一種熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法與流程

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法。

背景技術(shù)：

在同一條核酸鏈上起調(diào)控基因表達(dá)作用的核酸序列稱為順式作用元件，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、衰減子等；轉(zhuǎn)錄因子也被稱為反式作用因子，是一種特異性作用于啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件從而能夠?qū)Σ煌怂徭溕系幕虮磉_(dá)起調(diào)控作用的蛋白質(zhì)分子。轉(zhuǎn)錄因子要發(fā)揮作用，必須具有一定的活性，這依賴于轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量及其與順式作用元件結(jié)合的親和力?？梢?，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的活性，對(duì)于闡明某個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控的規(guī)律，具有重要意義，因而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中。

特別是，真核生物基因的表達(dá)調(diào)控是當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域最前沿的研究方向之一，而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)過程中最為重要的步驟。由于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用，以及一些復(fù)雜大分子復(fù)合物的形成，導(dǎo)致真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控更為復(fù)雜；并且，轉(zhuǎn)錄因子及其表達(dá)調(diào)控的檢測(cè)是研究其功能的重要前提基礎(chǔ)，高效、特異、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)于研究真核生物基因表達(dá)具有重要的作用。

目前，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子活性的最為常用方法有熒光定量PCR檢測(cè)，該檢測(cè)方法將轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞內(nèi)，并通過RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，或通過蛋白表達(dá)水平間接反映轉(zhuǎn)錄活性；其中，RT-PCR檢測(cè)方法需要將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，通過提取細(xì)胞中總RNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)；然而，RNA對(duì)溫度敏感且易降解，檢測(cè)時(shí)需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行目的RNA擴(kuò)增，同時(shí)選取合適的內(nèi)參及正負(fù)對(duì)照，上述這些缺陷導(dǎo)致檢測(cè)的結(jié)果不能真實(shí)反映轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性，同時(shí)可重復(fù)性差，檢測(cè)過程耗時(shí)較長(zhǎng)。

因此，現(xiàn)有技術(shù)中也提供了提取細(xì)胞中總的蛋白質(zhì)，并通過免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)量，從而從側(cè)面反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量；然而，該方法的操作更加繁瑣，并且，由于蛋白提取過程中不可避免的損失以及降解，所測(cè)得的結(jié)果并不能真實(shí)反映真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，此外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作過程不可控因素比較多，因此相較于流行的RT-PCR檢測(cè)方法而言，更加不適合于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性。

此外，中國(guó)專利CN1637417A另外提供了一種轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)方法，該方法是基于ELISA檢測(cè)方法的改進(jìn)，其特別之處是采用一種新的雙鏈寡核苷酸探針構(gòu)建，以克服ELISA檢測(cè)方法雙鏈寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)構(gòu)建所帶來的不足。然而，該新型ELISA檢測(cè)方法仍然存在操作繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)的技術(shù)問題。

借助于熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)施的熒光素酶檢測(cè)(luciferase assay)目前已被廣泛應(yīng)用于真核基因表達(dá)和細(xì)胞生理學(xué)研究，其應(yīng)用包括受體活性、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA加工和蛋白質(zhì)折疊。建立熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)單、方便，并且熒光素酶持久穩(wěn)定，因而可被用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與其啟動(dòng)子中的特異順式作用元件結(jié)合的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，即為了提供一種操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、高通量、可重復(fù)性高且準(zhǔn)確度高的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的檢測(cè)方法，發(fā)明人擬充分利用熒光素酶檢測(cè)，即借助于熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，提供一種新的檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法。

具體地，本發(fā)明記載的技術(shù)方案提供了一種熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：根據(jù)待檢測(cè)表達(dá)活性的轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)組成，確定能與所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因啟動(dòng)子序列，將篩選到的靶基因啟動(dòng)子的特定片段插入熒光素酶報(bào)告基因載體，并且，插入后的所述靶基因啟動(dòng)子的特定片段位于熒光素酶Luc的表達(dá)序列的上游，從而制得包含靶基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體；

步驟(2)：進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)與鋪板，得到待轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

步驟(3)：配制脂質(zhì)體、所述包含靶基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒的混合物，使用該混合物轉(zhuǎn)染步驟(2)所制得的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；

步驟(4)：將細(xì)胞裂解緩沖液加至所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)行裂解，收集裂解液，接著，離心所收集的裂解液，取上清液，加入至熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液中進(jìn)行熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)，并計(jì)算出熒光素酶的表達(dá)量，從而檢測(cè)出所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性。

其中，所述裂解指的是細(xì)胞裂解緩沖液A對(duì)細(xì)胞膜的裂解。

在上述方法的步驟(1)中，可以運(yùn)用已知的NCBI數(shù)據(jù)庫以及TargetScan生物學(xué)軟件等進(jìn)行預(yù)測(cè)與確定能與所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因啟動(dòng)子序列。

