對釩具有耐受性的芽孢桿菌及其用途的制作方法

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種對釩具有耐受性的芽孢桿菌及其用途。

背景技術(shù)：

重金屬污染日趨嚴(yán)重，工業(yè)廢棄物、農(nóng)業(yè)廢水和生活污水的大量排放，重金屬污染物也被一起排放，造成水環(huán)境重金屬污染。重金屬被排入環(huán)境后，不容易降解且能在環(huán)境中長久性積累，重金屬的處理不當(dāng)將導(dǎo)致釋放大量潛在致癌和致突變作用的有毒化合物，導(dǎo)致重金屬污染對生物和環(huán)境的危害性非常嚴(yán)重，因此，加強(qiáng)重金屬污染治理，提高人類健康和生態(tài)系統(tǒng)安全至關(guān)重要。

釩是一種銀灰色金屬，具有延展性、質(zhì)堅硬、無磁性等特征，熔點1890±10℃，沸點3380℃，屬于高熔點稀有金屬之列。釩因其優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)，在工業(yè)方面發(fā)揮了重要的不可替代的作用，有金屬“維生素”的美譽(yù)。近年來由于工業(yè)排放與人為排放，導(dǎo)致環(huán)境和生物體內(nèi)釩不斷的積累，引發(fā)日趨嚴(yán)重的釩污染問題。在釩冶煉和釩共生礦石的燒結(jié)中，產(chǎn)生微小的顆粒，比較容易揮發(fā)到大氣中，造成大氣釩污染。此外，煤和石油的燃燒、火山灰的噴發(fā)、廢金屬的熔煉等都會產(chǎn)生釩污染。釩具有氧化態(tài)的2、3、4和5價，釩的毒性隨價態(tài)的增加而增加，五價釩毒性最高。進(jìn)入大氣中的釩的化學(xué)形態(tài)主要是釩氧化合物，如VO、V₂O₃、VO₂和V₂O₅等，這些釩氧化合物在大氣中通過各種渠道與其他顆粒或化合物接觸，產(chǎn)生協(xié)同作用，往往對生物更具有毒性。釩化合物吸入時具有刺激作用，急性吸入V₂O₅可引發(fā)支氣管肺炎，甚至肺水腫。慢性吸入時，可以對神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)造成傷害，更嚴(yán)重導(dǎo)致中毒型腎病和蛋白代謝異常等。

釩污染帶來的問題越來越嚴(yán)重，導(dǎo)致一系列動物和人類的生存健康事件和隱患發(fā)生，引起了世界各國的高度重視，并且制定出相應(yīng)的法律法規(guī)，嚴(yán)格控制釩的排放，降低由釩引起的環(huán)境污染。目前，治理修復(fù)釩污染技術(shù)主要采用物理化學(xué)、生物修復(fù)技術(shù)。物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)盡管有一定的成效，但是因為突然、水體本身理化性質(zhì)以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)成分的復(fù)雜性，且價格昂貴，操作復(fù)雜，而且容易造成二次污染等諸多限制性因素的存在，造成大多數(shù)方法還處在在實驗室階段，短期間內(nèi)還不能應(yīng)用于實際污染治理。

生物修復(fù)技術(shù)是利用生物本身具有結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性治理環(huán)境污染的一種現(xiàn)代方法，達(dá)到去除環(huán)境中的重金屬或降低重金屬毒性的目的。水體生物修復(fù)主要是微生物修復(fù)技術(shù)，目前該方法已經(jīng)成為各國環(huán)境保護(hù)工程科學(xué)和技術(shù)研究領(lǐng)域內(nèi)的一個熱門話題。微生物修復(fù)技術(shù)是通過某些微生物自身具有的對重金屬的吸收、沉淀、轉(zhuǎn)化等作用來達(dá)到清除環(huán)境中重金屬的目的，或者是減少重金屬毒害的一種新技術(shù)。微生物在治理重金屬污染的多種技術(shù)中具有優(yōu)異的表現(xiàn)，首先微生物通過自身結(jié)構(gòu)和大分子物質(zhì)吸附、固定以及吸收重金屬達(dá)到清除環(huán)境中重金屬的目的；其次微生物對重金屬的還原氧化作用，改變重金屬的價態(tài)，以此降低環(huán)境中重金屬的毒性；另外有些微生物與根際具有共生作用，可以改變土壤中根際微環(huán)境來提高植物對重金屬的吸收和固定，從而達(dá)到修復(fù)重金屬污染的目的。目前，在釩的生物修復(fù)方面還沒有很好的實用方案。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是對被重金屬污染的環(huán)境的生物修復(fù)提供技術(shù)方案。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了一種芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01，其保藏號為CCTCC NO：M2016174。

該芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01已于2016年4月5日向中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提交生物保藏，中國典型培養(yǎng)物保藏中心地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC NO:M2016174。

進(jìn)一步的，所述芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01，其16sRNA的對應(yīng)核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。

此外，本發(fā)明還提供了上述芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01在去除環(huán)境釩毒性中的用途。所述用途包括在單獨釩異?；虺C異常外還有Cd、Cr、Pb、Ni、Co、Zn中一種至多種金屬異常環(huán)境中去除釩毒性的用途。

進(jìn)一步的，上述的環(huán)境為液體環(huán)境。

同時，本發(fā)明還提供了一種釩毒性去除劑。該釩毒性去除劑是以上述的芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01為主要活性成分制備而成的。

此外，本發(fā)明還提供了一種去除環(huán)境中重金屬釩毒性的方法。該方法包括以下步驟：在被釩污染的環(huán)境中引入上述的芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01，引入方式為直接將所述菌株生長至對數(shù)期的菌液或?qū)⒁运鼍隇橹饕钚猿煞值闹苿┮胍后w環(huán)境中生長，以達(dá)到去除環(huán)境重金屬釩毒性的目的。所述液體環(huán)境pH值為4～11。

所述的菌液可按以下方法制備：將上述的芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，配方為胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和pH 7.0，待其生長至對數(shù)期，將所述對數(shù)期菌液引入釩污染液體環(huán)境中，達(dá)到去除環(huán)境釩毒性的目的。

其中，上述方法中的處理溫度為15～50℃，處理的較佳溫度為30℃左右。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明所提供的芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01對釩具有較高的耐受性，而且能夠耐受高濃度Cr(800mg/L)和Pb(1200mg/L)等其它重金屬，其釩耐受能力大于2000mg/L。同時該菌株Bacillus sp.PFYN01為芽孢桿菌屬Bacillus首次報道可以將五價釩還原成四價釩，為高釩污染環(huán)境治理提供菌種資源。

2、本發(fā)明提供的細(xì)菌只需要提供簡單的C源、N源和無機(jī)鹽即可在復(fù)雜的不同重金屬培養(yǎng)環(huán)境中存活并生長，生命力強(qiáng)，生長速度快，生物量大，對多種重金屬具有較高的耐受性，耐受濃度高。

3、本發(fā)明所述的釩生物還原劑能夠?qū)⒃诟邼舛认聦⑽鍍r釩還原成四價釩，還原能力高達(dá)46.67％。

4、本發(fā)明所述的細(xì)菌能耐重金屬Cd、Cr、Pb、Ni、Co、Zn，尤其對釩的耐受力高達(dá)2000mg/L，對Pb的耐受力也高達(dá)1200mg/L?；趯Χ喾N重金屬的高耐受力，便于各種極端污染水體中釩毒性物質(zhì)去除，具備簡單、便捷、高效的優(yōu)點。

附圖說明

圖1、菌株Bacillus sp.PFYN01的菌落照片，示菌落特征。

圖2、菌株Bacillus sp.PFYN01的系統(tǒng)發(fā)育分析樹。

圖3、菌株Bacillus sp.PFYN01在含釩LB培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)后的照片。培養(yǎng)后能將含釩LB培養(yǎng)基溶液的顏色變?yōu)樯钏{(lán)或趨于黑色，可見能有效的將五價釩還原成四價釩。

本發(fā)明芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01已于2016年4月5日向中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提交生物保藏，中國典型培養(yǎng)物保藏中心地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC NO:M2016174。

具體實施方式

本發(fā)明采集四川攀枝花市釩鈦磁鐵礦西渣堆場的排水道中采集的釩污染水，經(jīng)過篩選、富集、分離得到一株細(xì)菌，經(jīng)鑒定，其16sRNA基因序列與芽孢桿菌Bacillus sp.Cp-h36有99％的相似性，命名為芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01。該細(xì)菌已于2016年4月5日向中國典型培養(yǎng)物保藏中心提交生物保藏，保藏號為CCTCC NO:M2016174。

該菌的適合培養(yǎng)條件為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和pH 7.0。實驗證明利用該菌株可制得高耐釩微生物還原劑，用于含釩廢水處理。此外該菌具有高耐重金屬特性，可以制備極端環(huán)境下重金屬毒性去除劑；特別是制備去除水體中重金屬釩毒性的生物還原劑，能將溶液中高毒的五價釩還原成低毒的四價或其它價態(tài)釩。

