一種代謝工程改造大腸桿菌產(chǎn)圣草酚的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種代謝工程改造大腸桿菌產(chǎn)圣草酚的方法，屬于代謝工程領域。本發(fā)明通過基因工程技術，在大腸桿菌中將截去膜結合序列的黃酮3’羥化酶基因tF3’H和P450還原酶基因tCPR兩個基因融合表達，成功實現(xiàn)了柚皮素轉化圣草酚的步驟。同時表達來自R.glutinis的酪氨酸解氨酶基因TAL，P.crispum的4-香豆酸：輔酶A連接酶基因4CL，P.hybrida的査爾酮合成酶基因CHS和M.sativa的查爾酮異構酶基因CHI實現(xiàn)由酪氨酸直接生產(chǎn)柚皮素，從而構建得到由酪氨酸直接生產(chǎn)圣草酚的工程菌株。為進一步提高圣草酚產(chǎn)量，本發(fā)明敲除了大腸桿菌基因組中的乙酸激酶ackA基因，并過量表達乙酰輔酶A合成酶基因acs和乙酰輔酶A羧化酶基因ACC，最終圣草酚的產(chǎn)量可達106.7mg/L。
【專利說明】一種代謝工程改造大腸桿菌產(chǎn)圣草酚的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種代謝工程改造大腸桿菌產(chǎn)圣草酚的方法，屬于代謝工程領域。
【背景技術】
[0002]近年來黃酮類化合物的抗氧化、抗炎、抗癌等對人類的保健和藥用價值越來越得到科研人員的關注。以圣草酚為例，圣草酚具有抗菌抗炎的作用，在糖尿病的發(fā)病機制中起著至關重要的作用，可以抑制IgE/Ag誘導I型過敏反應，還具有止痛及溫熱作用。
[0003]盡管黃酮類物質對健康有眾多益處，但該類物質的來源是其運用于保健醫(yī)療的的一個重大障礙?；瘜W合成法多伴有有毒副產(chǎn)物和需要極端反應條件等不利因素，因而不利于大規(guī)模生產(chǎn)黃酮類物質。運用代謝工程技術改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)圣草酚有望成為很好的解決方案。
[0004]采用代謝工程技術改造大腸桿菌，以酪氨酸為底物合成圣草酚在國內國外均未見報道。這主要是大腸桿菌內缺少P450單氧加酶家族的輔因子-P450還原酶以及P450細胞色素單氧加酶很難有效的可溶性表達。之前的研究，均以價格昂貴且微生物不能自身合成的咖啡豆酸(Caffeic acid)為底物合成圣草酹。Leonard等開發(fā)了從咖啡豆酸為底物的一條圣草酹代謝途徑，他們在大腸桿菌中過量表達來自歐療(Petroselinum cri spurn)的4CL，矮牽牛(Petunia X hybrid)的 CHS 和紫苜猜(Medicago sativa)的 CHI,以咖啡豆酸為底物成功獲得了圣草酚產(chǎn)物。之后，研究人員在此途徑基礎上強化了丙二酰輔酶A代謝途徑，使最終圣草酚產(chǎn)量達到了 114mg/L。
[0005]本發(fā)明，在L-酪氨酸合成柚皮素這一重要的黃酮骨干途徑的基礎上融合表達截去N端膜結合域的非洲菊(Gerbera hybrid)黃酮3’輕化酶(tF3’ H)和長春花(Catharanthus roseus)的P450還原酶(tC`PR),成功實現(xiàn)了屬于P450單氧加酶家族的F3’H在大腸桿菌中的可溶性表達，使大腸桿菌能利用價格便宜且自身能夠合成的酪氨酸為底物合成圣草酚。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種以酪氨酸為底物直接合成圣草酚的大腸桿菌基因工程菌，通過基因工程和代謝工程技術，在大腸桿菌內構建了由酪氨酸合成柚皮素的途徑，并融合表達了截去膜結合序列的黃酮3’羥化酶基因tF3’ H和P450還原酶基因tCPR以實現(xiàn)由柚皮素向圣草酚轉化的途徑。
[0007]所述大腸桿菌基因工程菌是以敲除了基因組乙酸激酶ackA基因的大腸桿菌為宿主，過表達了乙酰輔酶A合成酶基因和乙酰輔酶A羧化酶基因，從而阻斷乙酰輔酶A的醋酸鹽副產(chǎn)物途徑，增加轉化丙二酰輔酶A的通量以強化丙二酰輔酶A途徑。
[0008]所述乙酰輔酶A合成酶基因acs來自E.coli BL21 (DE3)基因組，乙酰輔酶A羧化酶基因acc (包括accBC和dtsRl兩個基因)來自谷氛酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC13032)。所述乙酰輔酶A合成酶基因acs、乙酰輔酶A羧化酶accBC和乙酰輔酶A羧化酶dtsRl的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示，它們通過克隆到載體pRSFDuet-Ι (購自德國諾維信公司)，得到重組表達載體pRSF-acs-ACC,然后轉化大腸桿菌進行表達。