優(yōu)選地，在上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中，所述熒光素酶報(bào)告基因載體為啟動(dòng)子增強(qiáng)子報(bào)告載體pGL3/4-basic；該啟動(dòng)子增強(qiáng)子報(bào)告載體pGL3/4-basic優(yōu)選購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

優(yōu)選地，在上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中，所述步驟(2)包括：將目標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)于含有胎牛血清、雙抗的完全培養(yǎng)基中，并維持單層貼壁生長(zhǎng)，于37℃下，在5％CO₂的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80％后，則可開始實(shí)施步驟(3)。

優(yōu)選地，在上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中，所述步驟(3)中轉(zhuǎn)染的操作為：將所述待轉(zhuǎn)染細(xì)胞以每孔100000個(gè)接種于24孔培養(yǎng)板中，將所述混合物與培養(yǎng)基加入該培養(yǎng)板，置于37℃下的5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育6h后，吸棄所述混合物，再加新鮮培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染培養(yǎng)18～24h。

本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞裂解緩沖液，用于上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中。

優(yōu)選地，在上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中，所述細(xì)胞裂解緩沖液具有以下組分與配比：

0.2M KH₂PO₄ 4-4.5ml，如4.1-4.45ml、4.15-4.4ml、4.2-4.35ml、4.25-4.3ml；

0.2M K₂HPO₄ 44-48ml，如44.5-47ml、45-46.5ml、45.75-46.25ml；

MQ H₂O 48-52ml，如48.5-51.6ml、48.8-50.4ml、49.2-49.8ml；

Triton X-100 200μl。

本發(fā)明還提供了一種熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液，用于上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中。

優(yōu)選地，在上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中，所述熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液具有以下組分與配比：

0.25M Tris pH7.8 700μl

1M MgSO₄ 100-115μl，如102-112μl，103-110μl，104-108μl，105-107μl；

dH₂O 5870-5880μl，如5872-5879μl，5875-5878μl；

0.25M ATP 250-300μl，如255-290μl，260-285μl，270-280μl，

Luc 43-50μl，如44-48.5μl，45-48μl，46-47μl。

值得說明的是，所述細(xì)胞裂解緩沖液和所述熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液中，各組分的配比雖然以數(shù)值與單位相結(jié)合的形式示出，但是，并不限于以上數(shù)值與單位相結(jié)合的形式，換言之，實(shí)際配制所述細(xì)胞裂解緩沖液和所述熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液中的各組分時(shí)，只要保證各組分用量比例符合上述配比即可。

優(yōu)選地，在上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中，所述步驟(4)包括：

(4.1)吸棄所述培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入400μl/孔預(yù)冷的PBS，沖洗所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞1-2次，然后吸棄PBS；

(4.2)向所述培養(yǎng)板的每個(gè)孔內(nèi)加入50μl預(yù)先配制好的所述細(xì)胞裂解緩沖液A，接著，將所述培養(yǎng)板置于4℃的搖床中搖晃5-15分鐘，搖晃過程中檢查細(xì)胞是否脫落；

(4.3)收集裂解液，放入一套標(biāo)記的1.5ml EP管中，用離心機(jī)在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，得上清液；

(4.4)現(xiàn)配所述熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B，從中取146μl加入至另一套標(biāo)記的1.5ml EP管中，并將該EP管插在冰上保持低溫；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管內(nèi)，檢測(cè)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度數(shù)據(jù)；

(4.6)檢測(cè)熒光素酶濃度，校正；并計(jì)算出熒光素酶的表達(dá)量，從而檢測(cè)出所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性。

在上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中，由于所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性表現(xiàn)為能夠激活靶基因啟動(dòng)子，因此，如果所述轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶基因啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，并且如圖1所示，熒光素酶會(huì)催化熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B中的熒光素(Luc)反應(yīng)而產(chǎn)生熒光，而熒光素酶的表達(dá)量與所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性成正比。正是由于這一基因表達(dá)機(jī)制與相應(yīng)正比關(guān)系的存在，上述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法才能得以實(shí)施。

由此可見，本發(fā)明通過分子克隆的方法構(gòu)建靶基因啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，進(jìn)而應(yīng)用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)機(jī)制的研究。

綜上所述，發(fā)明人成功實(shí)施了一種熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法，該方法巧妙利用了熒光素酶自身持久穩(wěn)定并且易于檢測(cè)的特性，首先將包含靶基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，將一定數(shù)量的細(xì)胞用細(xì)胞裂解緩沖液裂解，收集含有熒光素酶的裂解液，接著離心取上清液，然后在熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)出熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并同時(shí)測(cè)得熒光素酶濃度，校正后，即可計(jì)算得到所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量，即所需要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性；由此可見，相較于現(xiàn)有技術(shù)，該方法的整個(gè)操作過程更加簡(jiǎn)單易行，耗時(shí)更短，通量更高，并且具有較高的可重復(fù)性與準(zhǔn)確度。

