一株對多主棒孢菌具備抑制作用的鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于農(nóng)作物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株對多主棒孢菌具備抑制作用的鏈霉菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)，隸屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色菌科、棒孢屬，是一種寄主范圍廣泛的世界性分布的植物病原真菌，是該屬內(nèi)發(fā)現(xiàn)最早、寄主范圍最廣的種。能侵染熱帶及亞熱帶地區(qū)近380個屬內(nèi)的530種植物，包括黃瓜、番茄、棉花、豇豆、大豆、木瓜、煙草和橡膠等(Smith,2008)。該病菌主要危害植物的葉片，形成典型具黃色暈圈的壞死斑，也可侵染根、莖、花和果實(shí)，嚴(yán)重時造成落葉、落果等現(xiàn)象。1958年在印度首次報道了由多主棒孢菌引起的橡膠樹棒孢霉落葉病(RamakrishnanandPilla，1961)，20世紀(jì)50-80年代該病害在亞太和非洲的主要產(chǎn)膠地區(qū)相繼發(fā)生，但是由于該病害的發(fā)生僅限于苗圃和幼小的植株上且為害不大，一直作為一種次要病害而未引起人們的關(guān)注。但是近年來病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由多主棒孢菌引起的植物病害已經(jīng)對世界上多類經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，如在南美地區(qū)多主棒孢菌引起口紅花、一串紅、一品紅、水黃楊和黃瓜、番茄、辣椒等園藝作物的棒孢葉斑??；在美國中西部地區(qū)，主要引起大豆、豇豆和芝麻等作物的棒孢葉斑病，番茄種植地?fù)p失達(dá)11800千克/公頃(Perneznyetal.，1996)，據(jù)估計，一旦發(fā)生嚴(yán)重的棒孢霉落葉病的為害，橡膠樹產(chǎn)量損失將近20％；另外，在巴西、菲律賓、尼日利亞、印度以及韓國和日本等亞洲國家也有棒孢葉斑病的報道(Chee，1990)。在我國，魏景超最早于1950年在黃河下游地區(qū)發(fā)現(xiàn)豇豆棒孢葉斑病，但由于豇豆種植面積有限，并未引起重視。20世紀(jì)90年代初，我國河南、遼寧等地黃瓜、茄子蔬菜栽培地受到多主棒孢的普遍侵染，造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。1994年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃瓜棒孢葉斑病在遼寧省沈陽、瓦房店和丹東等地普遍發(fā)生，但未擴(kuò)展蔓延。但近幾年，該病的危害呈明顯的上升趨勢，2005年至今，該病在山東、河北、北京、遼寧、吉林、河南、云南、海南等19個省市區(qū)大暴發(fā)，主要危害黃瓜、番茄、茄子、菜豆等蔬菜，每年發(fā)生面積超過1000萬畝，損失超過50億。而以保護(hù)地黃瓜危害最為嚴(yán)重，一般病田葉發(fā)病率為10％-25％，嚴(yán)重時可達(dá)60％-70％，甚至100％，由于棒孢葉斑病在我國蔬菜和橡膠種植區(qū)危害嚴(yán)重，并已經(jīng)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國蔬菜和橡膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。如果該病不能得到有效的控制，將對我國黃瓜、番茄和茄子等重要蔬菜和橡膠產(chǎn)業(yè)造成毀滅性的打擊。目前，化學(xué)防治仍然是防治該病害的主要手段，其具有使用范圍廣、見效快、使用方便，能及時有效的控制如作物棒孢葉斑病這種突發(fā)性的病害。國外早先已經(jīng)開展了防治橡膠棒孢葉斑病殺菌劑的篩選與應(yīng)用研究，推薦較好的藥劑有多菌靈、甲基硫菌靈和代森錳鋅。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在日本已經(jīng)應(yīng)用于蔬菜棒孢葉斑病的防治，2006年日本就將啶酰菌胺登記為防治黃瓜棒孢葉斑病的藥劑，并取得了良好的防治效果(Miyamotoetal.