實施例1 細(xì)菌的獲取和分離

1、分離、純化細(xì)菌的過程：

(1)取四川四川攀枝花市釩鈦磁鐵礦西渣堆場排水道中含釩污染水，靜置2h，取1mL上清加入到50mL含重金屬釩為10mg/L的液體培養(yǎng)基中，30℃ 120rpm培養(yǎng)4d；

(2)取(1)中培養(yǎng)4d的液體培養(yǎng)基1mL加入到50mL含重金屬釩為50mg/L的液體培養(yǎng)基中，30℃ 120rpm培養(yǎng)4d；

(3)取(2)中培養(yǎng)4d的液體培養(yǎng)基1mL加入到50mL含重金屬釩為100mg/L的液體培養(yǎng)基中，30℃ 120rpm培養(yǎng)4d；

(4)取(3)中培養(yǎng)4d的液體培養(yǎng)基1mL加入到50mL含重金屬釩為200mg/L的液體培養(yǎng)基中，30℃ 120rpm培養(yǎng)4d；

(5)取(4)中培養(yǎng)4d的液體培養(yǎng)基1mL加入到50mL含重金屬釩為400mg/L的液體培養(yǎng)基中，30℃ 120rpm培養(yǎng)4d；

(6)取(5)中培養(yǎng)4d的液體培養(yǎng)基1mL加入到50mL含重金屬釩為800mg/L的液體培養(yǎng)基中，30℃ 120rpm培養(yǎng)4d；

(7)取(6)中培養(yǎng)4d的液體上清液1mL涂布于含V⁵⁺(20mg/L)的固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(8)48h后挑取已生長的單菌落，再分別多次劃線生長，純化得到耐釩單菌落。命名為PFYN01

上述固體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、瓊脂粉15g/L、氯化鈉10g/L和pH 7.0。

上述液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和pH 7.0，添加不同濃度釩(10、50、100、200、400、800mg/L)。

實施例2 細(xì)菌形態(tài)特征及生物學(xué)鑒定

1.形態(tài)特征

挑取實施例1得到的單克隆菌落劃線接種在LB固體培養(yǎng)基上，將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。Bacillus sp.PFYN01形成近似圓形，表面光滑濕潤，邊緣不整齊，質(zhì)地軟，乳白色，色素不擴(kuò)散，參見圖1。

2.生理生化特性

將實施例1所得的單克隆菌落接種至LB液體基本培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的Bacillus sp.PFYN01菌株按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等，2001)進(jìn)行革蘭氏染色、淀粉水解試驗、油脂水解實驗、甲基紅實驗、H₂S實驗、明膠水解試驗、糖發(fā)酵實驗，結(jié)果見表1.。

表1菌株Bacillus sp.PFYN01生理生化特性

注:“+”為陽性或產(chǎn)酸，“-”為陰性或不產(chǎn)酸。

3. 16sRNA特性及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

提取細(xì)菌基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物是細(xì)菌16sRNA PCR通用引物(上游引物(SEQ ID No.2)27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物(SEQ ID No.3)1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTTC)，Taq聚合酶為TaKaRa公司生產(chǎn)的rTaq酶，PCR系統(tǒng)為：10×PCR緩沖液5μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，27F(10μM)1uL，1492R(10μM)1uL，基因組DNA 1uL，ExTaq酶(5U/uL)0.2μL，加重蒸水37.8μL。

PCR反應(yīng)程序為：①94℃預(yù)變性5min；②94℃變性30s；③54℃退火30s；④72℃延伸1min30s；⑤72℃延伸10min；⑥4℃保存。其中重復(fù)步驟②、③、④34次，再進(jìn)行步驟⑤、⑥。

PCR產(chǎn)物采用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收?；厥债a(chǎn)物由北京鼎國昌盛生物公司進(jìn)行測序。將測得的16sRNA的序列結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，并利用Blastn將菌種的16sRNA的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行同源性比對，用ClustalX進(jìn)行序列比對,然后采用Mega4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。該菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析樹見圖2，其16sRNA基因序列與芽孢桿菌Bacillus sp.Cp-h36有99％的相似性，根據(jù)結(jié)果，命名為芽孢桿菌Bacillus sp.PFYN01。