此外，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞裂解緩沖液和熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液，用于所述的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法，相較于購(gòu)買相應(yīng)的熒光檢測(cè)工作液而言，成本更加低廉；當(dāng)前，Promega公司壟斷了熒光素酶表達(dá)活性檢測(cè)行業(yè)絕大部分市場(chǎng)，其生產(chǎn)的1000次熒光檢測(cè)試劑盒(含熒光檢測(cè)工作液)的價(jià)格約為12000元；平均每個(gè)樣品檢測(cè)的價(jià)格達(dá)120元；100次檢測(cè)至少160-200元/樣左右；本發(fā)明所提供的熒光檢測(cè)工作液的成本價(jià)格約為3000元，可以實(shí)施約3300次，相同價(jià)格下，可實(shí)施檢測(cè)的次數(shù)是國(guó)外相應(yīng)產(chǎn)品的12-15倍，因而具有極佳的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。因此，本發(fā)明所提供的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法、以及細(xì)胞裂解緩沖液和熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液，擁有現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性檢測(cè)方法所不具備的上述綜合優(yōu)勢(shì)，該方法在表達(dá)活性檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景，并且具有優(yōu)異的市場(chǎng)潛力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中熒光素酶催化機(jī)理示意圖，其中示出了熒光素發(fā)光反應(yīng)式，可見，熒光素在熒光素酶催化下，且在Mg²⁺及ATP作用下發(fā)出了熒光；

圖2為本發(fā)明所述熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法中優(yōu)選的pGL3/4-basic載體的圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施方式。

本發(fā)明提供了一種熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)活性的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：根據(jù)待檢測(cè)表達(dá)活性的轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)組成，確定能與所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因啟動(dòng)子序列，以基因組DNA為模板，利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得靶基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)片段；然后，將所述靶基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)片段進(jìn)行酶切純化，篩選重組子；最后，將篩選到的靶基因啟動(dòng)子的特定片段插入熒光素酶報(bào)告基因載體，并且，插入后的所述靶基因啟動(dòng)子的特定片段位于熒光素酶Luc的表達(dá)序列的上游，從而制得包含靶基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體；

步驟(2)：進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)與鋪板，得到待轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

步驟(3)：配制脂質(zhì)體、所述包含靶基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒的混合物，使用該混合物轉(zhuǎn)染步驟(2)所制得的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；

步驟(4)：將細(xì)胞裂解緩沖液A加至所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)行裂解，收集裂解液，接著，離心所收集的裂解液，取上清液，加入至熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B中進(jìn)行熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)，并計(jì)算出熒光素酶的表達(dá)量，從而檢測(cè)出所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述熒光素酶報(bào)告基因載體為啟動(dòng)子增強(qiáng)子報(bào)告載體pGL3/4-basic。其中，pGL3/4-basic載體圖譜如圖2所示。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(2)包括：將目標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)于含有胎牛血清、雙抗的完全培養(yǎng)基中，并維持單層貼壁生長(zhǎng)，于37℃下，在5％CO₂的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80％后，則可開始實(shí)施步驟(3)。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(3)中轉(zhuǎn)染的操作為：將所述待轉(zhuǎn)染細(xì)胞以每孔100000個(gè)接種于24孔培養(yǎng)板中，將所述混合物與培養(yǎng)基加入該培養(yǎng)板，置于37℃下的5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育6h后，吸棄所述混合物，再加新鮮培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染培養(yǎng)18-24h。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述細(xì)胞裂解緩沖液A具有以下組分與配比：

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B具有以下組分與配比：

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(4)包括：

(4.1)吸棄所述培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入400μl/孔預(yù)冷的PBS，沖洗所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞1-2次，然后吸棄PBS；

(4.2)向所述培養(yǎng)板的每個(gè)孔內(nèi)加入50μl預(yù)先配制好的所述細(xì)胞裂解緩沖液A，接著，將所述培養(yǎng)板置于4℃的搖床中搖晃5-15分鐘，搖晃過程中檢查細(xì)胞是否脫落；

(4.3)收集裂解液，放入一套標(biāo)記的1.5ml EP管中，用離心機(jī)在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，得上清液；

(4.4)現(xiàn)配所述熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B，從中取146μl加入至另一套標(biāo)記的1.5ml EP管中，并將該EP管插在冰上保持低溫；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管內(nèi)，檢測(cè)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度數(shù)據(jù)；