[0009]所述大腸桿菌基因工程菌表達了融合基因tF3’H_tCPR，以實現(xiàn)柚皮素向圣草酚的轉化。所述融合基因tF3’ H-tCPR的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，是截去膜結合序列的源于非洲菊(Gerbera hybrid)的黃酮3’輕化酶基因tF3’ H和長春花(Catharanthusroseus)的P450還原酶基因tCPR這兩個基因的融合基因。所述tF3’H-tCPR基因通過克隆于pACYCDuet-Ι (購自德國諾維信公司)，得到重組質粒pACYC_tF3’ H-tCPR,然后轉化大腸桿菌進行表達。
[0010]所述大腸桿菌基因工程菌還表達了來自粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶基因tal,來自歐療(Petroselinum cri spurn)的4-香豆酸:輔酶A連接酶基因4cl,來自矮牽牛(Petunia Xhybrid)的查爾酮合成酶基因CHS以及來自紫苜猜(Medicagosativa)的查爾酮異構酶基因chi，以實現(xiàn)酪氨酸向柚皮素的轉化；編碼所述TAL、4CL的基因通過克隆到載體P⑶FDuet-1 (購自德國諾維信公司)，得到P⑶F-TAL-4CL，編碼所述CHS和CHI的基因通過克隆到載體pETDuet-Ι (購自德國諾維信公司)，得到pET-CHS-CHI。
[0011]本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供所述大腸桿菌基因工程菌的構建方法，其主要步驟如下:
[0012](I)合成融 合基因tF3 ’ H-tCPR，連接載體pACYCDuet-Ι，得到重組表達載體pACYC-tF3，H-tCPR ；
[0013](2)敲除E.coli的乙酸激酶ackA基因，強化丙二酰輔酶A途徑；
[0014](3)將編碼乙酰輔酶A合成酶的基因和乙酰輔酶A羧化酶的基因克隆到載體pRSFDuet-Ι,構建重組表達載體pRSF-acs-ACC ；
[0015](4)將編碼酪氨酸解氨酶的基因tal、4_香豆酸:輔酶A連接酶的基因4cl克隆到P⑶FDuet-1構建重組表達載體P⑶F-TAL-4CL，將編碼查爾酮合成酶的基因chs以及查爾酮異構酶基因chi克隆到載體pET Duet-1構建重組表達載體pET-CHS-CHI ；
[0016](5)將重組表達載體 pACYC-tF3’ H-tCPR、pRSF-acs-ACC、pCDF_TAL_4CL 和pET-CHS-CHI 一起轉化敲除了乙酸激酶ackA基因的E.coli BL21 (DE3)。
[0017]應用所述大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)圣草酚的方法，是將改造的工程菌株在25mLLB培養(yǎng)基中，于溫度37°C、轉速200rpm的搖床上過夜培養(yǎng)，然后以2%接種量轉接到25mL發(fā)酵MOPS培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，待菌種生長至OD6tltl=L 2-1.8時，添加新鮮的25mL發(fā)酵MOPS培養(yǎng)基和終濃度為0.6mM的IPTG誘導以及ImM的L-酪氨酸為底物，轉至25°C低溫誘導培養(yǎng) 48h。
[0018]所述發(fā)酵MOPS 培養(yǎng)基(/L):Κ2ΗΡ041.32mM、NH4C19.52mM、MgCl20.523mM、K2SO40.276mM、FeSO40.01mM, CaCl25 X 10_4mM、NaC150mM、M0PS40mM、Tricine4mM、(NH4) 6 (MO7) 243 X I(T6HiM、H3B034 X l(T4mM、CoC123 X l(T6mM、CuS04l(T5mM、MnCl28 X l(T5mM、ZnS0410_5mM、葡萄糖 5g,調節(jié) pH 至 7.4。
[0019]本發(fā)明在L-酪氨酸合成柚皮素這一重要的黃酮骨干途徑的基礎上融合表達tF3’ H-tCPR，成功實現(xiàn)了以L-酪氨酸為底物合成圣草酚。之前的研究，均需要添加價格昂貴且大腸桿菌不能自身合成的咖啡豆酸為底物才能合成圣草酚。本發(fā)明以價格便宜且微生物能夠自身合成的L-酪氨酸為底物合成圣草酚，降低了生產(chǎn)成本提高了經(jīng)濟效益，并且為將來進一步降低成本以葡萄糖為底物合成圣草酚奠定了基礎。本發(fā)明為其他需要植物P450家族參與的羥基黃酮合成提供了一種有效的借鑒，使能夠從L-酪氨酸甚至是葡萄糖這樣的廉價底物出發(fā)獲得更多種能運用于藥品和營養(yǎng)化學品領域的高價值黃酮類物質。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1黃酮3’羥化酶和P450還原酶功能融合蛋白。截短和修飾的F3’ H和CPR被重命名為tF3’ H和tCPR，tF3’ H和tCPR通過PCR技術融合，tF3’ H-tCPR融合蛋白具有一段 Gly-Ser-Thr linker 序列。
