一種南極低溫適生解淀粉芽孢桿菌EZ15?07及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)病害防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種南極低溫適生解淀粉芽孢桿菌ez15-07及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來在河北等地區(qū)大規(guī)模爆發(fā)了一種由菠蘿泛菌(pantoeaananatis)引起的玉米細菌性褐腐病，癥狀表現(xiàn)為葉梢枯死卷曲，葉脈產(chǎn)生黃色病斑，莖稈處黃褐色干腐。長期以來人們對玉米細菌性病害關(guān)注較少，由于缺乏有效的防控手段，玉米細菌性病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的損失往往十分嚴重。我國是玉米生產(chǎn)和消費大國，玉米播種面積以及產(chǎn)量都位居世界第二。近年來，由于玉米播種面積擴大、氣候條件變化、新品種的推廣以及耕作制度的改變，玉米病害的發(fā)生呈上升趨勢，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及食品安全帶來了嚴重危害。河北是玉米種植大省，無論種植面積還是產(chǎn)量均居華北地區(qū)首位，玉米病害是影響河北地區(qū)玉米產(chǎn)量與品質(zhì)的主要原因。以往多采用化學(xué)農(nóng)藥防治田間病害的發(fā)生，但該種防治方式的弊端日漸突出：一方面容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，另一方面更與國家大力倡導(dǎo)的“兩減”政策相違背。目前，很多人開始從生防的角度來尋找答案，并且已經(jīng)有很多生物農(nóng)藥應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中，已經(jīng)取得了很好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。根際微生物種類繁多，其中，有很多細菌能夠促進植物生長、防治植物病害、增加作物產(chǎn)量等，這類微生物一般被稱為根圍促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,簡稱pgpr)。他們與植物之間有很好的互利共生關(guān)系，不僅能使植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病性，而且可以提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。所以，根圍促生菌在植物病害防治中有很重要的應(yīng)用價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種解淀粉芽孢桿菌，有針對性地解決當前植物病害防治中存在的問題。該菌為低溫適生菌，對玉米細菌性褐腐病菌等病原菌有抑菌效果，有潛在的生防價值。本發(fā)明的另一目的是提供該解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07，于2016年12月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為cgmccno.13494。所述解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494，是一種從南極企鵝聚集地土壤中分離得到的生防芽孢桿菌。經(jīng)80℃水浴后稀釋涂平板獲得。所述解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494為革蘭氏陽性細菌，桿狀。所述解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494的16srrna的部分核苷酸具有如序列表seqidno.1所示序列。所述解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494的gyrb的部分核苷酸具有如序列表seqidno.2所示序列。本發(fā)明涉及的菌株，參照《芽孢桿菌屬》(蔡妙英等譯.農(nóng)業(yè)出版社，1988年)和《微生物分類學(xué)》(張繼忠.上海復(fù)旦大學(xué)出版社，1995)的檢索表進行檢索，對其在生理生化上進行鑒定，以及16srrna和gyrb基因序列結(jié)果，經(jīng)多相分類鑒定為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)，命名為ez15-07。所述解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494能在10℃生長，是一種低溫適生菌。一種由所述的解淀粉芽孢桿菌ez15-07制備的生防菌劑。所述的生防菌劑優(yōu)選通過以下方法制備得到:將ez15-07菌株接種在lb培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，然后將活化的ez15-07菌株轉(zhuǎn)接到landy培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵時間35-40小時至菌量達到2.06×109cfu/ml；其中l(wèi)andy培養(yǎng)基組成為：20g葡萄糖，5gl-谷氨酸，0.5gmgso4，0.5gkcl，1gkh2po4，0.15mgfe2so4·6h2o，5.0mgmnso4·h2o，0.16mgcuso4·5h2o，ph7.0，1000ml蒸餾水。所述的解淀粉芽孢桿菌ez15-07在抑制玉米細菌性褐腐病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、小麥赤霉病菌和/或玉米輪枝鐮孢菌中的應(yīng)用。應(yīng)用方法是發(fā)酵培養(yǎng)ez15-07獲得發(fā)酵液，對發(fā)酵液進行稀釋后葉面噴施。所述的解淀粉芽孢桿菌ez15-07在制備防治玉米細菌性褐腐病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、小麥赤霉病菌和/或玉米輪枝鐮孢菌的生防菌劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株，是一種對玉米細菌性褐腐病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、小麥赤霉病菌和/或玉米輪枝鐮孢菌有良好防效的芽孢桿菌，是一種低溫適生菌，對環(huán)境無污染，具有潛在的應(yīng)用價值。附圖說明圖1ez15-07生長情況a為ez15-07，b為對照菌株fzb42，c為ez10-01圖2ez15-07對玉米細菌性褐腐病菌的抑菌效果圖3ez15-07對玉米細菌性褐腐病的田間防效a為ck，b為ez15-07圖4ez15-07菌株對水稻白葉枯病菌的抑菌效果圖5ez15-07菌株對水稻細菌性條斑病菌的抑菌效果圖6ez15-07對小麥赤霉病菌的抑菌效果圖7ez15-07對玉米輪枝鐮孢菌的抑菌效果生物材料保藏信息ez15-07，分類命名為解淀粉芽孢桿菌bacillusamyloliquefaciens，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年12月26日，保藏地位為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13494。具體實施方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明。實施例1：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的篩選。用于分離的土壤樣品均來自南極企鵝聚居地，土樣采集于距地面10-15cm處。稱取5g土樣于45ml生理鹽水中，搖床上震蕩30分鐘，靜置使澄清。吸取上清液分別用無菌水稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五個濃度梯度，80℃水浴10min。