(4.6)檢測(cè)熒光素酶濃度，校正；并計(jì)算出熒光素酶的表達(dá)量，從而檢測(cè)出所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性。

下述實(shí)施例中的步驟如無特別說明均為常規(guī)操作，所述試劑如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

購(gòu)買的主要試劑與儀器：

啟動(dòng)子增強(qiáng)子報(bào)告載體pGL3/4-basic(質(zhì)粒)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PBS(磷酸鹽緩沖液)購(gòu)自HyClone公司；Lipofectamin^TM2000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司；熒光表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)儀為Promega Glomax 20/20生物/化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀。試劑配制：

100ml細(xì)胞裂解緩沖液A(實(shí)驗(yàn)前預(yù)先配制)，其中：

6988μl熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B(以2*24孔為例，實(shí)驗(yàn)開始后現(xiàn)配)，其中：

開始實(shí)驗(yàn)，操作步驟如下：

(1)：明確轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)組成，確定能與所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因啟動(dòng)子序列，以基因組DNA為模板，利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得靶基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)片段；然后，將所述靶基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)片段進(jìn)行酶切純化，篩選重組子；最后，將篩選到的靶基因啟動(dòng)子的特定片段插入熒光素酶報(bào)告基因載體，并且，插入后的所述靶基因啟動(dòng)子的特定片段位于熒光素酶Luc的表達(dá)序列的上游，從而制得包含靶基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體；

(2)：將目標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清且含有雙抗的完全培養(yǎng)基中，并維持單層貼壁生長(zhǎng)，于37℃下，在5％CO₂的培養(yǎng)箱中靜置過夜培養(yǎng)，觀察目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)分別用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，以100000每孔的細(xì)胞量接種于24孔培養(yǎng)板中，置于37℃下的5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80％時(shí)，得到待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，開始實(shí)施以下步驟(3)；

(3)：配制包含靶基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)子增強(qiáng)子報(bào)告載體pGL3/4-basic/轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒/Lipofectamin^TM2000脂質(zhì)體的混合物，使用該混合物轉(zhuǎn)染所述待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，具體包括以下步驟：

(3.1)將300ng的包含靶基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)子增強(qiáng)子報(bào)告載體pGL3/4-basic、60ng的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒，溶于50μl無血清培養(yǎng)基中稀釋，室溫下孵育5min；

(3.2)將2μl的Lipofectamin^TM2000脂質(zhì)體以同樣的方式溶于50μl無血清培養(yǎng)基中稀釋，室溫下孵育5min；

(3.3)輕柔混勻(3.1)與(3.2)中配制的試劑，室溫靜置20～30分鐘，得到包含靶基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)子增強(qiáng)子報(bào)告載體pGL3/4-basic/轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒/Lipofectamin^TM2000脂質(zhì)體的混合物；

(3.4)吸棄24孔培養(yǎng)板中的原培養(yǎng)基，然后用PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗3次，將所述待轉(zhuǎn)染細(xì)胞以每孔100000個(gè)接種于該24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500μl無血清培養(yǎng)基，再將所述混合物逐滴加入該培養(yǎng)板中，并輕輕搖板均勻，置于37℃下的5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育6h后，吸棄所述混合物，再加新鮮培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染培養(yǎng)18-24h，獲得被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；

(3.5)對(duì)照組用pGL3/4-basic空載體實(shí)施平行轉(zhuǎn)染，每組均做3副孔重復(fù)3次以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

(4)：將細(xì)胞裂解緩沖液A加至所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)行裂解，收集裂解液，接著，離心所收集的裂解液，取上清液，加入至熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B中進(jìn)行熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)，并計(jì)算出熒光素酶的表達(dá)量，從而檢測(cè)出所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性，具體操作如下：

(4.1)吸棄所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所在培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入400μl/孔預(yù)冷的PBS，沖洗所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞1-2次，然后吸棄PBS；

(4.2)向所述培養(yǎng)板的每個(gè)孔內(nèi)加入50μl預(yù)先配制好的所述細(xì)胞裂解緩沖液A，接著，將所述培養(yǎng)板置于4℃的搖床中搖晃5-15分鐘，搖晃過程中檢查細(xì)胞是否脫落；

(4.3)收集裂解液，放入一套標(biāo)記的1.5ml EP管中，用離心機(jī)在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，得上清液；

(4.4)現(xiàn)配所述熒光素酶活性檢測(cè)緩沖液B，從中取146μl加入至另一套標(biāo)記的1.5ml EP管中，并將該EP管插在冰上保持低溫；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管內(nèi)，檢測(cè)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度數(shù)據(jù)；

(4.6)檢測(cè)熒光素酶濃度，校正；并計(jì)算出熒光素酶的表達(dá)量，從而檢測(cè)出所述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。