[0021]圖2圣草酚合成途徑
[0022]A.圣草酹合成途徑包括5個酶:來自R.glutinis的酪氨酸解氨酶TAL, P.crispum的4-香豆酸:輔酶A連接酶4CL, P.hybrida的查爾酮合成酶CHS, M.sativa的查爾酮異構酶CHI以及G.hybrid的黃酮3’羥化酶F3’ H和C.roseu的P450還原酶CPR融合蛋白。
[0023]B.強化丙二酰輔酶A途徑包括三個酶:由C.glutamicum的accBC和dtsRl基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶ACC，E.coli的乙酰輔酶A合成酶ACS和敲除E.coliBL21 (DE3)的乙酸激酶AckA。
【具體實施方式】
[0024]圣草酚含量的測定方法:
[0025](I)樣品處理:取發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液25mL，轉移入50mL EP管中，于液氮中冷凍后置于冷凍干燥機中凍干，凍干后加入25mL 二甲基亞砜(DMSO)復溶；5000rpm，4°C離心IOmin后取上清，經(jīng)0.45 μ m過`濾膜過濾至液相瓶。
[0026](2)圣草酚及相應代謝物的測定:使用日本島津LCMS-1T-T0F液相質譜聯(lián)用儀檢測。采用SHIM-PACKVP-ODS 150LX2.0柱子進行液相分離:流速0.2mL/min的梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，0minl0%B，10min40%B，15min60%B，17min 恢復到初始的 10%B。液相柱分離后，經(jīng)電噴霧電離源(ESI)進入MS檢測器，采用負離子模式檢測，檢測條件為:檢測電壓，1.60kV;霧化氣體(N2)流量1.5L/min;干燥氣體(N2)流量，200kPa;離子富集時間，30ms ;二級質譜(MS2)碰撞能量設置為40% ; 一級質譜(MS1)掃描范圍為m/Z100-300 ；二級質譜(MS2)掃描范圍為m/z50-300。多級檢測模式(MRM)用于圣草酚及相應代謝物的定量定性。
[0027]實施例ltF3’ H-tCPR表達載體的構建
[0028]MLRC 二級結構預測方法分析黃酮3’羥化酶(F3’ H)的蛋白質二級結構，確定N端25aa可能為F3’ H的膜結合部位。設計引物以pUC57_F3’ H(F3’ H由南京金斯瑞公司密碼子優(yōu)化合成并克隆于PUC57載體，優(yōu)化后F3’H序列見SEQ ID N0.5)為模板，PCR擴增得到
1.47kb的截去膜結合域、5’端帶有NdeI限制性酶切位點、3’端帶有Gly-Ser-Thr linker序列以及18bp CPR同源臂的目的基因tF3’H。以pUC57_CPR為模板(CPR由南京金斯瑞公司密碼子優(yōu)化合成并克隆于PUC57載體，優(yōu)化后CPR序列見SEQ ID N0.6) PCR擴增得到大小1.94kb的截去膜結合域的目的基因、5’端帶有Gly-Ser-Thr linker序列以及22bpF3’H同源臂和3’端帶有KpnI限制性酶切位點的目的基因tCPR。再以此兩目的基因為模板，融合PCR，得到大小為3.41kb的融合基因tF3’H-tCPR，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。將融合基因tF3’H-tCPR克隆至質粒pACY⑶uet-Ι (購自德國諾維信公司)中，得到重組質粒 pACYC-tF3’ H-tCPR ο
[0029]實施例2強化丙二酰輔酶A途徑的構建
[0030]利用Red同源重組敲除技術，敲除E.coli基因組中乙酸激酶基因(ackA)從而阻斷乙酰輔酶A的醋酸鹽副產(chǎn)物途徑，增加轉化丙二酰輔酶A的通量。以質粒pKD13(購自CGSChttp: //cgsc.biology, yale.edu/)為模板,經(jīng)PCR得到1.40kb的兩端帶有乙酸激酶基因(ackA)上下游50bp同源臂的目的片段ackA::kan (序列見SEQ ID N0.7)。將ackA::kan片段電轉化攜帶 pKD46 (購自 CGSChttp: //cgsc.biology, yale.edu/)的 E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，由于敲除成功的菌株同源重組了 ackA::kan片段，重組菌對卡那霉素具有一定的抗性。經(jīng)篩選得到能在卡那平板上生長的敲除菌株。提取此敲除菌株基因組，經(jīng)PCR得到大小約為1.40kb的特異性條帶，而以未經(jīng)敲除操作的E.coli BL21 (DE3)基因組為模板進行PCR，沒有產(chǎn)生特異性條帶，說明乙酸激酶基因(ackA)已經(jīng)從E.coliBL21(DE3)基因組中成功敲除。
