多種絲氨酸蛋白酶多肽和/或另外的酶的性能。就這一點(diǎn)而言，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽使用本領(lǐng)域已知的任何合適的包封材料進(jìn)行包封。在一些實(shí)施例中，包封材料典型地包封本發(fā)明的一種或多種絲氨酸蛋白酶多肽的至少一部分。典型地，包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些實(shí)施例中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(tg)。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在wo97/11151中有更詳細(xì)的描述。包封材料典型地選自：碳水化合物、天然或合成膠、甲殼素、殼聚糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟及其組合。當(dāng)包封材料是碳水化合物時(shí)，其典型地選自單糖、寡糖、多糖及其組合。在一些典型的實(shí)施例中，包封材料是淀粉(參見例如ep0922499；us4,977,252；5,354,559；和5,935,826)。在一些實(shí)施例中，包封材料是由塑料(例如熱塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球；可使用的可商購(gòu)的微球包括但不限于由(stockviksverken，瑞典)、pm6545、pm6550、pm7220、pm7228、和(pq公司，賓夕法尼亞州福吉谷市(valleyforge,pa))供應(yīng)的那些。存在各種洗滌條件，包括涉及洗滌的蛋白酶所暴露的不同的洗滌劑配制品、洗滌水體積、洗滌水溫度、和洗滌時(shí)間的長(zhǎng)短。低洗滌劑濃度體系包含以下洗滌劑，其中洗滌水中存在少于約800ppm的洗滌劑組分。中洗滌劑濃度體系包含以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在約800ppm和約2000ppm之間的洗滌劑組分。高洗滌劑濃度體系包含以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在多于約2000ppm的洗滌劑組分。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的“冷水洗滌”使用適合于在從約10℃至約40℃、或從約20℃至約30℃、或從約15℃至約25℃、以及在約15℃至約35℃范圍內(nèi)并且在10℃至40℃之間所有范圍的所有其他組合的溫度下洗滌的“冷水洗滌劑”。典型地，不同的地理位置具有不同的水硬度。通常按照每加侖顆粒數(shù)混合的ca2+/mg2+來描述水硬度。硬度是水中鈣(ca2+)和鎂(mg2+)的量的量度。美國(guó)大部分水都是硬水，但是硬度卻不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181份/百萬份。表i.水硬度水每加侖顆粒數(shù)百萬分率軟小于1.0小于17略硬1.0至3.517至60中等硬3.5至7.060至120硬7.0至10.5120至180非常硬大于10.5大于180因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供在至少一組洗滌條件(例如水溫、水硬度和/或洗滌劑濃度)中顯示令人驚訝的洗滌性能的絲氨酸蛋白酶多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽與其他絲氨酸蛋白酶多肽蛋白酶的洗滌性能相當(dāng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本文提供的絲氨酸蛋白酶多肽顯示增強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性、增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、在各種條件下增強(qiáng)的清潔能力、和/或增強(qiáng)的螯合劑穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽也可單獨(dú)地或與助洗劑和穩(wěn)定劑組合地用于不含洗滌劑的清潔組合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，清潔組合物包含至少一種本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽(水平為以組合物重量計(jì)從約0.00001％至約10％)和包括以組合物重量計(jì)的余量的清潔輔助材料(例如，約99.999％至約90.0％)。在本發(fā)明的一些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含至少一種絲氨酸蛋白酶多肽(水平為以組合物重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％)并且余量的清潔組合物包含清潔輔助材料(例如，以重量計(jì)約99.9999％至約90.0％、約99.999％至約98％、約99.995％至約99.5％)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種另外的洗滌劑酶，該洗滌劑酶提供清潔性能和/或織物護(hù)理和/或餐具洗滌益處。適合的酶的實(shí)施例包含但不限于：酰基轉(zhuǎn)移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜膠酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、軟骨素酶、角質(zhì)酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶、透明質(zhì)酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木質(zhì)素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果膠裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠酶、戊聚糖酶、過氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、還原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、和木糖苷酶、或其任意組合或混合物。在一些實(shí)施例中，使用酶的組合(即，“混合物”)，該酶包含常規(guī)可適用的酶如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶和/或纖維素酶，與淀粉酶結(jié)合。除了本文提供的絲氨酸蛋白酶多肽之外，任何其他合適的蛋白酶都可用于本發(fā)明的組合物中。合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來源的蛋白酶。在一些實(shí)施例中，使用微生物蛋白酶。在一些實(shí)施例中，包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。在一些實(shí)施例中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)施例包括枯草桿菌蛋白酶，特別是衍生自芽孢桿菌的那些(例如，枯草桿菌蛋白酶遲緩、枯草桿菌蛋白酶解淀粉、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯(carlsberg)、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168)。另外的實(shí)施例包括在以下各項(xiàng)中描述的那些突變型蛋白酶：usre34,606；5,955,340；5,700,676；6,312,936；和6,482,628，其全部通過引用結(jié)合在此。另外的蛋白酶實(shí)施例包括但不限于胰蛋白酶(例如豬或牛起源的)和在wo89/06270中描述鐮孢菌屬(fusarium)蛋白酶。在一些實(shí)施例中，可用于本發(fā)明的可商購(gòu)的蛋白酶包括但不限于：maxacaltm、maxapemtm、oxp、puramaxtm、excellasetm、preferenztm蛋白酶(例如p100、p110、p280)、effectenztm蛋白酶(例如p1000、p1050、p2000)、excellenztm蛋白酶(例如p1000)、和purafasttm(杰能科公司(genencor))；賽威蛋白酶引發(fā)酶durazymtm、波力酶液體蛋白酶中性蛋白酶和益瑞蛋白酶(諾維信公司(novozymes))；blaptm和blaptm變體(德國(guó)杜塞爾多夫市漢高股份有限公司(henkelkommanditgesellschaftaufaktien，duesseldorf，germany))、以及kap(嗜堿芽孢桿菌(b.alkalophilus)枯草桿菌蛋白酶；日本東京市花王公司(kaocorp.,tokyo,japan))。各種蛋白酶描述于wo95/23221、wo92/21760、wo09/149200、wo09/149144、wo09/149145、wo11/072099、wo10/056640、wo10/056653、wo11/140364、wo12/151534、us2008/0090747、和us5,801,039；5,340,735；5,500,364；5,855,625；re34,606；5,955,340；5,700,676；6,312,936；6,482,628；8,530,219；以及各種其他專利中。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，中性金屬蛋白酶可用于本發(fā)明，包括但不限于在wo1999014341、wo1999033960、wo1999014342、wo1999034003、wo2007044993、wo2009058303、wo2009058661、wo2014/071410、wo2014/194032、wo2014/194034、wo2014/194054、和wo2014/194117中描述的中性金屬蛋白酶。示例性金屬蛋白酶包括在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的重組形式的中性金屬蛋白酶npre(參見例如wo07/044993)和來自解淀粉芽孢桿菌的純化的中性金屬蛋白酶pmn。另外，任何合適的脂肪酶都可用于本發(fā)明。適合的脂肪酶包括但不限于細(xì)菌或真菌起源的脂肪酶?；瘜W(xué)或遺傳修飾的突變體涵蓋在本發(fā)明中。有用的脂肪酶的實(shí)施例包括綿毛狀腐質(zhì)菌(h.lanuginosa)脂肪酶(參見例如ep258068和ep305216)；米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶(參見例如ep238023)；假絲酵母屬脂肪酶，例如南極洲假絲酵母(c.antarctica)脂肪酶(例如南極洲假絲酵母脂肪酶a或b；參見例如，ep214761)；假單胞菌脂肪酶，例如產(chǎn)堿假單胞菌(p.alcaligenes)脂肪酶和假產(chǎn)堿假單胞菌(p.pseudoalcaligenes)脂肪酶(參見例如，ep218272)；洋蔥假單胞菌(p.cepacia)脂肪酶(參見例如，ep331376)；施氏假單胞菌(p.stutzeri)脂肪酶(參見例如，gb1,372,034)；螢光假單胞菌脂肪酶；芽孢桿菌屬脂肪酶(例如枯草芽孢桿菌脂肪酶[dartois等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(biochem.biophys.acta)1131:253-260[1993])；嗜熱脂肪芽桿菌脂肪酶[參見例如，jp64/744992]；以及短小芽胞桿菌脂肪酶[參見例如，wo91/16422])。此外，許多克隆的脂肪酶可用于本發(fā)明的一些實(shí)施例中，包括但不限于沙門柏干酪青霉(penicilliumcamembertii)脂肪酶(參見yamaguchi等人，基因(gene)103:61-67[1991])；白地霉(geotricumcandidum)脂肪酶(參見schimada等人，生物化學(xué)雜志(j.biochem.)，106:383-388[1989])；以及各種根霉屬脂肪酶例如德氏根霉(r.delemar)脂肪酶(參見哈斯(hass)等人，基因(gene)109:117-113[1991])；雪白根霉脂肪酶(kugimiya等人，生物科學(xué)、生物技術(shù)與生物化學(xué)(biosci.biotech.biochem.)56:716-719[1992])和米根霉(r.oryzae)脂肪酶。其他類型的脂肪酶多肽酶例如角質(zhì)酶還可用于本發(fā)明的一些實(shí)施例中，包括但不限于源自門多薩假單胞菌(pseudomonasmendocina)(參見wo88/09367)的角質(zhì)酶和源自豌豆根腐鐮孢菌(fusariumsolanipisi)的角質(zhì)酶(參見，wo90/09446)。