專利名稱：一種檢測TEL-AML1融合基因mRNA表達量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的熒光定量PCR技術(shù)，特別涉及一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達量的試劑盒。
背景技術(shù)：
TEL-AMLl融合基因是兒童白血病常見的融合基因，由其所致的白血病占兒童急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 20% 25%,由 t (12; 21) (pl3;q22) 形成，即位于12號染色體上的TEL (Translocation Ets Leukemia)螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域融合到位于21號染色體上AMLl (Acute Myeloid Leukemia I)的DNA結(jié)合和激活區(qū)域而成。其見于12-28%的B系A(chǔ)LL，但僅見于B前體細胞ALL(BCP-ALL)，未見于成熟B-ALL及 T-ALL。TEL-AMLl融合基因在成人中的檢出率只有2°/Γ4%，兒童ALL多發(fā)生在f 10歲，其中 Γ5歲患者占76. 2%ο
TEL基因易位導致其下游的⑶-KNIB基因不能編碼周期素依賴激酶抑制蛋白P27， 細胞從Gl期進入S期，增殖能力增加，白血病細胞過度生長。異常的TEL-AMLl融合蛋白也可通過Runt同源結(jié)構(gòu)域與野生型AMLl競爭DNA結(jié)合位點而與核心增強序列結(jié)合，活化組蛋白去乙?；福瑥亩笰MLl由轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄抑制因子，顯著負性抑制野生型 AMLl功能，抑制轉(zhuǎn)錄過程，導致AMLl調(diào)節(jié)靶基因(M-CSF受體、IL-3和GM-CSF受體基因等) 的表達受阻，影響造血干細胞的自我更新和分化能力。
檢測TEL-AMLl融合基因的mRNA表達可以檢測白血病細胞的微小殘留，TEL-AMLl 融合基因的mRNA表達快速降低至消失提示無殘留白血病細胞，而TEL-AMLl融合基因的 mRNA表達呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢預示ALL復發(fā)。因此，TEL-AMLl融合基因表達的檢測對預測兒童急性淋巴細胞性白血病的預后以及危險分層具有指導意義。實時熒光定量PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)實現(xiàn)了 PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有特異性增強、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點，但目前尚未有實時熒光定量 PCR方法檢測急性淋巴細胞白血病中TEL-AMLl融合基因的相關(guān)報道。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)空缺的問題，本發(fā)明實施例提供了一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達量的試劑盒，所述技術(shù)方案如下
本發(fā)明實施例提供了一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括TEL-AMLI融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中
TEL-AMLl融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；
TEL-AMLl融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；
ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；
所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、 Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
進一步地，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和 Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
進一步地，所述TEL-AMLl融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團 TAMRA0
具體地，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。
具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有TEL-AMLl融合基因的總 RNA樣品。
具體地，所述的cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl2 4 μ L，IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶I.5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應(yīng)體系終濃度表示)為1Χ的PCR預混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、?！?2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。
本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果如下
(I)敏感性高可重復敏感度為O. 01%,即10000個細胞中有一個含TEL-AMLl融合基因就可以被檢測出。
(2)特異性強使用特異性探針對定量分子進行識別，準確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。
(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔心放射性污染。
(4)全程監(jiān)控本發(fā)明實施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系，對檢測過程進行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。
(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。
本發(fā)明的試劑盒能快速、準確、定量檢測TEL-AMLl融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于急性淋巴細胞白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測，為急性淋巴細胞白血病的診斷、制定治療方案及療效評價和預后提供了重要的檢測手段。
為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖IA是本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖IB是由本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖得到的標準曲線圖2A是本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品的熒光曲線圖2B是由本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品熒光曲線圖得到的標準曲線圖。
具體實施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。
實施例I.本發(fā)明試劑盒的制備
I、特異性的引物和熒光探針的設(shè)計
根據(jù)基因序列(ABL基因序列、AMLl基因序列和TEL基因序列來源于美國國家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為匪005157. 4 ;AML1 基因ID分別為861，參考序列號為NM 001001890. 2 ;TEL基因ID分別為2120，參考序列號為NG 011443. I)分別設(shè)計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。
2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分
本發(fā)明試劑盒組成如下
