一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法與流程

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法。

背景技術(shù)：

維生素K₂(Menaquinone，MK，VK₂)是一類甲萘醌類化合物的統(tǒng)稱，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，根據(jù)C-3側(cè)鏈上異戊二烯單元的個(gè)數(shù)，MK可分為14種，以MK-n表示(n＝1-14)。研究表明，維生素K₂不僅可以促進(jìn)血液凝固，增加骨鈣素合成，而且還可降低患肝癌和前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。最近的研究表明，維生素K₂還可用于帕金森氏綜合癥及肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥的輔助治療。維生素K2的安全性已經(jīng)得到中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局、美國(guó)藥品研究所、美國(guó)FDA及歐盟理事會(huì)和歐洲議會(huì)的認(rèn)定?，F(xiàn)在，歐盟已將維生素K₂作為一種功能性食品，在美國(guó)，有關(guān)VK₂的藥用研究也已進(jìn)入了臨床三期階段。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展、人民生活水平的提高以及人口進(jìn)入老齡化階段，高純度的維生素K₂無(wú)論作為一種保健品還是藥品，都具有廣泛的需求。

維生素K₂生產(chǎn)菌株主要包括革蘭氏陽(yáng)性菌中的納豆芽孢桿菌(Bacilus subtilis)和革蘭氏陰性菌中的黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)。其中，納豆芽孢桿菌主要產(chǎn)維生素K2，又因其菌體本身為益生菌，所產(chǎn)的維生素K₂也具有較高的產(chǎn)量和較好的生物相容性，因此，是發(fā)酵生產(chǎn)維生素K₂的優(yōu)良菌種。

因此，研究適合于從納豆芽孢桿菌發(fā)酵液中分離純化維生素K₂的一整套工業(yè)化方法，對(duì)于VK₂的產(chǎn)業(yè)化，對(duì)于改善人民生活質(zhì)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法主要或者集中于某一步的研究(Aydin Berenjian et al.Appl Biochem Biotechnol,2014,172:1347-1357；Sato et al.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2001,26(3),115-120；Yanagisawa,et al.Journal of Food Biochemistry,2005,29(3),267-277)，或者集中于實(shí)驗(yàn)室的樣品檢測(cè)(Patrick J.et al.Journal of lipid research,1971,12:442-449；Hiroyuki Wakabayashi et al.Nutrition,2003,19:661-665；)。目前，國(guó)內(nèi)僅有專利CN104262129B公開了一種納豆枯草芽孢桿菌以及由該菌株提純維生素甲萘醌-7的方法。而國(guó)外尚未見此類報(bào)道。本發(fā)明更系統(tǒng)性、詳細(xì)地公開了一種從納豆芽孢桿菌發(fā)酵液中提取分離純化維生素K₂(VK₂)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具備產(chǎn)品純度高、生物活性高、回收率高，分離純化工藝操作簡(jiǎn)單、條件溫和、處理能力大，各有機(jī)溶劑可回收利用以及便于工業(yè)化應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)的分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法，包括如下步驟：

(1)維生素K₂萃取液的獲取

以納豆芽孢桿菌發(fā)酵液為維生素K₂提取原液，離心獲取菌體，烘干后，采用第一有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取以獲取維生素K₂萃取液；

(2)維生素K₂上柱原液的獲取

將維生素K₂萃取液通過(guò)膜分離設(shè)備除去不溶性雜質(zhì)，將獲得的維生素K₂濾液蒸干，然后以極性有機(jī)溶劑重溶，獲取維生素K₂上柱原液；

(3)低純度的維生素K₂濃縮液的獲取

將維生素K₂上柱原液通過(guò)大孔吸附樹脂柱吸附，采用濕法或干法上柱，然后以第二有機(jī)溶劑清洗，最后用第三有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，收集相應(yīng)洗脫液并對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而獲取低純度的維生素K₂濃縮液；

(4)較高純度的維生素K₂濃縮液的獲取

將低純度的維生素K₂濃縮液經(jīng)過(guò)分子量排阻層析柱純化，然后以第四有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，收集相應(yīng)洗脫液并對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而獲取較高純度的維生素K₂濃縮液；