另外適合的脂肪酶包括脂肪酶例如m1lipasetm、lumafasttm、和lipomaxtm(杰能科公司)；和ultra(諾維信公司)；和lipaseptm“amano”(日本天野藥業(yè)有限公司(amanopharmaceuticalco.ltd.))。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含以組合物重量計(jì)的另外的脂肪酶的從約0.00001％至約10％的水平的脂肪酶，以及以組合物重量計(jì)的余量的清潔輔助材料。在本發(fā)明的一些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物還包含以組合物重量計(jì)在約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％脂肪酶水平的脂肪酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，任何合適的淀粉酶可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施例中，還可使用適合用于堿性溶液的任何淀粉酶(例如α和/或β)。適合的淀粉酶包括但不限于細(xì)菌或真菌起源的那些。化學(xué)或遺傳修飾的突變體包括在一些實(shí)施例中。可用于本發(fā)明的淀粉酶包括但不限于從地衣芽孢桿菌獲得的α-淀粉酶(參見例如gb1,296,839)。另外的適合的淀粉酶包括在w09510603、wo9526397、wo9623874、wo9623873、wo9741213、wo9919467、wo0060060、wo0029560、wo9923211、wo9946399、wo0060058、wo0060059、wo9942567、wo0114532、wo02092797、wo0166712、wo0188107、wo0196537、wo0210355、wo9402597、wo0231124、wo9943793、wo9943794、wo2004113551、wo2005001064、wo2005003311、wo0164852、wo2006063594、wo2006066594、wo2006066596、wo2006012899、wo2008092919、wo2008000825、wo2005018336、wo2005066338、wo2009140504、wo2005019443、wo2010091221、wo2010088447、wo0134784、wo2006012902、wo2006031554、wo2006136161、wo2008101894、wo2010059413、wo2011098531、wo2011080352、wo2011080353、wo2011080354、wo2011082425、wo2011082429、wo2011076123、wo2011087836、wo2011076897、wo94183314、wo9535382、wo9909183、wo9826078、wo9902702、wo9743424、wo9929876、wo9100353、wo9605295、wo9630481、wo9710342、wo2008088493、wo2009149419、wo2009061381、wo2009100102、wo2010104675、wo2010117511、和wo2010115021中發(fā)現(xiàn)的那些?？捎糜诒景l(fā)明的可商購(gòu)的淀粉酶包括但不限于拖麥米爾真菌淀粉酶污漬酶污漬酶加超級(jí)污漬酶和bantm(諾維信公司)、以及強(qiáng)力酶(powerase)tm、快速酶和p(杰能科公司)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含以組合物重量計(jì)的另外的淀粉酶的從約0.00001％至約10％的水平的淀粉酶，以及以組合物重量計(jì)的余量的清潔輔助材料。在本發(fā)明的一些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物還包含以組合物重量計(jì)在約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％淀粉酶水平的淀粉酶。在一些另外的實(shí)施例中，在本發(fā)明的清潔組合物中可使用任何適合的纖維素酶。適合的纖維素酶包括但不限于細(xì)菌或真菌起源的那些?；瘜W(xué)或遺傳修飾的突變體包括在一些實(shí)施例中。適合的纖維素酶包括但不限于腐質(zhì)霉(humicolainsolens)纖維素酶(參見例如us4,435,307)。尤其適合的纖維素酶是具有顏色護(hù)理益處的纖維素酶(參見例如ep0495257)。在本發(fā)明中可使用的可商購(gòu)的纖維素酶包括但不限于纖維素酶護(hù)理酶(諾維信公司)、revitalenztm100(美國(guó)丹尼斯科公司(daniscousinc))和kac-500(b)tm(花王公司)。在一些實(shí)施例中，纖維素酶作為成熟野生型或變體纖維素酶的部分或片段摻入，其中n末端的一部分缺失(參見例如us5,874,276)。另外的適合的纖維素酶包括在wo2005054475、wo2005056787、us7,449,318和7,833,773中發(fā)現(xiàn)的那些。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含以組合物重量計(jì)的另外的纖維素酶的從約0.00001％至約10％的水平的纖維素酶，以及以組合物重量計(jì)的余量的清潔輔助材料。在本發(fā)明的一些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物還包含以組合物重量計(jì)在約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％纖維素酶水平的纖維素酶。適合用于洗滌劑組合物的任何甘露聚糖酶也可用于本發(fā)明。適合的甘露聚糖酶包括但不限于細(xì)菌或真菌起源的那些。化學(xué)或遺傳修飾的突變體包括在一些實(shí)施例中。已知各種甘露聚糖酶可用于本發(fā)明(參見例如us6,566,114；6,602,842；和6,440,991中，其全部通過引用結(jié)合在此)?？捎糜诒景l(fā)明的可商購(gòu)的甘露聚糖酶包括但不限于purabritetm、和在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含以組合物重量計(jì)的另外的甘露聚糖酶的從約0.00001％至約10％的水平的甘露聚糖酶，以及以組合物重量計(jì)的余量的清潔輔助材料。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物還包含以組合物重量計(jì)在約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶。在一些實(shí)施例中，過氧化物酶與過氧化氫或其來源(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)組合用于本發(fā)明的組合物中。在一些可替代的實(shí)施例中，氧化酶與氧組合使用。兩種類型的酶都用于“溶液漂白”，即當(dāng)織物在洗滌液中一起洗滌時(shí)防止紡織染料從一種染色的織物轉(zhuǎn)移到另一種織物上)，優(yōu)選與增效劑一起使用(參見例如wo94/12621和wo95/01426)。適合的過氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、細(xì)菌或真菌起源的那些?；瘜W(xué)或遺傳修飾的突變體包括在一些實(shí)施例中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含以組合物重量計(jì)的另外的過氧化物酶和/或氧化酶的從約0.00001％至約10％的水平的過氧化物酶和/或氧化酶，以及以組合物重量計(jì)的余量的清潔輔助材料。在本發(fā)明的一些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物還包含以組合物重量計(jì)在約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％過氧化物酶和/或氧化酶水平的過氧化物酶和/或氧化酶。在一些實(shí)施例中，可使用的另外的酶，包括但不限于過水解酶(perhydrolase)(參見例如wo2005056782、wo2007106293、wo2008063400、wo2008106214、和wo2008106215)。另外，在一些實(shí)施例中，上述酶的混合物涵蓋在本文中，特別是一種或多種另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一種纖維素酶。實(shí)際上，預(yù)期這些酶的各種混合物將用于本發(fā)明。還預(yù)期一種或多種絲氨酸蛋白酶多肽和一種或多種另外的酶的不同水平可以獨(dú)立地變動(dòng)至約10％，清潔組合物的余量為清潔輔助材料。通過考慮有待清潔的表面、物品或織物，以及針對(duì)使用過程中(例如在整個(gè)清潔洗滌劑使用中)的清潔條件的組合物的所希望的形式而容易地具體選擇清潔輔助材料。在一些實(shí)施例中，本文提供的有效量的一種或多種絲氨酸蛋白酶多肽包含在用于清潔需要蛋白質(zhì)去污的各種表面的組合物中。此類清潔組合物包括用于清潔硬表面、織物和餐具等應(yīng)用的清潔組合物。實(shí)際上，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供織物清潔組合物，而在其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供非織物清潔組合物。值得注意的是，本發(fā)明還提供適用于個(gè)人護(hù)理的清潔組合物，包括口腔護(hù)理(包括牙粉、牙膏、漱口水等，以及假牙清潔組合物)、皮膚和毛發(fā)清潔組合物。本發(fā)明旨在涵蓋處于任何形式的洗滌劑組合物(即，液體、顆粒、棒狀、半固體、凝膠、乳劑、片劑、膠囊等)。舉例來說，下面將更詳細(xì)地描述其中可使用本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的幾種清潔組合物。在將本發(fā)明的清潔組合物配制成適合用于一種或多種洗衣機(jī)洗滌方法中的組合物的一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物優(yōu)選含有至少一種表面活性劑和至少一種助洗劑化合物，以及一種或多種優(yōu)選地選自有機(jī)聚合化合物、漂白劑、另外的酶、泡沫抑制劑、分散劑、鈣皂分散劑、污垢懸浮液和抗再沉積劑以及腐蝕抑制劑的清潔輔助材料。在一些實(shí)施例中，洗衣組合物還含有軟化劑(即，作為另外的清潔輔助材料)。本發(fā)明的組合物還可用于處于固體或液體形式的洗滌劑添加劑產(chǎn)品中。此類添加劑產(chǎn)品旨在補(bǔ)充和/或提高常規(guī)洗滌劑組合物的性能，并且可以在清潔過程的任何階段添加。在一些實(shí)施例中，本文的衣物洗滌劑組合物的密度范圍為從約400g/升至約1200g/升，而在其他實(shí)施例中，其范圍為在20℃下測(cè)量的組合物的500g/升至約950g/升。在配制為用于在手動(dòng)餐具洗滌方法中使用的組合物的實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物優(yōu)選含有至少一種表面活性劑以及優(yōu)選至少一種另外的清潔輔助材料，該清潔輔助材料選自有機(jī)聚合化合物、增泡劑、ii族金屬離子、溶劑、助水溶物和另外的酶。在一些實(shí)施例中，各種清潔組合物(例如在us6,605,458中提供的那些)可與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽一起使用。因此，在一些實(shí)施例中，包含本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的組合物是緊密的顆粒狀織物清潔組合物，而在其他實(shí)施例中，組合物是用于有色織物洗滌的顆粒狀織物清潔組合物，在進(jìn)一步的實(shí)施例中，組合物是通過洗滌能力提供軟化的顆粒狀織物清潔組合物，在另外的實(shí)施例中，組合物是重垢液體織物清潔組合物。在一些實(shí)施例中，包含本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的組合物是織物清潔組合物，例如在us6,610,642和6,376,450中描述的那些。另外，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽可用于在歐洲或日本洗滌條件下特別實(shí)用的顆粒狀衣物洗滌劑組合物中(參見例如us6,610,642)。在一些可替代的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含本文提供的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的硬表面清潔組合物。因此，在一些實(shí)施例中，包含本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的組合物是硬表面清潔組合物，例如在us6,610,642；6,376,450；和6,376,450中描述的那些。在又進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含本文提供的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的餐具洗滌組合物。