，2009)。雖然化學(xué)藥劑在作物棒孢葉斑病的防治中起到了重要的作用，但是由于其頻繁的使用，也產(chǎn)生了抗藥性的問題，早在1979年，日本西部大分縣黃瓜棒孢葉斑病已經(jīng)成為當(dāng)?shù)攸S瓜生產(chǎn)的重要病害，最初使用苯并咪唑類殺菌劑進(jìn)行防治取得了良好的效果，但是由于抗藥性的產(chǎn)生防效開始下降(Hasama，1991)。2006年7月，啶酰菌胺在日本作為日本防治黃瓜棒孢葉斑病的登記藥劑，隨后對其敏感性進(jìn)行了監(jiān)測，在對438個黃瓜棒孢葉斑病的菌株抗藥性的檢測中發(fā)現(xiàn)，214株對啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性，抗性頻率高達(dá)49％(MIC>30μg/ml)，其中189個菌株為中抗菌株(EC501.1-6.3μg/ml)，25個菌株為超高抗菌株(EC50>24.8μg/ml)(Miyamotoetal，2009)。針對我國作物棒孢葉斑病對微管蛋白抑制劑多菌靈和乙霉威抗藥性也有相關(guān)進(jìn)的系統(tǒng)研究。研究表明我國多主棒孢菌對多菌靈抗性頻率極高，而對多菌靈和乙霉威雙抗頻率較低。對采自我國12個地區(qū)，18個寄主的163株多主棒孢菌對多菌靈和乙霉威的敏感性進(jìn)行分析，145個菌株對多菌靈具有抗藥性，抗性頻率高達(dá)89.0％。僅18個菌株對多菌靈敏感，占供試菌株的11.0％。24個菌株對多菌靈和乙霉威具有雙重抗藥性，雙抗頻率為14.7％(Huangetal.，2013)。從研究中可知，盡管多菌靈沒有作為棒孢葉斑病的登記藥劑，但實(shí)際上已經(jīng)產(chǎn)生非常嚴(yán)重的抗藥性。放線菌(Actinomycetes)是自然界一種非常重要的微生物類群，屬于原核生物的一個類群。放線菌目(Actinomyeetales)。其在自然界中非常豐富，在作物病害防治方面具有巨大的使用價值和經(jīng)濟(jì)價值，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(尤其是抗生素)在作物病害防治中發(fā)揮了重大作用，抗生素具有高效、低毒、易降解、無殘留、對環(huán)境友好等特點(diǎn)，這是化學(xué)農(nóng)藥沒有的，近年來，國內(nèi)外均不斷發(fā)現(xiàn)新的抗生素種類，如井岡霉素、春雷霉素、寧南霉素、武夷霉素和中生菌素等。但目前分離到的放線菌僅為實(shí)際種類的0.1-1％，因此其具有很大的應(yīng)用和開發(fā)空間，目前還沒有放線菌活菌制劑及其產(chǎn)生的抗生素防治棒孢葉斑病的報道。開發(fā)出防治作物棒孢葉斑病的新型殺菌劑具有重大的實(shí)踐意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種對多主棒孢菌具備抑制作用的鏈霉菌，所述的鏈霉菌為產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958，保藏編號為：CCTCCNO：M2015768。該菌株對多主棒孢菌具備抑制作用，可用于植物棒孢葉斑病的防治。本發(fā)明的另一個目的在于提供了鏈霉菌HEBRC-45958的制備方法，方法簡單，易行，利用該方法制得的發(fā)酵液，有效物質(zhì)含量高，具備良好的生產(chǎn)前景。本發(fā)明的最后一個目的在于提供了鏈霉菌HEBRC-45958在制備防治植物棒孢葉斑病藥物中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。一株對多主棒孢菌具有良好抑制作用鏈霉菌，從武漢東湖磨山采集的土壤中分離，經(jīng)16srDNA鑒定后屬于產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)，已于2015年12月23日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958；保藏編號為CCTCCNO：M2015768；地點(diǎn)：中國，武漢，武漢大學(xué)。產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958在ISP-2培養(yǎng)基上生長良好，菌落褐黃色，孢子表面光滑。