(5)高純度的維生素K₂的獲取

將較高純度的維生素K₂濃縮液溶解于第五有機(jī)溶劑后，通過(guò)反相硅膠柱分離，然后用第六有機(jī)溶劑洗脫并分段收集，即可獲得高純度的維生素K₂；

(6)維生素K₂晶體的獲取

以第七有機(jī)溶劑將維生素K₂高溫溶解，低溫結(jié)晶，并重結(jié)晶，即可獲得維生素K₂晶體。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的組成為：大豆粉65g/L，玉米粉60g/L，蛋白胨50g/L；所述發(fā)酵液的發(fā)酵周期為7-9天。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中萃取條件為：萃取方式為靜置萃取或者攪拌萃取，萃取時(shí)間20min-60min，萃取次數(shù)為1-3次，用于萃取的第一有機(jī)溶劑為乙醇、正丁醇、乙酸、二氯甲烷、異戊醇、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氯化碳、丙酮、乙醚、甲苯中的一種或多種的混合液。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中膜分離設(shè)備的膜孔徑≤0.45μm，所述極性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、丙酮、水中的一種或幾種的混合液。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中大孔吸附樹脂為非極性和/或弱極性大孔吸附樹脂，所述上柱條件為：高徑比為3-10:1，流速為0.025-0.110倍柱體積/min。

優(yōu)選地，所述大孔吸附樹脂為芳香族吸附劑。

優(yōu)選地，所述步驟(4)中分子量排阻層析填料所排阻的物質(zhì)的分子量為400Da-1000Da；所述填料可分別做柱或分幾段裝于同一個(gè)分子量排阻層析柱中，層析液按照填料排阻極限由小到大或由大到小的順序依次經(jīng)過(guò)柱填料；所述分子量排阻層析柱高徑比為10-25:1，流速為0.004-0.010倍柱體積/min，層析柱高度與維生素K₂濃縮液上液高度比為35-50:1。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中第二有機(jī)溶劑為極性有機(jī)溶劑，用量為大孔吸附樹脂柱柱體積的1-3倍；所述第三有機(jī)溶劑為二氯甲烷、正丁醇、異丁醇、甲苯、庚烷、環(huán)戊烷、環(huán)己烷、正己烷、石油醚、正戊烷、異戊烷中的一種或幾種的混合液，用量為柱體積的1-4倍；所述步驟(4)中第四有機(jī)溶劑為苯、甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮類、二氯甲烷、二氯代苯、四氯乙烯、四氫呋喃和三氯代苯中的一種或幾種的混合液，其用量為分子量排阻層析柱柱體積的1-4倍。

優(yōu)選地，所述步驟(5)中第五有機(jī)溶劑與第六有機(jī)溶劑為極性或弱極性有機(jī)溶劑，為甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、丙醇、乙酸丁酯、正丁醇、二氯甲烷、異丁醇中的一種或幾種的混合液；所述反相硅膠柱的硅膠粒徑為10-80μm，高徑比為5-25:1，流速為0.015-0.065倍柱體積/min，柱高與較高純度的維生素K₂濃縮液上液高度比為7-30:1。

優(yōu)選地，所述步驟(6)中第七有機(jī)溶劑為含有一定超純水的甲醇或者乙醇；所述超純水的含量為0-30％；所述的高溫溫度范圍為40-85℃，低溫溫度范圍為-40-0℃。

優(yōu)選地，所述濃縮方法為減壓濃縮，減壓濃縮溫度為40-99℃，真空度小于-0.08MPa；所述蒸干方法為減壓蒸干。

優(yōu)選地，所述低純度的維生素K₂濃縮液的純度為小于50％，較高純度的維生素K₂濃縮液的純度為50-80％，高純度的維生素K₂的純度為大于80％。

優(yōu)選地，所述維生素K₂晶體的純度為大于或等于98.2％。

優(yōu)選地，所述維生素K₂回收率大于85％。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)獲得的維生素K₂晶體產(chǎn)品純度高、生物活性高、回收率高；(2)分離純化工藝操作簡(jiǎn)單、條件溫和、處理能力大；(3)各有機(jī)溶劑可回收利用，便于工業(yè)化應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1-3提供的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法的流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法的不同有機(jī)溶劑萃取維生素K₂效率圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3提供的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法的發(fā)酵樣品萃取液HPLC液相圖譜圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例3提供的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法的發(fā)酵樣品純化后HPLC液相圖譜圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法，如圖1所示，包括如下步驟：

