專利名稱：增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因IuxAB及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌發(fā)光基因操縱子IuxCDABE來源于Photorhabdus luminescens。因?yàn)闄z測靈敏方便而被作為報(bào)告基因廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、快速檢測、有毒有害物質(zhì)分析等領(lǐng)域。其中IuxA和IuxB基因分別編碼細(xì)菌熒光素酶異二聚體的a (催化亞基，401^))和P (調(diào)節(jié)亞基，36kD)亞基，只有兩個(gè)亞基共存時(shí)才有活性，當(dāng)將IuxA和IuxB基因融合表達(dá)后形成的單體蛋白仍然具有與野生型異二聚體蛋白相當(dāng)?shù)陌l(fā)光活性，經(jīng)密碼子優(yōu)化后該融合蛋白在真核生物中也具有很高的活性。IuxCDE編碼脂肪酸還原酶和合成酶，用于合成細(xì)菌熒光素酶所作用的底物十四烷醛。為了克服真核生物來源熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)需要外加底物的缺點(diǎn)，最近國外有研究人員通過將1uxC、1uxD和IuxE基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共表達(dá)成功構(gòu)建了產(chǎn)細(xì)菌熒光素酶底物的穩(wěn)定細(xì)胞系[30]，由于IuxA和IuxB基因融合型單體蛋白和非融合型二聚體蛋白均可在真核生物細(xì)胞系中功能表達(dá)，這一研究就此宣告了細(xì)菌熒光素酶真核活體實(shí)時(shí)自動(dòng)化報(bào)告基因檢測系統(tǒng)的成功，也為基于細(xì)菌熒光素酶的自動(dòng)化雙分子互補(bǔ)活體實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)蛋白相互作用檢測系統(tǒng)今后在真核生物中的應(yīng)用提供了擔(dān)保，奠定了基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:`增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因IuxAB作為生物發(fā)光報(bào)告基因的應(yīng)用。本專利申請發(fā)明人將IuxA和IuxB基因融合表達(dá)后形成的單體蛋白經(jīng)過易錯(cuò)PCR突變和化學(xué)隨機(jī)突變，克隆到pBluescriptll載體中，篩選得到9個(gè)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的突變體，然后經(jīng)過shuffling技術(shù)，得到一個(gè)增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB。
圖1 為 pDM4_luxCDABE 基因及 MCS ;圖2 為 pBluescriptll 質(zhì)粒圖譜；圖3為IuxA和IuxB基因融合單體克隆不意圖；圖4為易錯(cuò)PCR突變IuxAB融合單體蛋白發(fā)光強(qiáng)度檢測；圖5為shuffling過程圖解；圖6為突變體經(jīng)過shuffling后篩選結(jié)果；圖7為不同濃度的底物(十四醛)對細(xì)菌熒光素酶IuxAB熒光強(qiáng)度的影響；
圖8為增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB基因在大腸桿菌E.coli DH5 a熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果，PB-1uxABs為增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶的熒光強(qiáng)度，pB-luxAB是陰性對照組；圖9為增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB基因在谷氨酸棒狀桿菌中熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果，I組為增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶的熒光強(qiáng)度，2組是陰性對照組；
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。一.材料與方法1.分子生物學(xué)試劑各種限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司，T4DNA連接酶為NewEngland Biolab公司產(chǎn)品，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn):MakerIII和DL5000+2000購自天根生物科技(北京)有限公司。研究中用到的抗生素濃度如下:氨芐青霉素IOOy g/mL，卡那霉素IOOy g/mL，氯霉素30 u g/mL,萘啶酸15 u g/mL。