[0031]由于本研究之后要用到卡那抗性、氨芐抗性和氯霉素的質粒，因此基因組中的卡那抗性以及Red系統(tǒng)的質粒必須需要消除?？剐曰虻娜コ捎幂o助質粒pCP20購自(CGSChttp://cRsc.biology, yale.edu/),經(jīng)消除操作挑取單菌落至無抗性和含有卡那抗性、氨芐抗性和氯霉素的抗性平板，以驗證抗性基因和PCP20、pKD46質粒是否成功去除。在無抗性平板上能生長，在卡那抗性、氨芐抗性和氯霉素平板上不能生長的即為成功消除抗性標記和Red系統(tǒng)質粒的敲除菌株。
[0032]以E.coli BL21(DE3)的基因組為模板，PCR得到1.96kb兩端具有BamHI和NotI兩個限制性酶切位點的目的片段acs(序列見SEQ ID N0.2)。以C.glutamicum ATCC13032的基因組為模板，PCR獲得1.77kb兩端具有EcoRV和KpnI限制性酶切位點的目的基因accBC(序列見SEQ ID N0. 3)，PCR擴增得到1.63kb兩端具有KpnI和AvrII限制性酶切位點的的目的基因dtsRl (序列見SEQ ID N0.4)。將目的片段acs、accBC和dtsRl分別克隆至質粒pRSFDuet-Ι (購自德國諾維信公司)中，得到重組質粒pRSF-acs-ACC。
[0033]實施例3圣草酚工程菌的構建
[0034]將得到的重組表達載體pACYC_tF3 ’ H-tCPR和pRSF-acs-ACC與本實驗室構建的 PCDF-TAL-4CL 和 pET-CHS-CHI (構建方法參見文獻:WuJ, Du G, Zhou J, Chen J.2012.Metabolic engineering of Escherichia coli for(2S)-pinocembrin production fromglucose by a modular metabolic strategy.Metab.Eng.16:48-55.)一起轉化敲除的乙酸激酶ackA基因的E.coli BL21(DE3)，經(jīng)抗性平板篩選和菌落PCR鑒定，得到圣草酚工程菌株。
[0035]實施例4發(fā)酵產(chǎn)圣草酚
[0036]發(fā)酵MOPS 培養(yǎng)基(/L) =K2HPO4L 32mM、NH4C19.52mM、MgCl20.523mM、K2SO40.276mM、FeSO40.01mM, CaCl25 X l(T4mM、NaC150mM、M0PS40mM、Tricine4mM、(NH4) 6 (MO7) 243 X l(T6mM、H3B034X l(T4mM、CoC123X l(T6mM、CuS04l(T5mM、MnCl28 X l(T5mM、ZnS04l(T5mM、葡萄糖 5g，調節(jié)pH 至 7.4。
[0037]工程菌株培養(yǎng)條件:改造的工程菌株在25mLLB培養(yǎng)基中，于溫度37°C、轉速200rpm的搖床上過夜培養(yǎng)，然后以2%接種量轉接到25mL發(fā)酵MOPS培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，待菌種生長至待0D_=1.2-1.8時，添加新鮮的25mL發(fā)酵MOPS培養(yǎng)基和終濃度為0.6mM的IPTG誘導以及ImM的L-酪氨酸為底物，轉至25°C低溫誘導培養(yǎng)48h。改造的工程菌株圣草酚產(chǎn)量達到106.7mg/L ;只含空質粒的對照組菌株圣草酚產(chǎn)量為O。
[0038]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準`。
【權利要求】
1.一種以酪氨酸為底物合成圣草酚的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，在大腸桿菌內構建了由酪氨酸合成柚皮素的途徑，并融合表達了截去膜結合序列的黃酮3’羥化酶基因tF3’ H和P450還原酶基因tCPR以實現(xiàn)由柚皮素向圣草酚轉化的途徑。
2.根據(jù)權利要求1所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，敲除了大腸桿菌基因組乙酸激酶ackA基因，過表達了乙酰輔酶A合成酶基因和乙酰輔酶A羧化酶基因以強化丙二酰輔酶A途徑。