產(chǎn)褐黃色鏈霉菌HEBRC-45958的制備方法，包括：將產(chǎn)褐黃色鏈霉菌HEBRC-45958種子液按3-10％(V/V)的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中。溫度為28℃，發(fā)酵罐的攪拌速度200-500轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為罐體容積的60％-80％；發(fā)酵4-6天即可；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括：甘露醇1-3％、大豆蛋白胨1-3％、酵母粉0.3-0.5％、碳酸鈣0.3-0.5％、氯化鈉0.3-0.8％；pH值6.5-7.5，其余為水，以上均是質(zhì)量比。優(yōu)選的，所述的鏈霉菌HEBRC-45958種子液的制備方法包括:將斜面保存菌種在ISP-2平板活化，挑取接種至100毫升種子培養(yǎng)基中，在28℃，130-160轉(zhuǎn)/分的搖床上培養(yǎng)3-4天；既得種子液。所述的種子培養(yǎng)基的配方與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。產(chǎn)褐黃色鏈霉菌HEBRC-45958在制備防治植物棒孢葉斑病藥物中的應(yīng)用，包括將該菌株的發(fā)酵液或是發(fā)酵液稀釋后直接噴灑于植物葉部和/或莖部，或是與其他有效成分制成復(fù)合制劑以防治多種植物病害，優(yōu)選的，發(fā)酵液與水按1：20-1:100(體積比)稀釋。只要是由多主棒孢菌引起的棒孢葉斑病均可用本發(fā)明提供的產(chǎn)褐黃色鏈霉菌HEBRC-45958制備的制劑進(jìn)行防治。所述的植物包括但不限于黃瓜、番茄，茄子和橡膠樹。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)首次報道鏈霉菌應(yīng)用于防治植物棒孢子葉斑病，其與現(xiàn)有殺菌劑無交互抗藥性。(2)與目前使用化學(xué)合成殺菌劑防治相比，由于其來自于自然環(huán)境，具有高效、低毒、不污染環(huán)境和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1為HEBRC-45958菌株在ISP-2培養(yǎng)基上的孢子及菌落形態(tài)。左圖為菌株HEBRC-45958顯微鏡(1000X)觀察照片，右圖為菌株HEBRC-45958的平板菌落形態(tài)。圖2為HEBRC-45958與多主棒孢菌(C.cassiicola)對峙培養(yǎng)。圖3為顯微鏡下對照和處理菌絲形態(tài)。圖4為HEBRC-45958發(fā)酵液對番茄棒孢葉斑病防治效果。圖5為HEBRC-45958發(fā)酵液對茄子棒孢葉斑病防治效果。具體實(shí)施方式為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。實(shí)施例1：一株對多主棒孢菌具有良好抑制作用鏈霉菌，從武漢東湖磨山采集的土壤中分離，經(jīng)16srDNA鑒定后屬于產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)，已于2015年12月23日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958；保藏編號為CCTCCNO：M2015768；地點(diǎn)：中國，武漢，武漢大學(xué)。在本發(fā)明中，產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958或被稱為HEBRC-45958。形態(tài)特征：在ISP-2培養(yǎng)基上生長良好，菌落褐黃色，孢子表面光滑(圖1)。菌株生理生化特性：表1HEBRC-45958菌株碳源利用+：陽性，-：陰性實(shí)施例2：產(chǎn)褐黃色鏈霉菌HEBRC-45958的制備方法，包括：將斜面保存菌種在ISP-2平板活化，挑取接種至100毫升種子培養(yǎng)基中，在28℃，160轉(zhuǎn)/分的搖床上培養(yǎng)4天；既得種子液。所述的種子培養(yǎng)基的配方與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。