培養(yǎng)大腸桿菌一律采用LB培養(yǎng)基:10%蛋白胨，5%酵母膏，10%NaCl ;培養(yǎng)Yp采用YLB培養(yǎng)基:10%蛋白胨，5%酵母膏，5%NaCl。2.實(shí)驗(yàn)材料:大腸桿菌E.coli DH5 a ；YPIII假結(jié)核耶爾森氏菌菌株由英國諾丁漢大學(xué)購買；pDM4-lux Box (含有IuxCDABE基因序列)由英國諾丁漢大學(xué)購買；質(zhì)粒pBluescipt II購自大連寶生物公司(如圖2);質(zhì)粒pKT25 ；pDM4均從天根生物公司購買。3.克隆構(gòu)建本研究中所有克隆均采用此方法構(gòu)建。首先以YpIII基因組為模板擴(kuò)增目的基因。PCR 的反應(yīng)體系為 50iiL:去離子水(ddH20) 33.5iiL，10XPCR buffer5u L,dNTPs (2mM each) 5 u L, MgS04 (25mM) 2 u L,正反向弓丨物(IOy M)各 1.5yL，模板DNA0.5 ii L，KOD-Plus-(lU/ii L) I ii L。PCR 程序?yàn)?94。C，2.5min ; (94 ° C，15s ;60。Cto50。C，30s,每個(gè)循環(huán)降低 0.5。C ；68 ° C，0.5min) X20 ; (94。C，15s ;50。C，30s ;68° C，0.5min) X 10。PCR產(chǎn)物用含0.5 y g/mL溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳條件為:I X TAE緩沖液，電壓5V/cm,電泳40min。在紫外燈下切下目的條帶,用上海生工凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，回收操作方法見試劑盒說明書。擴(kuò)增產(chǎn)物50 U L雙酶切反應(yīng)體系包括:PCR產(chǎn)物20 U L，buffer5 U L，限制性內(nèi)切酶各I y L ;載體50 ii L酶切體系:8 ii L載體質(zhì)粒，buffer5 u L，限制性內(nèi)切酶各I y L，最后用ddH20補(bǔ)足體積至50iiL。酶切后回收。連接反應(yīng):連接體系包括目的片段6.5 iiL，酶切后的載體2.5 ii L，
T4bufferl U L，T4DNA連接酶0.3 ii L，充分混勻后16°過夜連接。4.感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化方法研究中所有E.coli感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化均采用Ca2+轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。10 ii L連接產(chǎn)物加入到100 uL E.coli S17-1鈣轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞并輕輕混勻，冰浴30min，42° C水浴熱激90s,再冰浴3min,加入ImL新鮮LB培養(yǎng)基,置恒溫?fù)u床中37° C80rpm復(fù)蘇45min, 5000rpm離心3min，去除800 u L上清，用剩余的培養(yǎng)基重懸菌體后涂含有Cm的LB平板，37° C培養(yǎng)過夜。YpIII野生型及突變體感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法，在-80°冰箱中取出感受態(tài)冰上融化，同時(shí)電轉(zhuǎn)杯也放在冰上，電轉(zhuǎn)化電壓1800V，將產(chǎn)物與IOOii L感受態(tài)混合，放入電轉(zhuǎn)杯中，脈沖結(jié)束后盡快取出電轉(zhuǎn)杯將電轉(zhuǎn)產(chǎn)物加入到900 ii L LB培養(yǎng)基中，隨后30° C 復(fù)蘇 lh。二.1uxA和IuxB基因異二聚體的融合:細(xì)菌發(fā)光基因操縱子IuxCDABE來源于Photorhabdus luminescens,我們實(shí)驗(yàn)室的IuxCDABE操縱子序列在pDM4質(zhì)粒中(如圖1)，IuxA和IuxB基因分別編碼細(xì)菌熒光素酶異二聚體的a (催化亞基，401^))和P (調(diào)節(jié)亞基，36kD)亞基，Iux⑶E分別編碼脂肪酸轉(zhuǎn)移酶、還原酶和合成酶，用于合成細(xì)菌熒光素酶所作用的底物十四烷醛。LuxA和IuxB基因是兩個(gè)分開的亞基，即異二聚體，可以直接在原核中表達(dá)，作為報(bào)告基因。IuxA和IuxB基因融合型單體蛋白和非融合型二聚體蛋白均可在真核生物細(xì)胞系中功能表達(dá)，但是融合型的單體蛋白更容易表達(dá)，所以我們通過overlap PCR設(shè)計(jì)引物將IuxA亞基和IuxB亞基融合到一起，我們在IuxA和IuxB基因異二聚體間插入(GGGGS) 31 inker，以減少兩個(gè)亞基間的空間位阻。LuxA和IuxB的單體融合蛋白基因序列(突變后)序列特征見SEQ ID No:1的信肩、O我們根據(jù)SEQ ID N0.l的序列信息設(shè)計(jì)引物，其中IuxA基因的上游引物L(fēng)uxA-F-Xbal含XbaI酶切位點(diǎn)和下游引物L(fēng)uxA_R_L15含(GGGGS) 31inker。