一株撕裂蠟孔菌的促生作用及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一株撕裂蠟孔菌(ceriporialaceratehg2011)具有促進作物生長的作用，能用于生產(chǎn)生物肥料，促進烤煙生長，提高辣椒和茄子的產(chǎn)量品質(zhì)，屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

化學(xué)肥料是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，是農(nóng)作物的“糧食”?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培中，化肥用量大。但是，長期大量施用化肥帶來一系列生產(chǎn)和環(huán)境問題，如肥料利用率低，浪費嚴(yán)重；土壤板結(jié)，肥力下降；水體富營養(yǎng)化，污染環(huán)境；農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)降低等。

在作物生長過程中，植物激素如iaa具有促進作物生長的作用。部分雙子葉植物尤其是生長于鈣質(zhì)和堿性土壤的果樹容易缺鐵，鐵載體的絡(luò)合作用可促進植物吸收鐵元素。土壤中的無機磷主要以難溶性形式存在，生物有效性低；磷肥施入土壤之后，與鈣、鎂、鐵、鋁結(jié)合，形成溶解性低的磷酸鹽，故磷肥利用率一般不超過20％左右。土壤全鉀一般超過1％，但有效含量較低。因此，活化土壤無機磷鉀有益于減施化肥，提高肥料利用率，保護環(huán)境和保障糧食安全。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)了多種能促進植物生長的微生物菌株，它們能單獨使用，也能與其它微生物和肥料混合使用，把促生作用和提高肥效作用較好地結(jié)合起來，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。因此，促生微生物的篩選和應(yīng)用受到業(yè)界的普遍關(guān)注。但是，目前促生微生物的研究應(yīng)用存在以下突出問題：(1)高效菌種匱乏，肥效有待進一步提高；(2)菌種適應(yīng)能力差，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)地域多樣、氣候條件復(fù)雜，促生菌種的適應(yīng)能力影響其效果的發(fā)揮；(3)優(yōu)良菌種數(shù)量有限，農(nóng)業(yè)應(yīng)用的選擇性小。此外，促生微生物菌劑一般為活菌，主要依靠其繁殖過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物而起作用，在田間自然條件下影響其生長繁殖的因素眾多，作用效果不太穩(wěn)定。所以，篩選更多的高效、穩(wěn)定、適應(yīng)性強的促生菌株，對于研制生產(chǎn)安全、高效的生物肥料具有廣泛的應(yīng)用價值，是國內(nèi)外同行的重要研究目標(biāo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一株撕裂蠟孔菌hg2011新種的新用途，開拓其新的應(yīng)用范圍。

一株撕裂蠟孔菌在促進作物生長方面的應(yīng)用，其特征在于，所述撕裂蠟孔菌保藏號為cgmccno.13899，分類命名為ceriporialaceratehg2011；具有c.laceratehg201118srdna序列表中的核苷酸序列；具有分泌iaa、鐵載體、溶磷和解鉀的特性。

所述撕裂蠟孔菌在促進作物生長方面的應(yīng)用，用于生產(chǎn)發(fā)酵液和固體菌劑，促進烤煙生長，提高辣椒和茄子的產(chǎn)量品質(zhì)。

本發(fā)明提供的菌株c.laceratehg2011，已于2017年6月2日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏號為cgmccno.13899，分類命名為撕裂蠟孔菌c.laceratehg2011。其核苷酸序列與本發(fā)明同日申請專利相同，名稱為“一株撕裂蠟孔菌及其在防治作物真菌病害中的應(yīng)用”。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明c.laceratehg2011能分泌iaa和鐵載體，溶解難溶性無機磷和含鉀礦物。

2、本發(fā)明c.laceratehg2011能定植于作物根際，具有顯著的促生作用。促進烤煙、辣椒和茄子生長，并提高辣椒和茄子產(chǎn)量和改善品質(zhì)。

3、本發(fā)明c.laceratehg2011制備的發(fā)酵液和固體菌劑的工藝簡單，原料廣，成本低，應(yīng)用范圍廣，能生產(chǎn)安全、高效的生物肥料。