因此，在一些實(shí)施例中，包含本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的組合物是硬表面清潔組合物，例如在us6,610,642和6,376,450中的那些。在一些又進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含本文提供的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的餐具洗滌組合物。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，包含本發(fā)明的至少一種絲氨酸蛋白酶多肽的組合物包括口腔護(hù)理組合物，例如在us6,376,450和6,376,450中描述的那些。在上述us6,376,450；6,605,458；6,605,458；和6,610,642中包含的化合物和清潔輔助材料的配制品和描述可用于本文提供的絲氨酸蛋白酶多肽。將本發(fā)明的清潔組合物配制成任何合適的形式并且通過由配方設(shè)計(jì)師選擇的任何方法來制備，其非限制性實(shí)施例描述于us5,879,584；5,691,297；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303，其所有通過引用結(jié)合在此。當(dāng)希望低ph清潔組合物時(shí)，此類組合物的ph經(jīng)由添加例如單乙醇胺或酸性物質(zhì)例如hcl的物質(zhì)來調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物包含酸化顆?；虬被人嶂磩?。氨基羧酸助洗劑的實(shí)施例包括氨基羧酸、其鹽和衍生物。在一些實(shí)施例中，氨基羧酸助洗劑是氨基多羧酸助洗劑，例如甘氨酸-n,n-二乙酸或具有通式mooc-chr-n(ch2coom)2(其中r是c1-12烷基并且m是堿金屬)的衍生物。在一些實(shí)施例中，氨基羧酸助洗劑可以是甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、glda(谷氨酸-n,n-二乙酸)、亞氨基二琥珀酸(ids)、羧基甲基菊粉及其鹽及其衍生物、天冬氨酸-n-單乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-單丙酸(asmp)、亞氨基二琥珀酸(ida)、n-(2-磺基甲基)天冬氨酸(smas)、n-(2-磺基乙基)天冬氨酸(seas)、n-(2-磺基甲基)谷氨酸(smgl)、n-(2-磺基乙基)谷氨酸(segl)、ids(亞氨基二乙酸)及其鹽及其衍生物例如n-甲基亞氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、絲氨酸-n,n-二乙酸(seda)、異絲氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、鄰氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、磺胺酸-n,n-二乙酸(slda)、?；撬?n,n-二乙酸(tuda)和磺基甲基-n,n-二乙酸(smda)、以及堿金屬鹽及其衍生物。在一些實(shí)施例中，酸化顆粒的重量幾何平均粒度為從約400μ至約1200μ，并且體積密度為至少550g/l。在一些實(shí)施例中，酸化顆粒包含至少約5％的助洗劑。在一些實(shí)施例中，酸化顆粒可以包含任何酸，包括有機(jī)酸和無機(jī)酸。有機(jī)酸可以具有一個(gè)或兩個(gè)羧基，并且在一些情況下可以具有多達(dá)15個(gè)碳，特別是多達(dá)10個(gè)碳，如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、馬來酸、富馬酸、癸二酸、蘋果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些實(shí)施例中，該酸是檸檬酸。無機(jī)酸包括鹽酸和硫酸。在一些情況下，本發(fā)明的酸化顆粒是包含高水平氨基羧酸助洗劑的高活性顆粒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)硫酸進(jìn)一步有助于最終顆粒的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物包括至少一種表面活性劑和/或表面活性劑系統(tǒng)，其中所述表面活性劑選自非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兼性離子表面活性劑、半極性非離子表面活性劑及其混合物。在一些實(shí)施例中，表面活性劑以從約0.1％至約60％的水平存在，而在可替代的實(shí)施例中，該水平為從約1％至約50％，而在又進(jìn)一步的實(shí)施例中，該水平為從約5％至約40％，以清潔組合物的重量計(jì)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑助洗劑或助洗劑系統(tǒng)。在摻入至少一種助洗劑的一些實(shí)施例中，清潔組合物包含以清潔組合物的重量計(jì)至少約1％、從約3％至約60％、或甚至從約5％至約40％的助洗劑。助洗劑包括但不限于多磷酸鹽的堿金屬鹽、銨鹽和烷醇銨鹽；堿金屬硅酸鹽；堿土金屬和堿金屬碳酸鹽、鋁硅酸鹽；醚羥基多羧酸鹽；馬來酸酐與乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1,3,5-三羥基苯-2,4,6-三磺酸；聚乙酸的銨鹽和取代的銨鹽，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；多羧酸鹽，例如苯六甲酸、琥珀酸、檸檬酸、氧基二琥珀酸、聚馬來酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸；及其可溶性鹽。實(shí)際上，預(yù)期任何適合的助洗劑將用于本發(fā)明的各種實(shí)施例中。在一些實(shí)施例中，助洗劑形成水溶性硬度離子絡(luò)合物(例如螯合助洗劑)，例如檸檬酸鹽和多磷酸鹽(例如三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉六水合物、三聚磷酸鉀、以及混合的三聚磷酸鈉和鉀等)。預(yù)期任何適合的助洗劑將用于本發(fā)明，包括本領(lǐng)域已知的那些(參見例如ep2100949)。在一些實(shí)施例中，本文使用的助洗劑包括磷酸鹽助洗劑和非磷酸鹽助洗劑。在一些實(shí)施例中，助洗劑是磷酸鹽助洗劑。在一些實(shí)施例中，助洗劑是非磷酸鹽助洗劑。如果存在，助洗劑以按組合物的重量計(jì)從0.1％至80％、或從5％至60％、或從10％至50％的水平使用。在一些實(shí)施例中，產(chǎn)品包括磷酸鹽和非磷酸鹽助洗劑的混合物。適合的磷酸鹽助洗劑包括單磷酸鹽、二磷酸鹽、三聚磷酸鹽或低聚多磷酸鹽，包括這些化合物的堿金屬鹽，包括鈉鹽。在一些實(shí)施例中，助洗劑可以是三聚磷酸鈉(stpp)。另外，組合物可以包含有助于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的中性ph組合物的碳酸鹽和/或檸檬酸鹽，優(yōu)選檸檬酸鹽。其他適合的非磷酸鹽助洗劑包括多羧酸及其部分或完全中和鹽、單體型多羧酸和羥基羧酸及其鹽的均聚物和共聚物。在一些實(shí)施例中，上述化合物的鹽包括銨鹽和/或堿金屬鹽，即鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽，包括鈉鹽。適合的多元羧酸包括無環(huán)的、脂環(huán)族的、雜環(huán)的和芳香族的羧酸，其中在一些實(shí)施例中，它們可以包含至少兩個(gè)羧基基團(tuán)，這些羧基基團(tuán)在每種情況下彼此分離，在某些情況下被不超過兩個(gè)碳原子分離。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物含有至少一種螯合劑。適合的螯合劑包括但不限于銅、鐵和/或錳螯合劑及其混合物。在使用至少一種螯合劑的實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含以主題清潔組合物重量計(jì)從約0.1％至約15％或甚至從約3.0％至約10％的螯合劑。在一些又進(jìn)一步的實(shí)施例中，本文提供的清潔組合物包含至少一種沉積助劑。適合的沉積助劑包括但不限于聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸鹽；去污聚合物，例如聚對(duì)苯二甲酸；粘土，例如高嶺石、蒙脫石、硅鎂土、伊利石、膨潤(rùn)土和多水高嶺土；以及它們的混合物。如本文所示，在一些實(shí)施例中，抗再沉積劑可用于本發(fā)明的一些實(shí)施例中。在一些實(shí)施例中，可使用非離子表面活性劑。例如，在自動(dòng)餐具洗滌實(shí)施例中，非離子表面活性劑可用于表面改性目的(特別是用于薄片)以避免成膜和沾上污漬并且改善光澤。這些非離子表面活性劑還可用于防止土壤的再沉積。在一些實(shí)施例中，抗再沉積劑是本領(lǐng)域已知的非離子表面活性劑(參見例如ep2100949)。在一些實(shí)施例中，非離子表面活性劑可以是乙氧基化非離子表面活性劑，環(huán)氧樹脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性劑。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包括一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。適合的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮與n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。在使用至少一種染料轉(zhuǎn)移抑制劑的實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含以清潔組合物的重量計(jì)的從約0.0001％至約10％、從約0.01％至約5％、或甚至從約0.1％至約3％的該至少一種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。在一些實(shí)施例中，硅酸鹽包括在本發(fā)明的組合物內(nèi)。在一些這樣的實(shí)施例中，可使用硅酸鈉(例如，二硅酸鈉、偏硅酸鈉和結(jié)晶頁(yè)硅酸鹽)。在一些實(shí)施例中，硅酸鹽以從約1％至約20％的水平存在。在一些實(shí)施例中，硅酸鹽以按組合物的重量計(jì)的從約5％至約15％的水平存在。在一些又另外的實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物還含有分散劑。適合的水溶性有機(jī)材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個(gè)被不超過兩個(gè)碳原子彼此分開的羧基自由基。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，用于清潔組合物中的酶通過任何適合的技術(shù)來穩(wěn)定。在一些實(shí)施例中，本文使用的酶通過在向這些酶提供鈣和/或鎂離子的成品組合物中鈣和/或鎂離子的水溶性來源的存在來穩(wěn)定。在一些實(shí)施例中，酶穩(wěn)定劑包括寡糖、多糖和無機(jī)二價(jià)金屬鹽，包括堿土金屬，例如鈣鹽，例如甲酸鈣。預(yù)想用于酶穩(wěn)定化的各種技術(shù)將在本發(fā)明中使用。例如，在一些實(shí)施例中，本文使用的這些酶通過存在于為這些酶提供以下這樣的離子的成品組合物中的鋅(ii)、鈣(ii)和/或鎂(ii)離子的水溶性來源，連同其他金屬離子(例如，鋇(ii)、鈧(ii)、鐵(ii)、錳(ii)、鋁(iii)、錫(ii)、鈷(ii)、銅(ii)、鎳(ii)以及氧釩(iv))來穩(wěn)定。氯化物和硫酸鹽也可用于本發(fā)明的一些實(shí)施例中。適合的寡糖和多糖(例如糊精)的實(shí)施例是本領(lǐng)域已知的(參見例如wo07/145964)。在一些實(shí)施例中，根據(jù)需要還可使用可逆的蛋白酶抑制劑，例如含硼化合物(例如硼酸鹽、4-甲?；交鹚?和/或三肽醛來進(jìn)一步改善穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，漂白劑、漂白活化劑和/或漂白催化劑存在于本發(fā)明的組合物中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種無機(jī)和/或有機(jī)漂白化合物。無機(jī)漂白劑包括但不限于過氧化氫合物鹽(例如過硼酸鹽、過碳酸鹽、過磷酸鹽、過硫酸鹽和過硅酸鹽)。在一些實(shí)施例中，無機(jī)過氧化氫合物鹽是堿金屬鹽。在一些實(shí)施例中，包括的無機(jī)過氧化氫合物鹽為結(jié)晶固體，沒有另外的保護(hù)，盡管在一些其他實(shí)施例中，該鹽被包被。本領(lǐng)域已知的任何適合的鹽可用于本發(fā)明(參見例如ep2100949)。在一些實(shí)施例中，漂白活化劑用于本發(fā)明的組合物中。