將鏈霉菌HEBRC-45958種子液按5％(V/V)的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中。溫度為28℃，發(fā)酵罐的攪拌速度300轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為20L罐體容積的80％；發(fā)酵6天即可；制得的發(fā)酵液用于實(shí)施例4。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括：：甘露醇2％、大豆蛋白胨1.5％、酵母粉0.3％、碳酸鈣0.5％、氯化鈉0.5％；pH值7，以上均為質(zhì)量比，其余為水。實(shí)施例3：產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(S.phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958對多主棒孢菌(C.cassiicola)離體抑制效果：將斜面保存HEBRC-45958菌株在ISP-2平板活化，28℃培養(yǎng)4d，用打孔器打取4mm大小菌碟，放置于PDA平板中央。將斜面保存多主棒孢菌(C.cassiicola)在PDA培養(yǎng)基活化5d，打取4mm菌碟在距HEBRC-45958菌碟四周25mm處放置四個，對峙培養(yǎng)7d后觀察抑菌帶。挑取多主棒孢菌(C.cassiicola)與HEBRC-45958對峙邊緣菌絲，在顯微鏡下處理與對照菌絲形態(tài)差別。HEBRC-45958與多主棒孢菌(C.cassiicola)對峙產(chǎn)生明顯的抑菌帶，抑菌帶寬度25mm(圖2)，具有強(qiáng)烈的抑制作用，與對照菌絲相比，處理菌絲發(fā)生了扭曲、腫脹和變形(圖3)。實(shí)施例4：產(chǎn)褐黃色鏈霉菌(S.phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958防治作物棒孢葉斑病效果：將番茄和茄子種子催芽，分別播種于32孔和72孔穴盤，溫室常規(guī)管理，生長20d后用于盆栽試驗(yàn)。供試病原菌分離自田間發(fā)生棒孢葉斑病的的番茄和茄子，并在4℃條件下保存于PDA斜面中。將其活化，在PDA培養(yǎng)基擴(kuò)繁，28℃光照培養(yǎng)12d，加入無菌水用刷子刷取孢子，使用紗布過濾。血球計數(shù)板觀察孢子數(shù)，使用無菌水將孢子濃度調(diào)節(jié)到1×105/ml，加入終濃度為0.1％吐溫80作為分散劑。將實(shí)施例2制備的HEBRC-45958發(fā)酵液稀釋50倍，噴灑于番茄和茄子葉部至滴水，24h后噴施番茄和茄子棒孢葉斑病菌孢子懸浮液至葉面飽和。以噴施50％啶酰菌胺水分散粒劑作為對照藥劑，有效成分濃度為333.3μg/ml。噴施清水作為空白對照，每個處理三次重復(fù)。在人工氣候箱28℃保濕培養(yǎng)。4d后統(tǒng)計對照和各處理病情指數(shù)，并計算防效。番茄和茄子棒孢葉斑病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)如下(Ishiietal.，2007)。0級：無病害癥狀0.1級：病斑小于葉面積1％0.5級：病斑占葉面積1％-5％之間1級：病斑占葉面積6％-10％之間2級：病斑占葉面積11％-20％之間3級：病斑占葉面積21％-30％之間4級：病斑占葉面積31％-40％之間5級：病斑占葉面積41％-50％之間6級：病斑占葉面積51％-60％之間7級：病斑占葉面積61％-70％之間8級：病斑占葉面積71％-80％之間9級：病斑占葉面積81％-90％之間10級：病斑大于葉面積90％以上根據(jù)表2和3可知，HEBRC-45958發(fā)酵液稀釋50倍對番茄和茄子棒孢葉斑病具有良好的防治效果(圖4，5)，防效分別達(dá)到88.53％和91.64％，與對照化學(xué)藥劑啶酰菌胺防效相當(dāng)。表2HEBRC-45958對番茄棒孢葉斑病防治效果處理病情指數(shù)防效(％)HEBRC-4595811.1188.53啶酰菌胺12.3487.26清水對照96.88-表3HEBRC-45958對茄子棒孢葉斑病防治效果處理病情指數(shù)防效(％)HEBRC-459587.3391.64啶酰菌胺9.4189.27清水對照87.67-當(dāng)前第1頁1 2 3