(1)維生素K₂萃取液的獲取

以納豆芽孢桿菌發(fā)酵液為維生素K₂提取原液，離心獲取菌體，烘干后，采用乙醇進(jìn)行萃取以獲取維生素K₂萃取液；其中萃取方式為靜置萃取，萃取時(shí)間20min，萃取次數(shù)為1次。

(2)維生素K₂上柱原液的獲取

將維生素K₂萃取液通過(guò)膜分離設(shè)備(膜孔徑≤0.45μm)除去不溶性雜質(zhì)，將獲得的維生素K₂濾液減壓蒸干，然后以甲醇重溶，獲取維生素K₂上柱原液；

(3)低純度的維生素K₂濃縮液的獲取

將維生素K₂上柱原液通過(guò)大孔吸附樹脂柱吸附(芳香族吸附劑)，采用濕法上柱(上柱條件為：高徑比為3:1，流速為0.025倍柱體積/min)，然后以極性有機(jī)溶劑清洗(用量為大孔吸附樹脂柱柱體積的1倍)，最后用二氯甲烷進(jìn)行洗脫(用量為大孔吸附樹脂柱柱體積的1倍)，收集相應(yīng)洗脫液并對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而獲取低純度的維生素K₂濃縮液(純度小于50％)；

(4)較高純度的維生素K₂濃縮液的獲取

將低純度的維生素K₂濃縮液經(jīng)過(guò)分子量排阻層析柱純化，然后以苯進(jìn)行洗脫(其用量為分子量排阻層析柱柱體積的1倍)，收集相應(yīng)洗脫液并對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而獲取較高純度的維生素K₂濃縮液(純度為50-80％)；

其中，所述分子量排阻層析填料所排阻的物質(zhì)的分子量為400Da-1000Da；所述填料可分別做柱或分幾段裝于同一個(gè)分子量排阻層析柱中，層析液按照填料排阻極限由小到大或由大到小的順序依次經(jīng)過(guò)柱填料；所述分子量排阻層析柱高徑比為10:1，流速為0.004倍柱體積/min，層析柱高度與維生素K₂濃縮液上液高度比為35:1；

(5)高純度的維生素K₂的獲取

將較高純度的維生素K₂濃縮液溶解于甲醇后，通過(guò)反相硅膠柱(反相硅膠柱的硅膠粒徑為10μm，高徑比為5:1，流速為0.015倍柱體積/min，柱高與較高純度的維生素K₂濃縮液上液高度比為7:1)分離，然后用甲醇洗脫并分段收集，即可獲得高純度的維生素K₂(純度大于80％)；

(6)維生素K₂晶體的獲取

以分析純的甲醇將維生素K₂于40℃高溫溶解，-40℃低溫結(jié)晶，并重結(jié)晶，即可獲得維生素K₂晶體(純度大于或等于98.2％)。

優(yōu)選地，所述濃縮方法為減壓濃縮，所述減壓濃縮的溫度為40℃，真空度小于-0.08MPa。

實(shí)施例2

一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法，如圖1所示，包括如下步驟：

(1)維生素K₂萃取液的獲取

以納豆芽孢桿菌發(fā)酵液為維生素K₂提取原液，離心獲取菌體，烘干后，采用甲苯進(jìn)行萃取以獲取維生素K₂萃取液；其中萃取方式為靜置萃取，萃取時(shí)間60min，萃取次數(shù)為3次。

(2)維生素K₂上柱原液的獲取

將維生素K₂萃取液通過(guò)膜分離設(shè)備(膜孔徑≤0.45μm)除去不溶性雜質(zhì)，將獲得的維生素K₂濾液減壓蒸干，然后以丙酮重溶，獲取維生素K₂上柱原液；