實施例3：細(xì)菌對重金屬的最大耐受濃度

挑取實施例1得到的單克隆菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、120rpm振蕩培養(yǎng)36h，收集細(xì)菌濃度OD₆₀₀為1.2，將菌液按照1、10、100、1000、10000的比例稀釋制備梯度菌液；并制備不同濃度重金屬LB固體培養(yǎng)基。分別吸取各濃度菌液50μL至各種重金屬濃度平板涂布均勻，在30℃培養(yǎng)，每隔24h觀察記錄細(xì)菌生長情況，120h內(nèi)抑制其出現(xiàn)明顯生長的最低重金屬濃度，即該菌的最大耐受濃度。

上述不同濃度重金屬固體培養(yǎng)基分別為LB固體培養(yǎng)基中添加Cr、Pb、Cu、Ni、Co、Cd、Zn或V。Cr添加濃度為100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1600mg/L；Pb添加濃度為100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L；Cu添加濃度為1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L；Ni添加濃度為10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、200mg/L、320mg/L；Co添加濃度為10mg/L、20mg/L、40mg/L、50mg/L、100mg/L、160mg/L；Cd添加濃度為10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L、160mg/L；Zn添加濃度為10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L、160mg/L；V添加濃度為50mg/L、125mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L。

菌株Bacillus sp.PFYN01能在重金屬Cd、Cr、Pb、Cu、Ni、Co、Zn含量較高的固體培養(yǎng)基中生長，結(jié)果表明，菌株Bacillus sp.PFYN01對V、Cd、Cr、Pb、Ni、Co、Zn這幾種重金屬均有較高的耐受性，菌株Bacillus sp.PFYN01對重金屬的抗性為：V>Pb>Cr>Ni>Zn＝Cd>Co>Cu。

表2 菌株Bacillus sp.PFYN01對重金屬的最大耐受濃度(單位：mg/L)

由于Bacillus sp菌種中有釩耐受作用的菌種報道，我們用相同或近似實驗條件，對比分析已報道芽孢桿菌屬Bacillus的釩耐受性菌種。其中Ilunga Kamika(2014)報道菌種Bacillus licheniform對釩具有耐受性，其耐受性為200mg/L(Effect of vanadium toxicity at its different oxidation states on selected bacterial and protozoan isolates in wastewater systems.Environmental Technology.35(16):2075-2085)，而本發(fā)明的不同種菌株Bacillus sp.PFYN01對釩耐受性高達(dá)2000mg/L，顯著高于芽孢桿菌屬Bacillus licheniform對釩的耐受性。另外，Jennifer(2004)報道了芽孢桿菌屬另一菌種Bacillus subtilis對釩的耐受性，其值達(dá)5000mg/L，但是，其對鉻Cr敏感，不耐受釩(Methods evaluating vanadium tolerance in bacteria isolated from crude oil contaminated land.J.Microbiological Methods.58:87-100)。而本試驗分離的Bacillus sp.新菌株Bacillus sp.PFYN01不但對釩具有較高的耐受性，而且能夠耐受高濃度的Cr(800mg/L)和Pb(1200mg/L)等其它重金屬，對于綜合利用菌株Bacillus sp.PFYN01修復(fù)含其它重金屬的釩污染水體具有很好應(yīng)用前景。

實施例4：細(xì)菌對五價釩的還原效果

挑取實施例1得到的單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30℃、120rpm振蕩培養(yǎng)18h，獲得對數(shù)期菌液；按照0.2％的體積分?jǐn)?shù)接種量將菌液接入LB液體培養(yǎng)基(含V⁵⁺濃度為30mmol/L)中，振蕩培養(yǎng)48h；然后將培養(yǎng)液6000rpm離心10min，取離心液上層清液10mL，按照陳富于《釩電池電解液中不同價態(tài)釩的分光光度分析》(光譜學(xué)與光譜分析，2011,31(10):2839-2842)方法測定上清液中五價釩和四價釩濃度。

結(jié)果表明，菌株Bacillus sp.PFYN01能使含釩LB培養(yǎng)基溶液顏色由黃轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)或趨于黑色，參見圖3。通過分光光度法測定溶液中V⁵⁺和V⁴⁺含量，測得溶液中4價和5價釩總濃度為25.6mmol/L，V⁴⁺的濃度為14.0mmol/L，V⁵⁺的濃度為11.6mmol/L，其它4.4mmol/L的釩轉(zhuǎn)變?yōu)?價或2價。由此，菌株Bacillus sp.PFYN01能使V⁵⁺還原成V⁴⁺，轉(zhuǎn)化率為46.7％，顯著降低溶液中釩毒性。菌株Bacillus sp.PFYN01這種對釩的還原特性在芽孢桿菌屬Bacillus菌株中尚未見報道。