漂白活化劑通常為有機(jī)過酸前體，其在60℃及以下的溫度下在清潔過程中增強(qiáng)漂白作用。適合本文使用的漂白活化劑包括在過水解條件下給出優(yōu)選具有從約1至約10個(gè)碳原子，尤其是從約2至約4個(gè)碳原子的脂肪族過氧羧酸的化合物，和/或任選地取代的過氧苯甲酸。其他漂白活化劑是本領(lǐng)域已知的，并且可用于本發(fā)明(參見例如ep2100949)。另外，在一些實(shí)施例中并且如本文進(jìn)一步描述的，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含至少一種漂白催化劑。在一些實(shí)施例中，可使用錳三氮雜環(huán)壬烷和相關(guān)絡(luò)合物，以及鈷、銅、錳和鐵絡(luò)合物。另外的漂白催化劑可用于本發(fā)明(參見例如us4,246,612；5,227,084；4,810410；wo99/06521；和ep2100949)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種催化性金屬絡(luò)合物。在一些實(shí)施例中，可使用含金屬的漂白催化劑。在一些實(shí)施例中，金屬漂白催化劑包含一種催化體系，該催化體系包括：具有限定的漂白催化活性的過渡金屬陽(yáng)離子(例如銅、鐵、鈦、釕、鎢、鉬或錳陽(yáng)離子)，具有很少或不具有漂白催化活性的輔助金屬陽(yáng)離子(例如鋅或鋁陽(yáng)離子)，以及對(duì)于催化性和輔助性金屬陽(yáng)離子具有限定的穩(wěn)定性常數(shù)的螯合物，特別是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)及其水溶性鹽(參見例如us4,430,243)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物用錳化合物來催化。此類化合物和使用水平是本領(lǐng)域熟知的(參見例如us5,576,282)。在另外的實(shí)施例中，鈷漂白催化劑可用于本發(fā)明的清潔組合物中。各種鈷漂白催化劑是本領(lǐng)域已知的(參見例如us5,597,936和5,595,967)，并且通過已知的程序容易地制備。在一些另外的實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含大多環(huán)剛性配體(macropolycyclicrigidligand，mrl)的過渡金屬絡(luò)合物。作為實(shí)際問題而不當(dāng)作限制，在一些實(shí)施例中，對(duì)本發(fā)明提供的組合物和清潔方法進(jìn)行調(diào)節(jié)以在水性洗滌介質(zhì)中提供至少一億分之一數(shù)量級(jí)的活性mrl種類，并且在一些實(shí)施例中，在洗滌液中提供從約0.005ppm至約25ppm、更優(yōu)選地從約0.05ppm至約10ppm、以及最優(yōu)選地從約0.1ppm至約5ppm的mrl。在一些實(shí)施例中，在瞬時(shí)過渡金屬漂白催化劑中的過渡金屬包括但不限于錳、鐵和鉻。mrl還包括但不限于形成交聯(lián)橋接的特殊超剛性配體(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷)。適合的過渡金屬mrl通過已知的程序容易地制備(參見例如wo2000/32601和us6,225,464)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含金屬護(hù)理劑。金屬護(hù)理劑可用于預(yù)防和/或減少金屬的銹蝕、腐蝕和/或氧化，該金屬包括鋁、不銹鋼和非鐵金屬(例如銀和銅)。適合的金屬護(hù)理劑包括描述于ep2100949、wo9426860和wo94/26859中的那些)。在一些實(shí)施例中，金屬護(hù)理劑是鋅鹽。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明的清潔組合物包含以重量計(jì)從約0.1％至約5％的一種或多種金屬護(hù)理劑。在一些實(shí)施例中，清潔組合物是具有變體絲氨酸蛋白酶多肽蛋白酶的高密度液體(hdl)組合物。hdl液體衣物洗滌劑可以包含清潔表面活性劑(10％-40％)，該清潔表面活性劑包含：陰離子清潔表面活性劑，其選自以下：直鏈或支鏈或無規(guī)鏈，取代的或未取代的烷基硫酸鹽、烷基磺酸鹽、烷基烷氧基化硫酸鹽、烷基磷酸鹽、烷基膦酸鹽、烷基羧酸鹽、和/或其混合物；以及任選地非離子表面活性劑，其選自以下：直鏈或支鏈或無規(guī)鏈，取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如c8-c18烷基乙氧基化醇和/或c6-c12烷基苯酚烷氧基化物，任選地其中陰離子清潔表面活性劑(親水指數(shù)(hic)為從6.0至9)與非離子清潔表面活性劑的重量比大于1:1。該組合物可以任選地包含由兩親烷氧基化油脂清潔聚合物組成的表面活性增強(qiáng)聚合物，該兩親烷氧基化油脂清潔聚合物選自以下：具有支鏈親水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亞烷基亞胺(在0.05wt％-10wt％范圍內(nèi))和/或典型地包含含有選自以下的單體的親水主鏈的無規(guī)接枝聚合物：不飽和的c1-c6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖單元、烷氧基單元、馬來酸酐、飽和的多元醇(例如甘油)及其混合物；以及一個(gè)或多個(gè)疏水側(cè)鏈，該疏水側(cè)鏈選自：c4-c25烷基基團(tuán)、聚丙烯、聚丁烯、飽和的c2-c6單羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的c1-c6烷基酯及其混合物。該組合物可以包含另外的聚合物，例如去污聚合物，該去污聚合物包含例如陰離子封端的聚酯，例如srp1；處于無規(guī)或嵌段構(gòu)型的、含有至少一種單體單元的聚合物，該單體單元選自糖、二羧酸、多元醇及其組合；處于無規(guī)或嵌段構(gòu)型的、基于對(duì)苯二甲酸乙二醇酯的聚合物及其共聚物，例如repel-o-texsf、sf-2和srp6；texcaresra100、sra300、srn100、srn170、srn240、srn300和srn325；marloquestsl；抗再沉積聚合物(0.1wt％至10wt％，包括例如羧酸鹽聚合物，例如包含至少一種選自以下單體的聚合物：丙烯酸、馬來酸(或馬來酸酐)、富馬酸、衣康酸、烏頭酸、中康酸、檸康酸、亞甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或具有在500至100,000da范圍的分子量的聚乙二醇)；纖維素聚合物(包括例如烷基纖維素；烷基烷氧基烷基纖維素；羧基烷基纖維素；烷基羧基烷基纖維素，其實(shí)施例包括羧基甲基纖維素、甲基纖維素、甲基羥基乙基纖維素、甲基羧基甲基纖維素；及其混合物)；以及聚合羧酸酯(例如，像馬來酸酯/丙烯酸酯無規(guī)共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。該組合物可以進(jìn)一步包含飽和或不飽和脂肪酸，優(yōu)選飽和或不飽和的c12-c24脂肪酸(0wt％至10wt％)；處于無規(guī)或嵌段構(gòu)型的沉積助劑(包括例如多糖、纖維素聚合物、聚二烯丙基二甲基鹵化銨(dadmac))、以及dadmac與乙烯基吡咯烷酮的共聚物、丙烯酰胺、咪唑、鹵化咪唑啉及其混合物；陽(yáng)離子瓜爾膠；陽(yáng)離子纖維素，例如陽(yáng)離子羥基乙基纖維素；陽(yáng)離子淀粉；陽(yáng)離子聚丙烯酰胺；以及它們的混合物。該組合物可以進(jìn)一步包含染料轉(zhuǎn)移抑制劑，其實(shí)施例包括錳酞菁、過氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺n-氧化物聚合物、n-乙烯基吡咯烷酮和n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合劑，其實(shí)施例包括乙二胺四乙酸(edta)；二亞乙基三胺五亞甲基膦酸(dtpmp)；羥基-乙烷二膦酸(hedp)；乙二胺n,n'-二琥珀酸(edds)；甲基甘氨酸二乙酸(mgda)；二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)；丙二胺四乙酸(pdta)；2-羥基吡啶-n-氧化物(hpno)；或甲基甘氨酸二乙酸(mgda)；谷氨酸n,n-二乙酸(n,n-二羧基甲基谷氨酸四鈉鹽(glda)；次氮基三乙酸(nta)；4,5-二羥基間苯二磺酸；檸檬酸及其任何鹽；n-羥基乙基乙二胺三乙酸(hedta)、三亞乙基四胺六乙酸(ttha)、n-羥基乙基亞氨基二乙酸(heida)、二羥基乙基甘氨酸(dheg)、乙二胺四丙酸(edtp)及其衍生物。組合物可以包含酶穩(wěn)定劑(其實(shí)施例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制劑；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物例如4-甲?；交鹚?。該組合物可以進(jìn)一步包含硅樹脂或基于脂肪酸的泡沫抑制劑；調(diào)色染料、鈣和鎂陽(yáng)離子、視覺信號(hào)傳導(dǎo)成分、抗泡沫劑(0.001wt％至約4.0wt％)和/或結(jié)構(gòu)劑/增稠劑(0.01wt％至5wt％，選自：甘油二酸酯、甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纖維素、基于纖維素的材料、超細(xì)纖維素、生物聚合物、黃原膠、結(jié)冷膠、及其混合物)。適合的清潔表面活性劑還包括陽(yáng)離子清潔表面活性劑(選自以下：烷基吡啶化合物、烷基季銨化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性離子和/或兩性清潔表面活性劑(選自一組鏈烷醇胺磺基甜菜堿)；兩性表面活性劑；半極性非離子表面活性劑；及其混合物。該組合物可以是任何液體形式，例如液體或凝膠形式，或其任何組合。該組合物可以處于任何單位劑量形式，例如小袋。在一些實(shí)施例中，該清潔組合物是具有變體絲氨酸蛋白酶多肽蛋白酶的高密度粉末(hdd)組合物。該hdd粉末衣物洗滌劑可以包括清潔表面活性劑，其包括陰離子清潔表面活性劑(選自以下：直鏈或支鏈或無規(guī)鏈、取代或未取代的烷基硫酸鹽、烷基磺酸鹽、烷基烷氧基化硫酸鹽、烷基磷酸鹽、烷基膦酸鹽、烷基羧酸鹽和/或其混合物)；非離子清潔表面活性劑(選自以下：直鏈或支鏈或無規(guī)鏈、取代或未取代的c8-c18烷基乙氧基化物和/或c6-c12烷基苯酚烷氧基化物)；陽(yáng)離子清潔表面活性劑(選自以下：烷基吡啶化合物、烷基季銨化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性離子和/或兩性清潔表面活性劑(選自以下：鏈烷醇胺磺基甜菜堿)；兩性表面活性劑；半極性非離子表面活性劑及其混合物；助洗劑(無磷酸鹽助洗劑[例如沸石助洗劑，其實(shí)施例包括在0wt％至小于10wt％范圍內(nèi)的沸石a、沸石x、沸石p和沸石map]；磷酸鹽助洗劑[其實(shí)施例包括在0wt％至小于10wt％范圍內(nèi)的三聚磷酸鈉]；在小于15wt％范圍內(nèi)的檸檬酸、檸檬酸鹽和次氮基三乙酸或其鹽)；硅酸鹽(在0wt％至小于10wt％范圍內(nèi)的硅酸鈉或硅酸鉀或偏硅酸鈉)或?qū)訝罟杷猁}(sks-6))；碳酸鹽(在0wt％至小于10wt％范圍內(nèi)的碳酸鈉和/或碳酸氫鈉)；以及漂白劑(光漂白劑，其實(shí)施例包括磺化鋅酞菁、磺化鋁酞菁、呫噸染料及其混合物；疏水或親水漂白活化劑(其實(shí)施例包括十二烷酰基氧基苯磺酸鹽、癸酰基氧基苯磺酸鹽、癸?；趸郊姿峄蚱潲}、3,5,5-三甲基己?；趸交撬猁}、四乙?；叶?taed、和壬?；趸交撬猁}-nobs、腈季銨鹽(nitrilequats)、及其混合物；過氧化氫；過氧化氫源(無機(jī)過氧化氫合物鹽，其實(shí)施例包括過硼酸鹽、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽或過硅酸鹽的單或四水合鈉鹽)；預(yù)先形成的親水和/或疏水性過酸(選自：過羧酸和鹽，過碳酸和鹽，過亞胺酸和鹽，過氧單硫酸和鹽)及其混合物和/或漂白催化劑(例如亞胺漂白增效劑，其實(shí)施例包括亞胺陽(yáng)離子和聚離子；亞胺兼性離子；改性胺；改性氧化胺；n-磺酰亞胺；n-膦酰基亞胺；n-?；鶃啺?；噻二唑二氧化物；全氟亞胺；環(huán)狀糖酮及其混合物；含金屬的漂白催化劑，例如銅、鐵、鈦、釕、鎢、鉬或錳陽(yáng)離子以及輔助金屬陽(yáng)離子(例如鋅或鋁)以及螯合劑例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)及其水溶性鹽)。該組合物可以進(jìn)一步包含另外的洗滌劑成分，包括香料微囊劑、淀粉包封的香料協(xié)調(diào)劑、調(diào)色劑、包括織物完整性的另外的聚合物和陽(yáng)離子聚合物、染料鎖定成分、織物軟化劑、增白劑(例如c.i.熒光增白劑)、絮凝劑、螯合劑、烷氧基化多胺、織物沉積助劑和/或環(huán)糊精。在一些實(shí)施例中，該清潔組合物是具有本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的adw洗滌劑組合物。