吸取200μl涂lb平板，37℃過夜培養(yǎng)。待平板上長出菌落后，挑取單菌落，劃線純化后編號保存。實施例2：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的抗低溫篩選過程。具體實施步驟：培養(yǎng)基：1c培養(yǎng)基成分濃度1×1c5×1c蛋白胨0.74.2g21g氯化鈉0.53g15g大豆粉0.31.8g9g總體積加水至600ml加水至600ml土壤浸出液終培養(yǎng)基成分終濃度體積(ml)5×1c1×5020％葡萄糖0.1％1.25土壤浸出液10％25水173.75將菌株接種到上述液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，取10μl菌液點到距離固體培養(yǎng)基平板中心2.5cm的十字交叉點，每個菌株5個重復(fù)，分別放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天記錄菌株生長情況，記錄15天。該菌株能在溫度≤10℃的環(huán)境中生長，我們將在此溫度下，能在一周內(nèi)顯現(xiàn)菌落的菌株記為低溫生長菌株。進一步測試該菌株可以在10℃的條件下生長，且平板培養(yǎng)7d后，將平板上顯示出菌落的區(qū)域連同培養(yǎng)基一并從平板上剝離，置于離心管中并加入1ml無菌水震蕩10min。震蕩后取上清稀釋涂平板計數(shù)。此時，菌量增長為5.85×107cfu/ml，是初始菌量的2.9倍。菌量的增長率是對照菌株fzb42的2.72倍。生長情況如附圖1所示。實施例3：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的16srrna基因的pcr擴增和序列測定。將該菌株接種于液體lb培養(yǎng)基，180rpm，37℃震蕩培養(yǎng)10小時，離心收集菌體，懸浮后加入溶菌酶和sds破壁，采用酚—氯仿法提取基因組dna，用正向引物27f(5’-agagtttgatcmtggctcag-3’)和反向引物1492r(5’-ggytaccttgttacgactt-3’)，對16srrna基因進行pcr擴增，將其進行pcr產(chǎn)物回收以后送測序進行測序。pcr條件為：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。16srrna基因序列長度約為1400bp，在genbank中與bacillusamyloliquefaciensrx-34相似性為99％。其結(jié)果如seqidno.1所示。實施例4：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的gyrb基因的pcr擴增和序列測定。將該菌株接種于液體lb培養(yǎng)基，180rpm，37℃震蕩培養(yǎng)10小時，離心收集菌體，懸浮后加入溶菌酶和sds破壁，采用酚—氯仿法提取基因組dna，用正向引物up1f(5’-gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga-3’)和反向引物up2r(5’-agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat-3’)，對gyrb基因進行pcr擴增，將其進行pcr產(chǎn)物回收以后送測序進行測序。pcr條件為：95℃，4min；94℃，1min；62℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。gyrb基因序列長度約為1200bp，在genbank中與bacillusamyloliquefacienscc178相似性為100％。其結(jié)果如seqidno.2所示。參照《芽孢桿菌屬》(蔡妙英等譯.農(nóng)業(yè)出版社，1988年)和《微生物分類學(xué)》(張繼忠.上海復(fù)旦大學(xué)出版社，1995)的檢索表進行檢索，對其在生理生化上進行鑒定，以及16srrna和gyrb基因序列結(jié)果，經(jīng)多相分類將細菌ez15-07鑒定為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)。實施例5：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。將ez15-07菌株接種在lb培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，然后將活化的ez15-07菌株轉(zhuǎn)接到landy培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵時間為38小時。其中l(wèi)andy發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：20gglucose，5gl-glutamicacid，0.5gmgso4，0.5gkcl，1gkh2po4，0.15mgfe2so4·6h2o，5.0mgmnso4·h2o，0.16mgcuso4·5h2o，ph7.0，1000mldistilledwater。搖瓶發(fā)酵38h后菌量達到2.06×109cfu/ml。實施例6：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對玉米細菌性褐腐病菌的抑菌作用。采用平板抑菌法，吸取5ml液體培養(yǎng)18h的玉米細菌性褐腐病病原菌菌液于放涼至50℃左右的lb培養(yǎng)基中搖勻后倒平板吹干。在上述平板中放入無菌濾紙片，吸取液體培養(yǎng)18h的芽孢桿菌菌液5μl滴加于濾紙片之上，37℃恒溫培養(yǎng)20h。觀測ez15-07對玉米細菌性褐腐病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直徑為12.3mm，如附圖2所示。實施例7：通過發(fā)酵液能夠抑制玉米細菌性褐腐病，具體過程為：對菌株ez15-07進行發(fā)酵，發(fā)酵液稀釋100倍后進行葉面噴施處理。在玉米的灌漿期進行葉面噴施，其生防效果可達59.3％。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：將ez15-07菌株接種在lb培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，然后將活化的ez15-07菌株轉(zhuǎn)接到landy培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,發(fā)酵時間為38小時。田間防效如附圖3所示。實施例8：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對水稻白葉枯病菌的抑菌作用。采用平板抑菌法，在150ml的na培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)好水稻白葉枯病菌5ml，倒na平板，每個平板放四個滅菌的濾紙片，然后吸取5μl的芽孢桿菌菌懸液滴在濾紙片上，28℃培養(yǎng)3天后觀察結(jié)果。重復(fù)3次，觀測菌株ez15-07對水稻白葉枯病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直徑為25.3mm，如附圖4所示。實施例9：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對水稻細菌性條斑病菌的抑菌作用。采用平板抑菌法，在150ml的na培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)好水稻細菌性條斑病菌5ml，倒na平板，每個平板放四個滅菌的濾紙片，然后吸取5μl的芽孢桿菌菌懸液滴在濾紙片上，28℃培養(yǎng)3天后觀察結(jié)果。重復(fù)3次，觀測菌株ez15-07對水稻細菌性條斑病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直徑為15.1mm，如附圖5所示。