①RNA 提取試劑=Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產(chǎn)品貨號15596-026/100ml), 每Iml骨髓組織加入ImlTrizol快速提取兒童急性淋巴細胞性白血病患者骨髓組織RNA。
②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產(chǎn)品貨號K1622):25mmol/ LMgCl2 4 μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水。
③引物、探針和標準品包括融合基因TEL-AMLl引物、內(nèi)參基因ABL引物、內(nèi)部陽性控制序列引物及與引物對應(yīng)的Taqman熒光探針，具體如下
TEL-AMLl融合基因上游引物序列為5’-CCCATTGGGAGAATAGCAGAAT-3’(序列表中序列I);
TEL-AMLl融合基因下游引物序列為5’-TGGCATCGTGGACGTCTCTA-3’(序列表中序列2)；
TEL-AMLl 融合基因 Taqman 熒光探針FAM 5’-ATACTTGGAATGAATCCTT-3’TAMRA(序列表中序列3)；
內(nèi)部陽性控制序列為5’ -CCCAUUGGGAGAAUAGCAGAUAGCAUACUUGGUAAGAAUCCUUCAUG AGACGUCCACGAUGCCA-3，(序列表中序列 7)；
內(nèi)部陽性控制序列上游引物序列為5’ -CCCATTGGGAGAATAGCAGATA-3’(序列表中序列8)；
內(nèi)部陽性控制序列下游引物序列為5’ -TGGCATCGTGGACGTCTCAT-3’(序列表中序列9)；
內(nèi)部陽性控制序列Taqman 熒光探針TET 5’-ATACTTGGTAAGAATCCTT-3’TAMRA (序列表中序列10)；
ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCT GGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCAT AACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCC AAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGG C-3’(序列表中序列11);
ABL基因上游引物序列為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；
ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；
ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6);
其中，內(nèi)部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的TEL-AMLl融合基因序列和一部分人工合成序列；內(nèi)部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標準品。
上述引物序列、控制序列、基因序列、基因序列、探針序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有TEL-AMLl融合基因的總RNA樣品為陽性對照，采用上述實施例I中提供的本發(fā)明試劑盒組成①RNA提取試劑 Trizol試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經(jīng)確診的含有TEL-AMLl融合基因的兒童急性淋巴細胞性白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。
⑤TEL-AMLl融合基因熒光定量PCR的反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測TEL-AMLl融合基因的引物、探針組成1X的PCR預混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號 210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 TEL-AMLl 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0. 25pmol/yL的TEL-AMLl融合基因下游引物(序列表中序列2)、 O. 3pmol/ μ L的TEL-AML1融合基因Taqman突光探針(序列表中序列3)、0. 25pmol/ μ L的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物 (序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10) (以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA),其余為無RNase去離子水，反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
⑥ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內(nèi)參基因的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL內(nèi)參基因上游引物(序列表中序列4)、 O. 25pmol/ μ L的ABL內(nèi)參基因下游引物(序列表中序列5)、0. 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman 熒光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，加入ABL基因標準品模板2 μ L,其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
⑦內(nèi)部陽性控制序列熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測內(nèi)部陽性控制序列的引物、探針組成ix的PCR預混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號=210212, 2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 μ L的模板(內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)， 其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
3、PCR擴增程序的設(shè)定在Iightcycler儀器上先經(jīng)過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經(jīng)過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環(huán)。
實施例2.用實施例I制備的試劑盒檢測TEL-AMLl融合基因mRNA的表達量
以檢測30例兒童急性淋巴細胞性白血病骨髓組織標本結(jié)果為例。
用實施例I提供的本發(fā)明的試劑盒檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達量的檢測流程為首先根據(jù)基因序列設(shè)計特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床兒童急性淋巴細胞白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制 ABL內(nèi)參基因和內(nèi)部陽性控制序列的熒光定量PCR反應(yīng)液，將內(nèi)部陽性控制序列標準品和 ABL標準品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖IA和圖IB所ττΟ和ABL標準品標準曲線(如圖2Α和圖2Β 所示)，然后再配制TEL-AMLl融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液，進行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中讀出CT值結(jié)果。PCR擴增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復檢測。當內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進行計算，分別計算TEL-AMLl融合基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結(jié)果采用軟件分析， 并標化計算樣本數(shù)據(jù)。
具體步驟如下