該adw洗滌劑組合物可以包含兩種或多種選自下組的非離子表面活性劑：乙氧基化非離子表面活性劑、醇烷氧基化表面活性劑、環(huán)氧封端的聚(氧基烷基化)醇或胺氧化物表面活性劑，它們以0％至10％(以重量計(jì))的量存在；在5％-60％的范圍內(nèi)的助洗劑，該助洗劑包括：磷酸鹽助洗劑(單磷酸鹽、二磷酸鹽、三聚磷酸鹽或低聚磷酸鹽)，優(yōu)選三聚磷酸鈉-stpp，或無磷酸鹽助洗劑[基于氨基酸的化合物，其實(shí)施例包括mgda(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其鹽和衍生物、glda(谷氨酸-n,n-二乙酸)及其鹽和衍生物、ids(亞氨基二琥珀酸)及其鹽和衍生物、羧基甲基菊粉及其鹽和衍生物及其混合物、次氮基三乙酸(nta)、二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)、b-丙氨酸二乙酸(b-ada)及其鹽]，多元羧酸及其部分或完全中和鹽的均聚物和共聚物，單體多元羧酸和羥基羧酸及其鹽，它們?cè)?.5重量％至50重量％的范圍內(nèi)；磺化/羧化聚合物(為產(chǎn)品提供尺寸穩(wěn)定性)，其在約0.1％至約50％(以重量計(jì))的范圍內(nèi)；在約0.1％至約10％(以重量計(jì))的范圍內(nèi)的干燥助劑(選自聚酯，特別是任選地與有助于縮聚作用的具有3至6個(gè)官能團(tuán)(特別是酸、醇或酯官能團(tuán))的另外的單體一起的陰離子聚酯，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有機(jī)硅氧烷化合物或其反應(yīng)性環(huán)狀碳酸酯和尿素型的前體化合物)；在從約1％至約20％(以重量計(jì))的范圍內(nèi)的硅酸鹽(硅酸鈉或硅酸鉀，例如二硅酸鈉、偏硅酸鈉和結(jié)晶頁(yè)硅酸鹽)；無機(jī)漂白劑(例如過氧化氫合物鹽例如過硼酸鹽、過碳酸鹽、過磷酸鹽、過硫酸鹽和過硅酸鹽)和有機(jī)漂白劑(例如有機(jī)過氧酸，包括二酰基和四?；^氧化物，特別是二過氧十二烷二酸、二過氧十四烷二酸和二過氧十六烷二酸)。漂白活化劑-有機(jī)過酸前體，其在約0.1％至約10％(以重量計(jì))范圍內(nèi)；漂白催化劑(選自錳三氮環(huán)壬烷及相關(guān)絡(luò)合物，co、cu、mn和fe雙吡啶胺及相關(guān)絡(luò)合物，以及五胺乙酸鈷(iii)及相關(guān)絡(luò)合物)；在從約0.1％至5％(以重量計(jì))的范圍內(nèi)的金屬護(hù)理劑(選自苯并三氮唑、金屬鹽和絡(luò)合物、和/或硅酸鹽)；每克自動(dòng)餐具洗滌劑組合物的從約0.01mg至5.0mg范圍內(nèi)的活性酶的酶(?；D(zhuǎn)移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜膠酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、軟骨素酶、角質(zhì)酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶、透明質(zhì)酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木質(zhì)素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果膠裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠酶、戊聚糖酶、過氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、還原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、和木糖苷酶、及其任何混合物)；以及酶穩(wěn)定劑組分(選自寡糖、多糖和無機(jī)二價(jià)金屬鹽)。在一些實(shí)施例中，該清潔組合物不含硼酸鹽。在一些實(shí)施例中，該清潔組合物不含磷酸鹽。有益地包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的代表性洗滌劑配制品包括在wo2013063460，第78-152頁(yè)中找到的洗滌劑配制品，并且特別是將第94至152頁(yè)的表格通過引用特此結(jié)合。絲氨酸蛋白酶通常以按組合物重量計(jì)的從0.00001％至10％的酶蛋白的水平摻入洗滌劑組合物中。在一些實(shí)施例中，洗滌劑組合物包含以組合物重量計(jì)超過0.0001％、0.001％、0.01％、或0.1％的絲氨酸蛋白酶。在一些實(shí)施例中，洗滌劑組合物包含以組合物重量計(jì)少于1％、0.1％、0.01％、或0.001％的絲氨酸蛋白酶。還提供了使用本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽處理織物(例如，使紡織品脫漿)的組合物和方法。織物處理方法是本領(lǐng)域中熟知的(參見例如，us6,077,316)。例如，可以通過包括使織物與溶液中的絲氨酸蛋白酶接觸的方法來改善織物的手感和外觀?？椢锟梢栽趬毫ο掠萌芤哼M(jìn)行處理。可以在紡織品的編織期間或之后或在脫漿階段期間或一個(gè)或多個(gè)另外的織物加工步驟中應(yīng)用本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。在紡織品的編織中，使線暴露于可觀的機(jī)械應(yīng)變。在機(jī)械織機(jī)上編織之前，常常用上漿淀粉或淀粉衍生物涂覆經(jīng)紗以增加其抗張強(qiáng)度并防止斷開。可以在編織期間或之后應(yīng)用本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶以除去上漿淀粉或淀粉衍生物。編織之后，可以在進(jìn)一步處理織物之前使用絲氨酸蛋白酶來除去漿涂層以確保均一和耐洗的結(jié)果。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可以單獨(dú)使用或與其他脫漿化學(xué)試劑和/或脫漿酶一起使用，以作為清潔添加劑(例如在水性組合物中)使織物(包括含棉的織物)脫漿。淀粉酶還可以用于在靛藍(lán)染色的牛仔織物和服裝上產(chǎn)生石磨的外觀的組合物和方法中使用。對(duì)于服裝生產(chǎn)而言，所述織物可被裁剪和縫制成為服裝或衣服，其隨后被精整(finish)。特別地，對(duì)于牛仔布的生產(chǎn)，開發(fā)了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脫漿步驟開始的，其中使衣服經(jīng)受淀粉水解酶的作用以為織物提供柔軟性，并且使棉更易于進(jìn)行隨后的酶促精整加工步驟。絲氨酸蛋白酶可以用于下列方法中：精整加工牛仔服裝(例如“生物磨砂方法”)、酶促脫漿并為織物提供柔軟性和/或精整加工方法。本文所述的絲氨酸蛋白酶多肽可進(jìn)一步用于酶輔助去除蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)來自動(dòng)物及其隨后的降解或處理，例如羽毛、皮膚、毛發(fā)、獸皮等。在一些情況下，與在滾燙的水或去毛工藝中的傳統(tǒng)浸泡相比，將動(dòng)物尸體浸泡在包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽的溶液中可以起到保護(hù)皮膚免受損傷的作用。在一個(gè)實(shí)施例中，羽毛可以在適合于消化或引發(fā)羽化退化的條件下用本發(fā)明的分離的絲氨酸蛋白酶多肽進(jìn)行噴霧。在一些實(shí)施例中，如上所述，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可以與氧化劑組合使用。在一些實(shí)施例中，通過使用本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽來輔助與未加工的羽毛相關(guān)的油或脂肪的去除。在一些實(shí)施例中，將絲氨酸蛋白酶多肽在用于清潔羽毛的組合物中使用，并且用來對(duì)纖維進(jìn)行消毒和部分脫水。在又其他實(shí)施例中，所公開的絲氨酸蛋白酶多肽可用于從羽毛中回收蛋白質(zhì)。在一些其他實(shí)施例中，在具有或沒有約0.5％(v/v)的表面活性劑的情況下，將絲氨酸蛋白酶多肽與95％乙醇或其他極性有機(jī)溶劑組合應(yīng)用于洗滌溶液中。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶多肽可用作包含絲氨酸蛋白酶及其變體的動(dòng)物飼料組合物、動(dòng)物飼料添加劑和/或?qū)櫸锸称返慕M分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備這樣一種動(dòng)物飼料組合物、動(dòng)物飼料添加劑組合物和/或?qū)櫸锸称返姆椒?，該方法包括將絲氨酸蛋白酶多肽與一種或多種動(dòng)物飼料成分和/或動(dòng)物飼料添加劑成分和/或?qū)櫸锸称烦煞诌M(jìn)行混合。此外，本發(fā)明涉及絲氨酸蛋白酶多肽在制備動(dòng)物飼料組合物和/或動(dòng)物飼料添加劑組合物和/或?qū)櫸锸称分械挠猛?。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括所有非反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該動(dòng)物是非反芻動(dòng)物，例如馬和單胃動(dòng)物。單胃動(dòng)物的實(shí)施例包括但不限于：豬(pig和swine)例如仔豬、生長(zhǎng)豬、母豬；家禽例如火雞、鴨子、小雞、肉仔雞、產(chǎn)卵雞；魚類例如鮭魚，鱒魚，羅非魚，鯰魚和鯉魚；以及甲殼類例如小蝦米和大蝦。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，動(dòng)物是反芻動(dòng)物，包括但不限于牛、小牛、山羊、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、北美野牛、駝鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、駱駝、羊駝、駱駝、羊駝、美洲駝、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。在當(dāng)下語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“寵物食品”旨在被理解為意指用于以下各項(xiàng)的食物：家庭動(dòng)物，例如但不限于狗、貓、沙鼠、倉(cāng)鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鳥類寵物，例如金絲雀、長(zhǎng)尾小鸚鵡和鸚鵡；爬行動(dòng)物寵物，例如海龜、蜥蜴和蛇；以及水生寵物，例如熱帶魚和青蛙。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物飼料組合物”、“飼料”(feedstuff和fodder)可互換地使用，并且包含選自以下的一種或多種飼料原料，該組包括：a)谷類，例如小粒谷物(例如小麥、大麥、黑麥、燕麥及其組合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)來自谷類的副產(chǎn)品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(distillersdriedgrainsolubles)(ddgs)(特別是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cddgs))、小麥麩、粗小麥粉、次麥粉、米糠、稻殼、燕麥殼、棕櫚仁和柑橘洛；c)獲自以下來源的蛋白質(zhì)：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、卡諾拉、魚粉、干血漿蛋白質(zhì)、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、乳清、干椰子肉、芝麻；d)獲自植物和動(dòng)物來源的油和脂肪；以及e)礦物質(zhì)和維生素。本文所述的蛋白酶多肽可進(jìn)一步用于紙漿(例如化學(xué)紙漿、半化學(xué)紙漿、牛皮紙漿、機(jī)械紙漿或通過亞硫酸鹽法制備的紙漿)的酶輔助漂白。一般來說，將紙漿與本發(fā)明的蛋白酶多肽在適合于漂白紙漿的條件下一起孵育。在一些實(shí)施例中，紙漿是不含氯的紙漿，該紙漿經(jīng)氧、臭氧、過氧化氫或過氧酸進(jìn)行漂白。在一些實(shí)施例中，蛋白酶多肽用于展示出低木質(zhì)素含量的紙漿的酶輔助漂白，該紙漿是通過經(jīng)改良的制漿方法或連續(xù)制漿方法生產(chǎn)的。在一些其他實(shí)施例中，蛋白酶多肽單獨(dú)地應(yīng)用或優(yōu)選地與木聚糖酶和/或內(nèi)切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纖維二糖水解酶組合應(yīng)用。本文所述的蛋白酶多肽可進(jìn)一步用于酶輔助去除蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)來自動(dòng)物及其隨后的降解或處理，例如羽毛、皮膚、毛發(fā)、獸皮等。