實施例10：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對小麥赤霉病菌的抑菌作用。采用平板對峙法，倒好pda平板，在平板中央放置直徑1cm的小麥赤霉病菌菌塊，在其四周距離2cm處對稱放置四個濾紙片，在濾紙片上滴加5μl的芽孢桿菌發(fā)酵液，重復(fù)三次，在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，觀測ez15-07對小麥赤霉病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直徑為31mm，如附圖6所示。實施例11：本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對玉米輪枝鐮孢菌的抑菌作用。采用平板對峙法，倒好pda平板，在平板中央放置直徑1cm的玉米輪枝鐮孢菌菌塊，在其四周距離2cm處對稱放置四個濾紙片，在濾紙片上滴加5μl的芽孢桿菌發(fā)酵液，重復(fù)三次，在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，觀測ez15-07對玉米輪枝鐮孢菌的抑菌效果，抑菌圈平均直徑為22mm，如附圖7所示。<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種南極低溫適生解淀粉芽孢桿菌ez15-07及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>1451<212>dna<213>解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07<220><223>16srrna<400>1gacggggcgctctatactgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttag60cggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaa120accggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttc180ggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacc240aaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacgg300cccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacgg360agcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaa420caagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaac480tacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgt540aaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagg600gtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcgg660tgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaact720gacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgcc780gtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcat840taagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggc900ccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtc960ttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtg1020gtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgca1080acccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaa1140ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacg1200tgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatc1260tgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaat1320cgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac1380cacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggaccagccgccgaaggg1440acagagtt1448<210>2<211>1138<212>dna<213>解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07<220><223>gyrb基因<400>2cgcgctttttcaagattaaaatcttctccgattcctgttccgagggccgtgatcattgat60ctgacctcattgtttgagagaattttatcaagtctggctttctcaacgttcagaatctta120ccgcgcagcggcagaatggcttggaaatgacggtcccgtccctgtttcgctgatccgccc180gcagagtcaccctctacgatatacagctcggaaatgctcggatctttagaagaacagtcc240gccagtttgcccggcagattggaaatctcaagcgcacttttgcggcgggtcaattcccgc300gcttttttcgctgccatccgcgctcttgcggccattaaacctttttcaacgattttgcgg360gctgagtccggattttcaagaaggaatgtttccagcgcagaagaaaacagcgtatcagtg420atcgttctcgcttcggagttgccgagcttcgttttcgtctgcccttcgaattgcggatca480gggtgcttaattgaaataatggcagtcagcccttctctcacatcatccccgcttaaattc540ggatcattttctttgaaaatcccttttcttcttgcatagtcgtttatgacacgggtcaga600ccggttttaaatccggcttcgtgcgtcccgccttcgtatgtgttgatgttatttgtgaaa660gaataaatgttgcttgtatagctgtcgttgtattgcaacgcaacttcaaccgttatgccg720tctttctcgccttcgatataaatcggctcttcatgaacgacttctttggaacggtttaag780tactcaacatagcttttgattccgccttcgtagtggtactcgtttttccgttcttgtcct840tcacgtttgtcttcaatcgtgatgtttacgccttttgtcaggaaggccaattcccggaca900cggtttgaaagcagatcatagtcgtatacgattgtttctttgaagatttccggatccgga960acgaagtgcgtaatcgttccggtcttatcagtatcaccgatcacttcaagatcagccaca1020ggtacaccgcgctcgtacgcctgatagtggatttttccgtcacgatgaaccgtaacgtca1080agagtggtcgacaaggcgtttacgacggacgcccctacaccgtgaagaccgccggata1138當前第1頁12