附圖說明

圖1為本發(fā)明撕裂蠟孔菌hg2011溶磷平板檢測圖；

圖2為本發(fā)明撕裂蠟孔菌hg2011解鉀平板檢測圖；

圖3為本發(fā)明撕裂蠟孔菌hg2011的解鉀液體培養(yǎng)圖；

圖4為本發(fā)明撕裂蠟孔菌hg2011產(chǎn)鐵載體檢測圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。

培養(yǎng)基及其制備

pda固體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基去除瓊脂)：200g馬鈴薯、20g葡萄糖、20g瓊脂、1l去離子水，ph6.50、121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻后倒平板(固體培養(yǎng)基)或取20ml于150ml三角瓶中(液體培養(yǎng)基)備用。

bonnet液體培養(yǎng)基：0.6gkh2po4、0.7gkno3、0.25gmgso4·7h2o、0.12gk2hpo4·3h2o、0.3gca(no3)2、1g天冬酰胺、10g葡萄糖、1.5mgmnso4·h2o、4mgznso4·7h2o、0.1mgna2moo4·2h2o、1mgh3bo3、1mg泛酸鈣、8mgfena-edta、1mg吡哆醇、1mg煙酸、20μgcuso4·5h2o、10μgcocl2·6h2o、20μgki，水1000ml，ph調(diào)至6.0。配制于發(fā)酵罐，121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻備用。

pikovskaya固體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基去除瓊脂)：10g葡萄糖、5gca3(po4)2、0.5g(nh4)2so4、0.2gnacl、0.1gmgso4·7h2o、0.2gkcl、0.5g酵母粉、0.002gmnso4、0.002gfeso4·7h2o、1l去離子水，ph7.0、121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻后倒平板(固體培養(yǎng)基)或取20ml于150ml三角瓶中(液體培養(yǎng)基)備用。

cas培養(yǎng)基：每100ml含1ml20％蔗糖溶液、3ml10％酸水解酪素、100μl1mmol/lcacl2、2ml1mmol/lmgso4、1.8g瓊脂。滅菌(121℃、1.5大氣壓、30min)后冷卻至約60℃時緩慢加入0.1mol/l抽濾滅菌的磷酸鹽緩沖液(2.427gna2hpo4·12h2o、0.5905gnah2po4·2h2o、1000ml去離子水)和cas染液【60.5mg鉻天青s、10mlfe³⁺溶液(1mmol/lfecl3·6h2o，10mmol/lhcl)，72.9mg十六氨基烷基溴化銨(htdma)，去離子水定容至100ml】各5ml，混合均勻，倒平板備用。

硅酸鹽固體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基去除瓊脂)：0.3g(nh4)2so4、0.2gnahso4，0.05gmgso4·7h2o，0.01gfeso4·7h2o，3g蔗糖、0.5g鉀長石粉、1000ml超純水。121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻后倒平板(固體培養(yǎng)基)或取20ml于150ml三角瓶中(液體培養(yǎng)基)備用。

實施例1：促生特性測定

1、產(chǎn)iaa測定

將c.laceratehg2011接種于pda固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，按每100mlpda液體培養(yǎng)基接種10個菌塊的接種量，分別接種于不加和加色氨酸的pda液體培養(yǎng)基中(色氨酸濃度為1g/l)，25℃、150rpm搖床培養(yǎng)5d，取培養(yǎng)液10ml，10000r/min離心，用salkowski比色法測定上清液中的iaa濃度。測定結(jié)果表明，不加和加色氨酸時菌株均能分泌iaa，在上清液中iaa的含量分別為4.03μg/ml和19.33μg/ml。