3.根據(jù)權利要求2所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，乙酰輔酶A合成酶基因acs來自E.coli BL21(DE3)基因組，乙酰輔酶A羧化酶基因acc來自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)。
4.根據(jù)權利要求1所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，通過表達來自粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶基因 tal,來自歐芳:(Petroselinum crispurn)的4-香豆酸:輔酶A連接酶基因4cl,來自矮牽牛(Petunia X hybrid)的查爾酮合成酶基因CHS以及來自紫苜猜(Medicago sativa)的查爾酮異構酶基因chi,實現(xiàn)酪氨酸合成柚皮素的途徑。
5.根據(jù)權利要求1所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，所述tF3’H和tCPR的融合基因tF3’ H-tCPR的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，是截去膜結合序列的源于非洲菊(Gerbera hybrid)的黃麗 3’輕化酶基因 tF3’H 和長春花(Catharanthus roseus)的 P450還原酶基因tCPR的融合基因。
6.根據(jù)權利要求5所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，所述tF3’H-tCPR基因通過克隆于pACYCDuet-Ι，得到重組質粒pACYC_tF3’ H_tCPR，然后轉化大腸桿菌進行表達。
7.根據(jù)權利要求4所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，編碼所述TAL、4CL的基因通過克隆到載體P⑶FDuet-1，得到P⑶F-TAL-4CL，編碼所述CHS和CHI的基因通過克隆到載體 pETDuet -Ι，得到 pET-CHS-CHI。
8.根據(jù)權利要求3所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，所述乙酰輔酶A羧化酶基因acc包括accBC和dtsRl兩個基因，所述基因acs、accBC和dtsRl的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示，它們通過克隆到載體pRSFDuet-1，得到重組表達載體pRSF-acs-ACC，然后轉化大腸桿菌進行表達。
9.一種構建權利要求1所述大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，主要步驟如下: Cl)合成融合基因tF3’ H-tCPR，連接載體pACYCDuet-Ι，得到重組表達載體pACYC-tF3，H-tCPR ； (2)敲除E.coli的乙酸激酶ackA基因，強化丙二酰輔酶A途徑； (3)將編碼乙酰輔酶A合成酶的基因和乙酰輔酶A羧化酶的基因克隆到載體pRSFDuet-Ι,構建重組表達載體pRSF-acs-ACC ； (4)將編碼酪氨酸解氨酶的基因tal、4-香豆酸:輔酶A連接酶的基因4cl克隆到P⑶FDuet-1構建重組表達載體P⑶F-TAL-4CL，將編碼查爾酮合成酶的基因chs以及查爾酮異構酶基因chi克隆到載體pET Duet-1構建重組表達載體pET-CHS-CHI ； (5)將重組表達載體pACYC-tF3’H-tCPR、pRSF-acs-ACC、pCDF-TAL-4CL 和 pET-CHS-CHI一起轉化敲除了乙酸激酶ackA基因的E.coliBL21 (DE3)。
10.一種應用權利要求1所述大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)圣草酚的方法，其特征在于，是將工程菌株在25mL LB培養(yǎng)基中，于溫度37°C、轉速200rpm的搖床上過夜培養(yǎng)，然后以2%接種量轉接到25mL發(fā)酵MOPS培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，待菌種生長至OD6tltl=L 2-1.8時，添加新鮮的25mL發(fā)酵MOPS培養(yǎng)基和終濃度為0.6mM的IPTG誘導以及ImM的L-酪氨酸為底物，轉至25°C低溫誘導培養(yǎng)48h。`
【文檔編號】C12R1/19GK103865864SQ201410076587
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權日:2014年3月4日
【發(fā)明者】陳堅, 周景文, 朱賽杰, 堵國成 申請人:江南大學