(3)低純度的維生素K₂濃縮液的獲取

將維生素K₂上柱原液通過(guò)非極性大孔吸附樹脂柱吸附，采用干法上柱(上柱條件為：高徑比為10:1，流速為0.110倍柱體積/min)，然后以極性有機(jī)溶劑清洗(用量為大孔吸附樹脂柱柱體積的3倍)，最后用異戊烷進(jìn)行洗脫(用量為大孔吸附樹脂柱柱體積的4倍)，收集相應(yīng)洗脫液并對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而獲取低純度的維生素K₂濃縮液(純度小于50％)；

(4)較高純度的維生素K₂濃縮液的獲取

將低純度的維生素K₂濃縮液經(jīng)過(guò)分子量排阻層析柱純化，然后以三氯代苯進(jìn)行洗脫(其用量為分子量排阻層析柱柱體積的4倍)，收集相應(yīng)洗脫液并對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而獲取較高純度的維生素K₂濃縮液(純度為50-80％)；

其中，所述分子量排阻層析填料所排阻的物質(zhì)的分子量為400Da-1000Da；所述填料可分別做柱或分幾段裝于同一個(gè)分子量排阻層析柱中，層析液按照填料排阻極限由小到大或由大到小的順序依次經(jīng)過(guò)柱填料；填充得到的分子量排阻層析柱高徑比為25:1，流速為0.010倍柱體積/min，層析柱高度與維生素K₂濃縮液上液高度比為50:1；

(5)高純度的維生素K₂的獲取

將較高純度的維生素K₂濃縮液溶解于丙酮后，通過(guò)反相硅膠柱(反相硅膠柱的硅膠粒徑為80μm，高徑比為25:1，流速為0.065倍柱體積/min，柱高與較高純度的維生素K₂濃縮液上液高度比為30:1)分離，然后用丙酮洗脫并分段收集，即可獲得高純度的維生素K₂(純度大于80％)；

(6)維生素K₂晶體的獲取

以含有30％超純水的甲醇將維生素K₂于85℃高溫溶解，0℃低溫結(jié)晶，并重結(jié)晶，即可獲得維生素K₂晶體(純度大于98.2％)。

優(yōu)選地，所述濃縮方法為減壓濃縮，所述減壓濃縮的溫度為99℃，真空度小于-0.08MPa。

實(shí)施例3

一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K₂的方法，如圖1所示，包括如下步驟：

(1)維生素K₂萃取液的獲取

以納豆芽孢桿菌發(fā)酵液(組成為：大豆粉65g/L，玉米粉60g/L，蛋白胨50g/L，發(fā)酵周期為：7-9天)為維生素K₂提取原液，離心獲取菌體，烘干后，按照以下步驟提取：

①稱取1.0g干菌體若干份于50ml的離心管中，分別加入5ml不同的有機(jī)溶劑靜置萃取50min，萃取2次，做3個(gè)平行樣；其中不同的有機(jī)溶劑分別為甲醇、乙醇、1,3丙二醇、正丁醇、乙酸、二氯甲烷、異戊醇、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氯化碳、丙酮、乙醚、甲苯；

②將獲得的萃取液定容至5ml，獲得檢測(cè)液；

③用HPLC法(流動(dòng)相：甲醇:二氯甲烷＝4:1，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)248nm)分別檢測(cè)各萃取液中維生素K₂的濃度含量，其中圖3為以正丁醇為萃取劑時(shí)發(fā)酵樣品中維生素K₂的HPLC液相圖譜圖，圖2為繪制而成的不同有機(jī)溶劑萃取維生素K₂效率圖，其中甲醇與1,3丙二醇的萃取效率極低，后期試驗(yàn)中將不作為相應(yīng)萃取劑的選擇；

(2)維生素K₂上柱原液的獲取

將維生素K₂萃取液通過(guò)膜分離設(shè)備(膜孔徑≤0.45μm)除去不溶性雜質(zhì)，將獲得的維生素K₂濾液減壓蒸干，然后以甲醇重溶，獲取維生素K₂上柱原液；