①兒童急性淋巴細胞性白血病骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提兒童急性淋巴細胞性白血病骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算RNA的純度與濃度，用 O. 1% DEPC處理的水調(diào)節(jié)抽提的各樣品RNA至相同濃度。
②反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L，10X 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2yL，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 0. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0.5yg 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml內(nèi)部陽性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保溫 IOmin,隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/ L MgCl24y L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 0. 5 μ g和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U，補加無RNase去離子水至總體積20 μ L，于42°C 保溫15min,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶， 加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L, IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。
③將內(nèi)部陽性控制基因序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為 I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實施例I提供的內(nèi)部陽性控制序列和ABL內(nèi)參基因的熒光定量PCR反應(yīng)液，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所示)。
④TEL-AMLl融合基因熒光定量PCR擴增PCR反應(yīng)體系為20yL :含IXPCR預混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、 0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，TEL-AMLl融合基因上游引物終濃度0. 2mol/L, TEL-AMLl融合基因下游引物終濃度 0. 2 μ mol/L, TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,被測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNAl. 0μ L，同時加入內(nèi)部陽性控制序列的上、下游引物終濃度為均為0. 2 μ mol/ L，內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,終濃度為0. 2 μ mol/L的內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA (②中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，加入超純水至總體積20yL。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴增條件為95°C IOmin預變性，然后 950C 15s,60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑤ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR擴增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液 (Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物終濃度均為0. 2 μ mol/L, ABL基因的Taqman熒光探針終濃度0. 2 μ mol/L, ABL 基因cDNAl. O μ L,加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler突光定量PCR 儀上反應(yīng)擴增條件為950C IOmin預變性，然后95°C 15s, 60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，TEL-AMLl 融合基因上、下游引物終濃度均為0. 2 μ mol/L, TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針終濃度O. 3 μ mol/L,陽性對照RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA LOyL或者陰性對照去離子水I. O μ L，加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集突光信號。
⑦數(shù)據(jù)收集處理和分析PCR擴增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴增結(jié)果， 如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進行檢測。當內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進行計算，得出 TEL-AMLl融合基因相對于ABL內(nèi)參基因的相對表達量后再進行統(tǒng)計分析，以比值大于或等于O. 0001為陽性表達，小于O. 0001為陰性表達(具體參見表I)
表I為熒光定量PCR分析TEL-AMLl融合基因在兒童急性淋巴細胞性白血病的表達
權(quán)利要求
1.一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括TEL-AMLl融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 TEL-AMLl融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示； TEL-AMLl融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6 ； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQIDNO: 10 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述TEL-AMLl融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有TEL-AMLl融合基因的總RNA樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgCl2 4μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測TEL-AML1融合基因mRNA表達量的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括TEL-AML1融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針。TEL的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域與AML1的DNA結(jié)合和激活區(qū)域融合，從而抑制AML1的轉(zhuǎn)錄活性，使造血干細胞分化能力減低，白血病細胞增殖增加。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測TEL-AML1 mRNA水平，其檢測結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高。該試劑盒為臨床評估兒童急性淋巴細胞性白血病的預后以及復發(fā)周期提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102925575SQ201210443569
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者李艷, 童永清 申請人:李艷, 童永清