在一些情況下，與在滾燙的水或去毛工藝中的傳統(tǒng)浸泡相比，將動(dòng)物尸體浸泡在包含本發(fā)明的蛋白酶多肽的溶液中可以起到保護(hù)皮膚免受損傷的作用。在一個(gè)實(shí)施例中，羽毛可以在適合于消化或引發(fā)羽化退化的條件下用本發(fā)明的分離的蛋白酶多肽進(jìn)行噴霧。在一些實(shí)施例中，如上所述，本發(fā)明的蛋白酶可以與氧化劑組合使用。在一些實(shí)施例中，通過使用本發(fā)明的蛋白酶多肽來輔助與未加工的羽毛相關(guān)的油或脂肪的去除。在一些實(shí)施例中，將蛋白酶多肽在用于清潔羽毛的組合物中使用，并且用來對(duì)纖維進(jìn)行消毒和部分脫水。在一些其他實(shí)施例中，在具有或沒有約0.5％(v/v)的表面活性劑的情況下，將蛋白酶多肽與95％乙醇或其他極性有機(jī)溶劑組合應(yīng)用于洗滌溶液中。在又其他實(shí)施例中，所公開的蛋白酶多肽可用于從羽毛中回收蛋白質(zhì)。所公開的蛋白酶多肽可以單獨(dú)使用或與合適的羽毛加工和蛋白水解方法(例如在pct/ep2013/065362、pct/ep2013/065363、和pct/ep2013/065364中公開的那些，其通過引用特此結(jié)合)組合使用。在一些實(shí)施例中，回收的蛋白質(zhì)隨后可以用于動(dòng)物或魚類飼料中。實(shí)施例提供以下實(shí)施例以證明和說明本公開的某些優(yōu)選實(shí)施例和方面，并且不應(yīng)被解釋為限制性的。在下面的實(shí)驗(yàn)公開中，應(yīng)用以下縮寫：adw(自動(dòng)餐具洗滌)；bmi(血液/奶/墨汁)；bsa(牛血清白蛋白)；caps(n-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)；ches(n-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)；dmc(二甲基酪蛋白)；hdd(重垢干型/粉型)；hdl(重垢液體)；hepes(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；mtp(微量滴定板)；nd(未完成)；od(光密度)；pcr(聚合酶鏈反應(yīng))；ppm(百萬分率)；qs(數(shù)量足夠)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù))；aapf(琥珀酰-ala-ala-pro-phe-對(duì)硝基苯胺)；tnbsa(2,4,6-三硝基苯磺酸)；v/v(體積比體積)；以及w/v(重量比體積)。實(shí)施例1蛋白質(zhì)測(cè)定方法通過標(biāo)準(zhǔn)無污漬成像儀(stainfreeimagercriterion)進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)無污漬成像儀法進(jìn)行定量。該方法基于無污漬預(yù)制page凝膠的應(yīng)用，其中每個(gè)條帶的強(qiáng)度將取決于在感興趣的蛋白質(zhì)中呈現(xiàn)的色氨酸殘基的量。用于page的criteriontmtgx(tris-甘氨酸延伸型)無污漬(stain-free)tm預(yù)制凝膠包括獨(dú)特的三鹵代化合物。這允許使用geldoctmez成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的快速熒光檢測(cè)。三鹵代化合物與uv誘導(dǎo)反應(yīng)中的色氨酸殘基反應(yīng)產(chǎn)生熒光，該熒光可以很容易地通過geldocez成像儀在凝膠內(nèi)檢測(cè)到。測(cè)定中使用的試劑：濃縮的(10x)laemmli樣品緩沖液(kem-en-tec公司，目錄#42556)；18或26孔標(biāo)準(zhǔn)tgx無污漬預(yù)制凝膠(伯樂公司(bio-rad)，分別為目錄#567-8124和567-8125)；和蛋白質(zhì)標(biāo)記“精密加蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(precisionplusproteinstandards)”(伯樂公司(bio-rad)，目錄#161-0363)。如下進(jìn)行測(cè)定：將25μl蛋白質(zhì)樣品和25μl0.5mhcl添加到96孔pcr板上，該pcr板在冰上持續(xù)10分鐘以滅活蛋白酶并防止自水解。在96孔pcr板中將50μl酸性蛋白質(zhì)混合物添加到含有0.385mgdtt的50μl樣品緩沖液中。之后，通過運(yùn)行緩沖液填充腔室，并設(shè)置凝膠盒。然后將每個(gè)樣品的10μl與標(biāo)記物一起加載到每個(gè)口袋中，并在200v下開始電泳持續(xù)35min。電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到成像儀中。使用成像實(shí)驗(yàn)室(imagelab)軟件來計(jì)算每個(gè)條帶的強(qiáng)度。通過已知標(biāo)準(zhǔn)樣品的蛋白的量和色氨酸含量，可以制作校準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)樣品的量可以通過將條帶強(qiáng)度和色氨酸數(shù)量外推到蛋白質(zhì)濃度來確定。使用蛋白質(zhì)定量方法來制備用于隨后實(shí)施例中所示的測(cè)定的bspe04637蛋白酶的樣品。n-末端和c-末端氨基酸測(cè)定在準(zhǔn)備序列確認(rèn)時(shí)，將分離的蛋白質(zhì)樣品在10kda旋轉(zhuǎn)過濾器中經(jīng)受一系列化學(xué)處理。通過尿素和dtt處理將樣品變性和減少。進(jìn)行了胍基化步驟將賴氨酸轉(zhuǎn)化為高精氨酸以保護(hù)賴氨酸側(cè)鏈免于乙?；?。然后使用碘乙酰胺進(jìn)行乙?；磻?yīng)僅修飾蛋白質(zhì)的n-末端殘基。然后將樣品與含有18o水的緩沖液混合，并且添加胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶用于消化。除了將保留天然16o的羧基末端之外，得到的肽將含有18o和16o的混合物。使用普羅克松(proxeon)納米lc系統(tǒng)，然后使用ltq軌道阱(orbitrap)(賽默飛世爾公司(thermofisher)高分辨率質(zhì)譜儀分離和分析消化產(chǎn)物，并且從肽的ms/ms片段譜和肽的同位素模式推導(dǎo)出氨基酸序列。實(shí)施例2絲氨酸蛋白酶bspe04637的發(fā)現(xiàn)和鑒定芽孢桿菌屬物種gx6638(atcc53278)被選為可用于工業(yè)應(yīng)用的酶的潛在來源。為了鑒定由芽孢桿菌屬物種gx6638產(chǎn)生的酶和編碼這些酶的基因，使用依諾米那測(cè)序通過合成(sbs)技術(shù)對(duì)芽孢桿菌屬物種gx6638的整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序。基因組測(cè)序和序列數(shù)據(jù)的集合由堿基清理(baseclear)(荷蘭萊頓市(leiden，thenetherlands))進(jìn)行。重疊群通過bioxpr(比利時(shí)那慕爾(namurnamur，belgium))進(jìn)行注釋。在芽孢桿菌屬物種gx6638菌株中以這種方式鑒定的基因中的一種編碼與各種其他細(xì)菌的絲氨酸蛋白酶顯示同源性的蛋白質(zhì)。該基因(bspe04637.n)的序列描繪在seqidno:1中：atgagaaaactactaaccttgttaacgttaagcattcttgtattttcgatggtagtaccaatgtcgattagtgctcaatcacaggcagaaaaacaggagtaccttgttcaatttaatgacaaggtaaataaggggatattaaacgcatttggtgtagataacagtgatgttcttcatacttacaatctactacctgttaatctagtaaaaatgacagagcagcaagcgaaagcattacaaaataatccgcatattaaagcggtggaacctaactttgaggcgcaagcattcgctcaaacagtaccgtggggagttcctcatgttcaaggtactgatgctcatgcagcggggcatactggaagtggtgtaaaagtagctatactcgatacgggaattgatcgaaatcatgaagatttaaatgtaagaggagggcactctgtattcacagacagtgcaaacagggatccttattacgatggtagtggtcatggcacgcacgttgctggaacagtagcggccttaaataatagtgtaggtgtgttaggtgtagcctacaacgcggagctatatgcggtaaaagtattaaataacagtggaagtggttcttatgcgggaatcgctgaaggaattgaatgggcagtacaaaacaatatggacattataaatatgagtttaggaggttcgatgagttcttctattttagaagagtggtgtaatattgcctacaattctggtgtgcttgtagtggcggcagctggaaatagtggacgtacgaatggccgaggggatactgttggttatccagcaaaatatgattctgttatcgcagtagcagcagttgattctagcaacaatcgtgcaagtttctctagtacaggacctgcagtggaaattgctgcaccaggtgtaaacattcttagtacgactcctggaaacagctatgcatcttacaacggaacttcgatggcatctccacatgtagctggtgtggcagcgcttgtcttggcagcgaatccgaacctttcaaacgtggagcttcgtaatcgattaaacgatacagcgcaaaacttaggagatgcaaaccactttggaaacggcctagtgcgtgcagttgatgccattaacggcactagctccggtgataacggtggcggaagcgaaccaacaaaaccaggtaacggcaaaggaaacggaagaaac。由bspe04637.n基因編碼的前酶原描繪在seqidno:2中。在n-末端，蛋白質(zhì)具有如通過signalp-nn(埃馬努埃爾松(emanuelsson)等人，自然試驗(yàn)方案(natureprotocols)(2007)2：953-971)預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度為25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。該信號(hào)肽序列在seqidno:2中加下劃線并以粗體顯示。信號(hào)肽的存在表明該絲氨酸蛋白酶是分泌的酶。該酶具有預(yù)測(cè)為72個(gè)氨基酸的前序列(以斜體顯示)。預(yù)測(cè)的完全加工的成熟鏈的序列(bspe04637，303個(gè)氨基酸)描繪在seqidno:3中。seqidno:2列出了絲氨酸蛋白酶前體bspe04637的氨基酸序列(信號(hào)肽序列加下劃線并以粗體顯示，前序列以斜體顯示)：aqtvpwgvphvqgtdahaaghtgsgvkvaildtgidrnhedlnvrgghsvftdsanrdpyydgsghgthvagtvaalnnsvgvlgvaynaelyavkvlnnsgsgsyagiaegiewavqnnmdiinmslggsmsssileewcniaynsgvlvvaaagnsgrtngrgdtvgypakydsviavaavdssnnrasfsstgpaveiaapgvnilsttpgnsyasyngtsmasphvagvaalvlaanpnlsnvelrnrlndtaqnlgdanhfgnglvravdaingtssgdngggseptkpgngkgngrn。seqidno:3列出了成熟蛋白酶bspe04637的預(yù)測(cè)氨基酸序列：aqtvpwgvphvqgtdahaaghtgsgvkvaildtgidrnhedlnvrgghsvftdsanrdpyydgsghgthvagtvaalnnsvgvlgvaynaelyavkvlnnsgsgsyagiaegiewavqnnmdiinmslggsmsssileewcniaynsgvlvvaaagnsgrtngrgdtvgypakydsviavaavdssnnrasfsstgpaveiaapgvnilsttpgnsyasyngtsmasphvagvaalvlaanpnlsnvelrnrlndtaqnlgdanhfgnglvravdaingtssgdngggseptkpgngkgngrn。實(shí)施例3絲氨酸蛋白酶swt183_1430046的發(fā)現(xiàn)和鑒定芽孢桿菌屬物種swt183(杜邦培養(yǎng)物保藏中心)也被選為可用于工業(yè)應(yīng)用的酶的潛在來源。為了鑒定由芽孢桿菌屬物種swt183產(chǎn)生的酶和編碼這些酶的基因，使用依諾米那測(cè)序通過合成(sbs)技術(shù)對(duì)芽孢桿菌屬物種swt183的整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序。基因組測(cè)序、序列數(shù)據(jù)的集合以及重疊群的注釋由堿基清理(baseclear)(荷蘭萊頓市(leiden，thenetherlands))進(jìn)行。