LuxB基因上游引物 luxB-F-L15 含(GGGGS) 31inker 和下游引物 LuxB-R-BglII 含有 BglII 酶切位點(diǎn)。IuxA和IuxB基因異二聚體 overlap PCR引物序列如下:LuxA-F-Xbal:5，-GCTCTAGAATGAAATTTGGAAACTTTTTGC-3’LuxA-R-LI5:5，-GCTACCTCCGCCACCACTTCCACCGCCTCCAGAACCTCCTCCACCATATAATAGCGAACGTTGTTTTTC-3’luxB-F-L15:5’ -GGTGGAGGAGGTTCTGGAGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGTAGCATGAAATTTGGATTGTTCTTCC-3，LuxB-R-BglI1:5’ -GAAGATCTTTAGGTATATTCCATGTGGTACTTC-3’LuxA和IuxB基因異二聚體的第一次擴(kuò)增:我們先用IuxA基因的上游引物L(fēng)uxA-F-Xbal含XbaI酶切位點(diǎn)和下游引物L(fēng)uxA_R_L15含(GGGGS) 31 inker兩對引物擴(kuò)增IuxA基因片段。然后用LuxB基因上游引物luxB-F-L15含(GGGGS) 31 inker和下游引物L(fēng)uxB-R-BglII含有BglII酶切位點(diǎn)擴(kuò)增IuxB基因片段。兩個(gè)片段分別純化回收，然后用回收之后的片段作為模板，進(jìn)行第二輪PCR的擴(kuò)增，使用LuxA-F-Xbal和LuxB-R-BglII兩個(gè)正反向引物擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為:第一輪PCR擴(kuò)增得到的IuxA和IuxB基因共同作為模板各 IOuL, primers 正反向引物(lOuM) LuxA-F-Xbal 和 LuxB-R-Bgl II 各 5 u L, DNA 聚合酶 I ii L，DNA 聚合酶 10 X PCR buffer5 u L, dNTP5 u L,然后用 ddH20 補(bǔ)充至 50 y L。PCR 程序?yàn)?94。C,3min ； (94° C, 30s ；50° C, 30s, ；72° C，2.5min) X 30。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠純化回收之后得到IuxA和IuxB基因的融合單體基因序列，中間用引物中的序列(GGGGS) 31 inker做連接。純化所用到的試劑和方法參見一。三.pBluescriptll-Plac::1uxAB 質(zhì)粒的構(gòu)建:
我們將IuxA和IuxB基因融合的單體序列插入到pBluescriptll質(zhì)粒中(如圖2酶切位點(diǎn)為XbaI和BamHI )，然后再XbaI和SacI位點(diǎn)插入Iac啟動(dòng)子，得到構(gòu)建的質(zhì)粒pBluescriptll-Plac,以提高IuxAB融合單體蛋白的表達(dá)量(如圖3是pBluescriptI1-Plac-1uxAB 構(gòu)建的不意圖)。四.隨機(jī)化學(xué)突變:取5ug的pBluescriptI1-Plac::1uxAB融合蛋白單體質(zhì)粒DNA,放于IOOul的反應(yīng)體系中，其中包括 0.5M 鹽酸羥胺；5mMTris-Hcl PH6.0; 0.5mM Na2EDTA;表IlOOul反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.根據(jù) 權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因IuxAB作為生物發(fā)光報(bào)告基因的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。以及所述的增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB作為生物發(fā)光報(bào)告基因的應(yīng)用。本發(fā)明將luxA和luxB基因融合表達(dá)后形成的單體蛋白經(jīng)過易錯(cuò)PCR突變和化學(xué)隨機(jī)突變，克隆到pBluescriptII載體中，篩選得到9個(gè)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的突變體，然后經(jīng)過shuffling技術(shù)，得到一個(gè)增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們看出該增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶不僅可以在革蘭氏陰性菌種表達(dá)出有活性的熒光蛋白而且還可以應(yīng)用到革蘭氏陽性菌中，是很有前景的生物發(fā)光報(bào)告基因。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103160528SQ20131007340
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者王瑤, 崔博宇, 沈錫輝, 宋云洪, 劉應(yīng)保 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)