(3)低純度的維生素K₂濃縮液的獲取

①稱取一定量的大孔吸附樹脂，以95％乙醇浸泡過(guò)夜后，濕法上柱，并以95％的乙醇沖洗至流出液與蒸餾水的混合液(1:5，V/V)無(wú)渾濁為止，然后以2倍柱體積的甲醇沖洗柱子，制成的層析柱高徑比為6:1；

②量取一定量的維生素K₂甲醇溶液上柱，以0.0283倍柱體積/min的流速過(guò)柱，然后以相同的流速用2倍柱體積的甲醇清洗柱子，之后以相同的流速用2倍柱體積的正己烷洗脫維生素K₂；

③重復(fù)步驟2兩次，作為平行實(shí)驗(yàn)，獲得第二次、第三次維生素K2洗脫液；

測(cè)量各維生素K₂洗脫液的體積，用HPLC法(流動(dòng)相：甲醇:二氯甲烷＝4:1，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)248nm)檢測(cè)各洗脫液中維生素K₂的含量及油脂性雜質(zhì)情況，計(jì)算維生素K₂的回收率，接著，合并相應(yīng)洗脫液并其進(jìn)行濃縮，從而獲取低純度(純度小于50％)的維生素K₂濃縮液；

其中，獲得的低純度的維生素K₂濃縮液不含或含極少量的油脂類極性雜質(zhì)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)<5％)，并且，維生素K₂的回收率經(jīng)計(jì)算為80％-99％；

(4)較高純度的維生素K₂濃縮液的獲取

①稱取一定量的分子量排阻色譜填料(排阻極限為1000Da)預(yù)處理后，濕法上柱，以2倍柱體積的四氫呋喃沖洗柱子，制成的層析柱高徑比為17:1；

②將低純度的維生素K₂濃縮液經(jīng)四氫呋喃溶液重溶，量取一定體積的維生素K₂四氫呋喃溶液上柱，并以四氫呋喃沖洗柱子，流速為0.0056倍柱體積/min，層析柱高度與維生素K₂濃縮液上液高度之比為46:1；

③分段收集各截留段并對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而獲取較高純度(純度為50-80％)的維生素K₂濃縮液，其中以HPLC法檢測(cè)各截留段中維生素K₂的濃度；

④稱取一定量的分子量排阻色譜填料(排阻極限為400Da)預(yù)處理后，濕法上柱，重復(fù)①-③，經(jīng)HPLC檢測(cè)后，獲得維生素K₂截留段。

優(yōu)選地，獲得的較高純度的維生素K₂溶液中大分子雜質(zhì)(分子量>1000Da)與小分子雜質(zhì)(分子量<400Da)含量之和≤1％，維生素K₂回收率≥98％。；

(5)高純度的維生素K₂的獲取

①將反相硅膠(粒徑為50μm)經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，濕法上柱，然后以2倍柱體積的甲醇沖洗柱子，制成的層析柱高徑比為12:1；

②較高純度的維生素K₂濃縮液以適量甲醇重溶，取適量上柱，層析柱高度與維生素K₂濃縮液上液高度之比為10:1，然后以甲醇進(jìn)行洗脫，流速為0.0163倍柱體積/min；

③分段收集各截留段即可獲得高純度(純度大于80％)的維生素K₂，其中以HPLC法檢測(cè)各截留段中維生素K₂濃度并計(jì)算回收率；

(6)維生素K₂晶體的獲取

①對(duì)獲得的維生素K₂洗脫液進(jìn)行濃縮，然后以適量的含有10％超純水的甲醇在80℃溫度下重溶；

②將獲得維生素K₂甲醇溶液至于-20℃的冰箱中靜置過(guò)夜；

③將上述固液混合物4℃低溫過(guò)濾，即可獲得維生素K₂晶體，并重結(jié)晶一次；

④將得到的維生素K₂晶體以HPLC上樣液(甲醇:二氯甲烷＝4:1)重溶，再采用HPLC法(流動(dòng)相：甲醇:二氯甲烷＝4:1，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)248nm)檢測(cè)維生素K₂晶體的濃度含量，其檢測(cè)圖如圖4所示，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其純度達(dá)到98.2％。

優(yōu)選地，上述濃縮方法均為減壓濃縮，溫度為40-99℃，真空度小于-0.08MPa。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。