在芽孢桿菌屬物種swt183菌株中以這種方式鑒定的基因中的一種編碼與bspe04637顯示同源性的蛋白質(zhì)。該基因swt183_1430046.n的序列描繪在seqidno:4中。seqidno:4列出了swt183_1430046.n基因的核苷酸序列：atgagaaaactactaaccttgttaacgttaagcatccttgtattttcgatgttagtaccaatgtcgattagtgcacaatcacaggcagaaaaacaggagtaccttgttcaatttaatgatcaggtgaataatggaatattaaatgcatttggtgtaaaagacagtgatgttcttcatacttacaatctactacctgtcaatctagtaaaaatgacagagcagcaagcgaaagcattacaaaataatccacatattaaagcggtggaacctaactttgaggcgcaagcattcgctcaaaccgtaccgtggggagttcctcatgttcaaggtaccgatgctcacgcagcggggcatactggaagtggtgtaaaagtagctatacttgatacgggaattgatcgaaatcatgaagatttaaacgtaagaggagggcattctgtatttacggacagtgcaaacagcgatccttattacgatggtagtggtcatggcacgcacgttgctggaacagtagcggcgttaaataatagtgtaggtgtgttaggtgtagcctacaatgcggaactgtatgcggtaaaagtattaaataacagtggaagtggttcttacgcaggaattgcacaagggattgaatgggcagttcaaaacaatatggacattattaatatgagcttaggaggttcgatgagttcttctattttagaagaatggtgtaacattgcttacaattctggtgtactagtagtggcagcagctggaaacagtggacgtacgaacggtcgaggagatactgtcggttatccagcaaaatatgattctgttatcgcagtagcagcagtcgattctagcaataaccgtgcaagcttctctagtacaggatctgcagtggagattgctgcaccaggtgtaaacattcttagcacaactcctggaaacagttacgcatcttacaacggaacttcgatggcatctccacatgtagctggtgtagcagcacttgtatgggcagcaaatccgaacctttcaaacgtggagctccgtaatcgattaaacgatacagcgcaaaacttaggtgatgcaaaccacttcggacacggcctagtccgtgcagtcgatgccattaacggcactagctccggtgataacggtggcggtgacgatggtggaagcggaccaacaaaaccaggtaacggcaaaggaaacggaaaaaactaa。由swt183_1430046.n基因編碼的前酶原描繪在seqidno:5中。在n-末端，蛋白質(zhì)具有如通過signalp-nn(埃馬努埃爾松(emanuelsson)等人，自然試驗(yàn)方案(natureprotocols)(2007)2：953-971)預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度為25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。該信號(hào)肽序列在seqidno:5中加下劃線并以粗體顯示。信號(hào)肽的存在表明該絲氨酸蛋白酶是分泌的酶。該酶具有預(yù)測(cè)為72個(gè)氨基酸的前序列(以斜體顯示)。預(yù)測(cè)的完全加工的成熟鏈的序列(swt183_1430046，307個(gè)氨基酸)描繪在seqidno:6中。seqidno:5列出了絲氨酸蛋白酶前體swt183_1430046的氨基酸序列(信號(hào)肽序列加下劃線并以粗體顯示，前序列以斜體顯示)：aqtvpwgvphvqgtdahaaghtgsgvkvaildtgidrnhedlnvrgghsvftdsansdpyydgsghgthvagtvaalnnsvgvlgvaynaelyavkvlnnsgsgsyagiaqgiewavqnnmdiinmslggsmsssileewcniaynsgvlvvaaagnsgrtngrgdtvgypakydsviavaavdssnnrasfsstgsaveiaapgvnilsttpgnsyasyngtsmasphvagvaalvwaanpnlsnvelrnrlndtaqnlgdanhfghglvravdaingtssgdngggddggsgptkpgngkgngkn。seqidno:6列出了成熟蛋白酶swt183_1430046的預(yù)測(cè)氨基酸序列：aqtvpwgvphvqgtdahaaghtgsgvkvaildtgidrnhedlnvrgghsvftdsansdpyydgsghgthvagtvaalnnsvgvlgvaynaelyavkvlnnsgsgsyagiaqgiewavqnnmdiinmslggsmsssileewcniaynsgvlvvaaagnsgrtngrgdtvgypakydsviavaavdssnnrasfsstgsaveiaapgvnilsttpgnsyasyngtsmasphvagvaalvwaanpnlsnvelrnrlndtaqnlgdanhfghglvravdaingtssgdngggddggsgptkpgngkgngkn。實(shí)施例4bspe04637的異源表達(dá)使用由枯草芽孢桿菌apre啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌apre信號(hào)肽序列、天然bspe04637蛋白酶原肽、成熟bspe04637蛋白酶和bpn'終止子組成的表達(dá)盒，在枯草芽孢桿菌中生產(chǎn)bspe04637蛋白酶。將該盒克隆到基于pbn的復(fù)制穿梭載體(巴貝(babe)等人(1998)，生物技術(shù)與應(yīng)用生物化學(xué)(biotechnol.appl.biochem.)27：117-124)中，并轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌株bg3594中。含有bspe04637基因(pbn-bspe04637)的pbn載體的圖顯示于圖1中。為了生產(chǎn)bspe04637，將含有pbn-bspe04637的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體在15ml福爾肯(falcon)管子中在具有10ppm新霉素的tsb(肉湯)中培養(yǎng)16小時(shí)，并且將300μl該預(yù)培養(yǎng)物添加到500ml燒瓶中，該燒瓶裝有補(bǔ)充有10ppm新霉素的30ml培養(yǎng)基(如下所述)。隨著在180rpm下的持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)混合，將這些燒瓶在32℃下孵育48小時(shí)。通過在錐形管中以14500rpm離心20分鐘來收獲培養(yǎng)物。將培養(yǎng)上清液用于測(cè)定。培養(yǎng)基是基于mop緩沖液的富集的半定義培養(yǎng)基，以尿素為主要氮源，以葡萄糖為主要碳源，并補(bǔ)充有1％大豆蛋白胨用于穩(wěn)健的細(xì)胞生長(zhǎng)。在質(zhì)粒pbn-bspe04637中bspe04637基因的核苷酸前成熟(prop-mature)序列描繪于seqidno:7中：caatcacaggcagaaaaacaggagtaccttgttcaatttaatgacaaggtaaataaggggatattaaacgcatttggtgtagataacagtgatgttcttcatacttacaatctactacctgttaatctagtaaaaatgacagagcagcaagcgaaagcattacaaaataatccgcatattaaagcggtggaacctaactttgaggcgcaagcattcgctcaaacagtaccgtggggagttcctcatgttcaaggtactgatgctcatgcagcggggcatactggaagtggtgtaaaagtagctatactcgatacgggaattgatcgaaatcatgaagatttaaatgtaagaggagggcactctgtattcacagacagtgcaaacagggacccttattacgatggtagtggtcatggcacgcacgttgctggaacagtagcggccttaaataatagtgtaggtgtgttaggtgtagcctacaacgcggagctatatgcggtaaaagtattaaataacagtggaagtggttcttatgcgggaatcgctgaaggaattgaatgggcagtacaaaacaatatggacattataaatatgagtttaggaggttcgatgagttcttctattttagaagagtggtgtaatattgcctacaattctggtgtgcttgtagtggcggcagctggaaatagtggacgtacgaatggccgaggggatactgttggttatccagcaaaatatgattctgttatcgcagtagcagcagttgattctagcaacaatcgtgcaagtttctctagtacaggacctgcagtggaaattgctgcaccaggtgtaaacattcttagtacgactcctggaaacagctatgcatcttacaacggaacttcgatggcatctccacatgtagctggtgtggcagcgcttgtcttggcagcgaatccgaacctttcaaacgtggagcttcgtaatcgattaaacgatacagcgcaaaacttaggagatgcaaaccactttggaaacggcctagtgcgtgcagttgatgccattaacggcactagctccggtgataacggtggcggaagcgaaccaacaaaaccaggtaacggcaaaggaaacggaagaaac。從質(zhì)粒pbn-bspe04637表達(dá)的bspe04637前體蛋白的氨基酸序列描繪于seqidno:8中(預(yù)測(cè)的前肽以加下劃線的文本顯示)：qsqaekqeylvqfndkvnkgilnafgvdnsdvlhtynllpvnlvkmteqqakalqnnphikavepnfeaqafaqtvpwgvphvqgtdahaaghtgsgvkvaildtgidrnhedlnvrgghsvftdsanrdpyydgsghgthvagtvaalnnsvgvlgvaynaelyavkvlnnsgsgsyagiaegiewavqnnmdiinmslggsmsssileewcniaynsgvlvvaaagnsgrtngrgdtvgypakydsviavaavdssnnrasfsstgpaveiaapgvnilsttpgnsyasyngtsmasphvagvaalvlaanpnlsnvelrnrlndtaqnlgdanhfgnglvravdaingtssgdngggseptkpgngkgngrn。如實(shí)施例1所述的n-末端和c-末端分析揭示從質(zhì)粒pbn-bspe04637表達(dá)的分離的bspe04637蛋白是截短型(280個(gè)氨基酸)，理論平均質(zhì)量為28.5kda)。bspe04637蛋白的截短形式的序列顯示于seqidno:9中：aqtvpwgvphvqgtdahaaghtgsgvkvaildtgidrnhedlnvrgghsvftdsanrdpyydgsghgthvagtvaalnnsvgvlgvaynaelyavkvlnnsgsgsyagiaegiewavqnnmdiinmslggsmsssileewcniaynsgvlvvaaagnsgrtngrgdtvgypakydsviavaavdssnnrasfsstgpaveiaapgvnilsttpgnsyasyngtsmasphvagvaalvlaanpnlsnvelrnrlndtaqnlgdanhfgnglvravdaingt。實(shí)施例5bspe04637的蛋白酶活性通過測(cè)量二甲基酪蛋白(dmc)底物的水解來測(cè)試bspe04637蛋白酶(seqidno:9)的蛋白酶活性。用于dmc測(cè)定的試劑溶液是：在100mm碳酸鈉(ph9.5)中的2.5％dmc(西格瑪公司(sigma))、在試劑a中的0.075％tnbsa(2,4,6-三硝基苯磺酸，賽默科技公司(thermoscientific))。試劑a：在15ml4nnaoh中的45.4gna2b4o7.10h2o(默克公司(merck))在mq水中達(dá)到1000ml的終體積，稀釋溶液：10mmnacl、0.1mmcacl2和0.005％吐溫(tween)-80。將蛋白酶上清液在稀釋溶液中稀釋至對(duì)于測(cè)定而言適當(dāng)?shù)臐舛取Ｏ?6孔微量滴定板(mtp)裝填95μldmc底物，隨后添加5μl稀釋的蛋白酶上清液。然后添加100μl在試劑a中的tnbsa，緩慢混合。使用spectramax板讀數(shù)器以動(dòng)力學(xué)方式在室溫下經(jīng)5min在405nm下測(cè)量活性。從值中減去不含蛋白酶的空白的吸光度。活性表達(dá)為mod/min。