2、溶磷能力測定

將c.laceratehg2011接種于pda固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種于pikovskaya’s固體培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5d，觀察溶磷圈有無并拍照。圖1為本發(fā)明c.laceratehg2011溶磷平板檢測圖，菌落周圍出現(xiàn)明顯水解圈。同時，將菌株接種于含pikovskaya’s液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在25℃、150r/min搖床中培養(yǎng)5d，取培養(yǎng)液10ml，10000r/min離心10min，取上清液，用釩鉬黃比色法測定濾液中的磷含量為608.8μg/ml，對照(不接菌)含磷量4.58μg/ml，說明c.laceratehg2011具有解磷能力。

3、解鉀能力測定

將c.laceratehg2011接種于pda固體培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種于硅酸鹽培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5d，觀察有無透明水解圈以判定其是否具有解鉀能力。圖2為本發(fā)明c.laceratehg2011解鉀平板檢測圖，在硅酸鹽培養(yǎng)基上，c.laceratehg2011菌落周圍出現(xiàn)明顯的水解圈。同時，將菌株接種于硅酸鹽液體培養(yǎng)基中，25℃、150r/min搖床培養(yǎng)5d，發(fā)現(xiàn)c.laceratehg2011菌絲能將液體培養(yǎng)基中的鉀長石包裹并分解，使溶液澄澈(如圖3所示)。同時，取濾液10ml，6000r/min離心10min，用火焰光度計法測上清液中的可溶性鉀，其含量為13.14μg/ml，對照(不接菌)4.58μg/ml，說明c.laceratehg2011具有解鉀能力。

4、產(chǎn)鐵載體能力測定

將c.laceratehg2011接種于pda固體培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種于cas培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72h。由圖4可見，c.laceratehg2011菌落周圍出現(xiàn)無色水解圈及藍色暈圈，說明菌株c.laceratehg2011具有產(chǎn)鐵載體的能力。

5.促進烤煙生長，提高煙葉產(chǎn)量

將c.laceratehg2011接種于pda固體培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種于發(fā)酵罐中的bonnet液體培養(yǎng)基，制備出c.laceratehg2011發(fā)酵液【接種量：10個菌塊/l；發(fā)酵溫度：(27±1)℃；攪拌速率：150r/min；通氣量：10ml/(l·min)；發(fā)酵時間：120h】。

2015年4月20日至8月20日，在四川省涼山州某地烤煙移栽成活后第7天和第30天，每株澆灌100mlc.laceratehg2011發(fā)酵液，烤煙植株生物量比單施化肥增加18.03％，煙葉增產(chǎn)12.35％。

6、促進辣椒生長、提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)實例

取蛭石(2～3mm)、谷殼、玉米粉(磨細過100目篩)和自來水(質(zhì)量比＝12：25：3：60)混勻，裝入5l食用菌栽培袋，滅菌(121℃、1.5大氣壓、30min)冷卻，加c.laceratehg2011發(fā)酵液(蛭石、谷殼、玉米粉和自來水混合物：發(fā)酵液＝100：10，質(zhì)量比)，混勻封口，25℃暗培養(yǎng)30d制備出c.laceratehg2011固體菌劑。

2016年3月20日至6月20日，在重慶市某地辣椒移栽時，將50gc.laceratehg2011固體菌劑基施于辣椒苗根系周圍，辣椒植株生物量比單施化肥增加21.01％，增產(chǎn)15.23％，果實維生素提高46.87％。辣椒收獲后，在根系周圍仍有c.laceratehg2011菌絲存在。

7、促進茄子生長、提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)實例

2016年3月10日至7月28日，在重慶市某地茄子移栽時，將50gc.laceratehg2011固體菌劑基施于茄子苗根系周圍，茄子植株生物量比單施化肥增加27.37％，產(chǎn)量提高17.23％，果實維生素c提高87.96％。茄子收獲后，在根系周圍仍可發(fā)現(xiàn)c.laceratehg2011菌絲。

最后需要說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明所述菌株在促進作物生長，提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)方面進行作物種類替換，由本菌株生產(chǎn)出的微生物菌劑或生物肥料，以及在該菌株基礎(chǔ)上進行的任何擴展或修改等，應(yīng)視為不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。