bspe04637的蛋白酶活性曲線顯示于圖2中。使用dmc測(cè)定，發(fā)現(xiàn)bspe04637蛋白酶的比活性為32mod/min/ppm。在相同的測(cè)定條件下，發(fā)現(xiàn)gg36和bpn’蛋白酶的比活性分別為54和23mod/min/ppm。實(shí)施例6bspe04637蛋白酶的ph曲線在含有50mmcacl2的50mm乙酸鹽/bis-tris/hepes/ches緩沖液中，使用偶氮酪蛋白作為底物研究bspe04637蛋白酶(seqidno:9)的蛋白水解活性的ph依賴性。在4至12之間的ph處，以1個(gè)ph單位增量測(cè)量活性。將一個(gè)普羅塔克森(protaxyme)ak片劑(梅格澤姆公司(megazyme)，愛爾蘭)與1.9ml適當(dāng)?shù)木彌_液和磁體一起添加到玻璃測(cè)試管中，隨后在裝有磁力攪拌器的溫度受控的水浴中在40℃下持續(xù)5min進(jìn)行溫和的水合作用。將新鮮制備的蛋白酶(在去離子水中稀釋至對(duì)于測(cè)定而言適當(dāng)?shù)臐舛?的100μl樣品添加到預(yù)水合的底物中，并在40℃下持續(xù)10min進(jìn)行反應(yīng)。為了終止反應(yīng)，添加10ml的2％w/vtris緩沖液(ph12)，混合溶液，并將樣品立即通過沃特曼(whatman)1號(hào)過濾器過濾。收集上清液，并且測(cè)量上清液在590nm處的吸光度以定量反應(yīng)的產(chǎn)物。減去來自僅有緩沖液的對(duì)照的吸光度，通過將在最佳ph處的活性定義為100％，將得到的值轉(zhuǎn)化為相對(duì)活性百分率。在本測(cè)定的條件下，確定bspe04637在6-12的ph范圍內(nèi)維持≥50％的活性。實(shí)施例7bspe04637蛋白酶的溫度曲線在含有50mmcacl2的50mm乙酸鹽/bis-tris/hepes/ches緩沖液(ph10)中，使用偶氮酪蛋白作為底物研究bspe04637蛋白酶(seqidno:9)的蛋白水解活性的溫度依賴性。在30℃和80℃之間的溫度下以10℃增量測(cè)量活性。將一個(gè)普羅塔克森(protaxyme)ak片劑(梅格澤姆公司(megazyme)，愛爾蘭)與1.9ml適當(dāng)?shù)木彌_液和磁體攪拌器一起添加到玻璃測(cè)試管中，隨后在裝有磁力攪拌器的溫度受控的水浴中在設(shè)定溫度下持續(xù)5min進(jìn)行溫和的水合作用。將新鮮制備的蛋白酶(在去離子水中稀釋至對(duì)于測(cè)定而言適當(dāng)?shù)臐舛?的100μl樣品添加到預(yù)水合的底物中，并在30℃和80℃之間的溫度下持續(xù)10min進(jìn)行反應(yīng)。為了終止反應(yīng)，添加10ml的2％w/vtris緩沖液(ph12)且混合溶液，并且立即通過沃特曼(whatman)1號(hào)過濾器過濾。收集上清液，并且測(cè)量上清液在590nm處的吸光度以定量反應(yīng)的產(chǎn)物。從每個(gè)樣品讀數(shù)中減去來自僅有緩沖液的對(duì)照的吸光度，通過將在最佳溫度下的活性定義為100％，將得到的值轉(zhuǎn)化為相對(duì)活性百分率。在本測(cè)定條件下，確定bspe04637在60℃-80℃的范圍內(nèi)保持≥50％的活性。實(shí)施例8蛋白酶的穩(wěn)定性評(píng)估在各種條件下確定bspe04637(seqidno:9)和fna(seqidno:10)蛋白酶的穩(wěn)定性。seqidno:10列出了fna蛋白酶的序列：aqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavidsgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnnshgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvlgadgsgqyswiingiewaiannmdvinmslggpsgsaalkaavdkavasgvvvvaaagnegtsgssstvgypgkypsviavgavdssnqrasfssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngtsmasphvagaaalilskhpnwtntqvrsslentttklgdsfyygkglinvqaaaq。在設(shè)置溫度下孵育后通過測(cè)量殘留的蛋白水解活性，在以下顯示的四個(gè)脅迫條件下測(cè)試穩(wěn)定性。las/edta：0.02％las，2.1mmedta在50mmhepes(ph8)中，0.005％吐溫80omohdl：10％omo克萊因(klein)與克拉克蒂格(krachtig)(洗滌劑中存在的蛋白酶在使用前滅活)對(duì)于脅迫條件，將稀釋的酶樣品在96孔pcr板中的脅迫緩沖液/洗滌劑中混合，并使用tetrad2熱循環(huán)儀，在30℃、40℃、50℃、60℃和75℃下孵育20min。對(duì)于非脅迫條件，在與脅迫培養(yǎng)基混合后立即測(cè)定酶以建立基線(初始活性)。在脅迫和非脅迫條件下的蛋白酶活性通過先前描述的aapf-pna或dmc底物測(cè)定的水解來測(cè)量。百分比殘留活性是通過取每個(gè)溫度下的脅迫與非脅迫活性的比例并將其乘以100來計(jì)算的。對(duì)于在各種溫度下運(yùn)行的每種條件，每種蛋白酶的百分比剩余活性顯示于表1-2中。實(shí)施例9bspe04637蛋白酶與相關(guān)分子的比較鑒定同源蛋白酶針對(duì)ncbi非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用bspe04637蛋白酶(seqidno:9)和swt183_1430046蛋白酶(seqidno:6)的成熟蛋白質(zhì)氨基酸序列通過blast搜索(阿特休爾(altschul)等人，核酸研究(nucleicacidsres)，25：3389-402，1997)鑒定相關(guān)蛋白質(zhì)，并且子集分別顯示于表3a和4a中。針對(duì)基因組查詢專利(genomequestpatent)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用bspe04637蛋白酶(seqidno:9)和swt183_1430046蛋白酶(seqidno:6)的成熟蛋白質(zhì)氨基酸序列作為查詢序列，將搜索參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值進(jìn)行類似的搜索，并且子集分別顯示于表3b和4b中。將兩個(gè)搜索集的百分比同一性(pid)定義為相同殘基的數(shù)量除以成對(duì)比對(duì)中經(jīng)比對(duì)殘基的數(shù)量。表上標(biāo)有“序列長(zhǎng)度”的值對(duì)應(yīng)于以所列出的登錄號(hào)提及的蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度(以氨基酸計(jì))，而“比對(duì)長(zhǎng)度”是針對(duì)用于比對(duì)和pid計(jì)算的序列。同源序列的比對(duì)成熟bspe04637蛋白酶(seqidno:9)和成熟swt183_1430046蛋白酶(seqidno:6)的氨基酸序列與來自表3a和4a的所選枯草桿菌蛋白酶的成熟形式的序列的比對(duì)顯示于圖3中。使用來自geneious軟件(生物物質(zhì)有限公司(biomattersltd.))(羅伯特(robert)c.埃德加(edgar)，muscle：具有高精確度和高通量的多序列比對(duì)(muscle:multisequencealignmentwithhighaccuracyandhighthroughput)，核酸研究(nucleicacidsres.)(2004)32(5)：1792-1797)的muscle程序使用默認(rèn)參數(shù)來比對(duì)這些序列。使用geneious樹構(gòu)建程序構(gòu)建了圖5中枯草桿菌蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，并且在圖3中列出。實(shí)施例10枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝的獨(dú)特特征針對(duì)枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝內(nèi)的獨(dú)特序列相似性，對(duì)圖3的比對(duì)進(jìn)行了綜述。枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝的特征在于根據(jù)bspe04637編號(hào)以絲氨酸蛋白酶三聯(lián)體的催化性天冬氨酸(d32)開始并且以催化三聯(lián)體的催化性組氨酸(h66)結(jié)束的序列的共有基序。當(dāng)與bpn'的氨基酸序列相比時(shí)，該基序包括2個(gè)氨基酸殘基的一個(gè)插入。該基序可以由以下基序進(jìn)行表征：基序1：dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:31)，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸；基序2：dtgixxxhxdlxxxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:32)，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸；基序3：dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:33)，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸；基序4：dtgixxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:34)，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸；基序5：dtgidxxhxdlnvxggxsvfxxxxxxxxxxdxxgh(seqidno:35)，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸；基序6：dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpxxdxxgh(seqidno:36)，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸，末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸；或基序7：dtgidxnhxdlnvrggxsvftxxxxxdpyydxxgh(seqidno:37)，其中初始d是活性位點(diǎn)天冬氨酸且末端h是活性位點(diǎn)組氨酸，并且x是任何氨基酸。圖3包括圍繞基序的框。預(yù)期插入發(fā)生在枯草桿菌蛋白酶的總體三級(jí)折疊共同的環(huán)中。使用枯草桿菌蛋白酶bpn'的已知結(jié)構(gòu)作為參考，在圖5中示出了插入的位置。使用bpn'枯草桿菌蛋白酶結(jié)構(gòu)作為參照(淺灰色)，以黑色突出顯示基序區(qū)段。所有絲氨酸蛋白酶共有的催化三聯(lián)體的催化性天冬氨酸和組氨酸殘基側(cè)鏈顯示為棒。連接枯草桿菌蛋白酶催化三聯(lián)體的催化性天冬氨酸(d32)和組氨酸(h66)(基于bspe04637編號(hào))的片段包含兩個(gè)環(huán)和中央β片層的最外鏈。該鏈包含bspe04637進(jìn)化枝基序的ggxs部分，并在圖5中由箭頭指示。提出插入發(fā)生在由箭頭指示的環(huán)中，其中插入放大的第二環(huán)。含有插入的環(huán)在ggxs鏈后并引入催化性組氨酸?；谏衔牧谐龅墓蚕硇蛄谢蛞呀?jīng)被鑒定為枯草桿菌蛋白酶的bspe04637進(jìn)化枝的bspe04637、swt183_1430046、和bad02409枯草桿菌蛋白酶也在使用各種細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶構(gòu)建的并在圖4中列出的系統(tǒng)發(fā)育樹中聚集在一起。雖然已經(jīng)顯示并在本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，僅通過舉例的方式來提供這樣的實(shí)施例對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。在不偏離本發(fā)明的情況下，許多變化、改變和替換將是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能想到的。應(yīng)當(dāng)理解，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)可以采用本文所述的本發(fā)明的實(shí)施例的各種替代方案。以下權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，并且在這些權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)涵蓋在其中。當(dāng)前第1頁(yè)12