一種O?取代羥胺熒光衍生化試劑的制備與純化方法與流程

本發(fā)明涉及一種O-取代羥胺熒光衍生化試劑的制備與純化方法，純化后的試劑可用于醛類化合物或含醛基的物質(zhì)的標(biāo)記和衍生化分析測(cè)定。
背景技術(shù)：
：近年來醛類化合物日漸引起人們的關(guān)注，例如室內(nèi)空氣中的甲醛是主要污染物之一，長期吸入易導(dǎo)致多種疾病。甲醛、乙醛、丙醛等小分子醛類化合物也可以作為鑒別地溝油的指標(biāo)之一，這些醛類物質(zhì)被吸收進(jìn)入體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致各種疾病。體內(nèi)物質(zhì)經(jīng)過代謝也會(huì)產(chǎn)生醛類化合物，例如糖類化合物的代謝會(huì)生成乙二醛。人體內(nèi)的醛類化合物主要來自多不飽和脂肪酸的過氧化。多不飽和脂肪酸，例如亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等，廣泛存在于人體中，是構(gòu)成細(xì)胞膜和脂蛋白的重要組成成分。因其分子中含有不飽和雙鍵，在酶、過渡金屬離子催化下易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生一系列活性醛類化合物，例如HNE、ONE、丙烯醛、丙二醛等。這些醛類化合物分子量小、流動(dòng)性大，傳播并擴(kuò)大了氧化應(yīng)激相關(guān)的組織損傷和功能紊亂。許多種疾病，包括糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、阿茲海默癥及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等都被認(rèn)為與多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化有關(guān)?，F(xiàn)有研究表明醛類化合物在體內(nèi)可能有雙向調(diào)節(jié)的作用，即少量的醛可能引發(fā)機(jī)體自身免疫力以提高抗病能力，而過量的醛則會(huì)導(dǎo)致多種疾病，如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化等。為了研究醛類化合物在體內(nèi)的作用及其機(jī)制，必需準(zhǔn)確測(cè)定其在體液或組織中的濃度。然而醛基本身反應(yīng)活性高，不具有紫外吸收或產(chǎn)生熒光的基團(tuán)，并且其在體內(nèi)的濃度極低，一般的檢測(cè)方法無法準(zhǔn)確的進(jìn)行測(cè)定。目前常用的醛類化合物的分析方法為柱前衍生化-高效液相色譜法。根據(jù)衍生化試劑的官能團(tuán)不同又分為紫外檢測(cè)法和熒光檢測(cè)法，前者如2，4-二硝基苯肼，后者如DNSH、BODIPY等。雖然目前有大量的衍生化試劑可供選擇，但其中一些缺乏選擇性、靈敏度較低、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性差，還有一些會(huì)存在羰基化合物的干擾，尤其是生物介質(zhì)中。含肼基或羥胺取代基的熒光衍生化試劑可提高衍生化反應(yīng)的選擇性和檢測(cè)靈敏度，能夠準(zhǔn)確分析體液或組織中的微量醛類化合物，其合成具有實(shí)際的科研應(yīng)用意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)目前醛類化合物衍生化試劑缺乏選擇性、靈敏度較低、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性差，生物介質(zhì)中存在羰基化合物的干擾等缺陷，提供一種可用作醛類化合物分析檢測(cè)的羥胺取代基熒光衍生化試劑的制備和純化方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案以咔唑?yàn)槟阁w結(jié)合下式所述的反應(yīng)路線，合成目標(biāo)產(chǎn)物：本發(fā)明的制備方法及其特征在于包括有以下步驟：a)中間體I的合成將咔唑溶于反應(yīng)溶劑中，先加入α，ω-二鹵代烷烴(C2-C6)，再加入相轉(zhuǎn)移催化劑四正丁基溴化胺，攪拌均勻后緩慢滴入50％的KOH水溶液，滴加完畢于30～90℃下攪拌反應(yīng)2～6h。反應(yīng)完成后，減壓除去未反應(yīng)的溶劑得固體，用水洗后過濾，所得產(chǎn)物烘干；其中的反應(yīng)溶劑可以為α，ω-二鹵代烷烴(C2-C6)，也可以用四氫呋喃、2-丁酮、二氧六環(huán)或甲苯中的任意一種；其中α，ω-二鹵代烷的量為咔唑物質(zhì)的量的3-20倍；四正丁基溴化胺的量為咔唑物質(zhì)的量的0.01-0.2倍；50％的KOH水溶液為質(zhì)量濃度，用量為咔唑質(zhì)量的2-10倍；b)中間體II的合成將步驟a)所得產(chǎn)物用二甲基甲酰胺溶解后加入N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二酰亞胺和催化劑碳酸鉀，60-75℃下反應(yīng)2-10h；反應(yīng)結(jié)束后，萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，經(jīng)柱層析純化得白色固體即為中間體II的純品；其中N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二酰亞胺和碳酸鉀的量都為咔唑物質(zhì)的量的1-3倍；c)目標(biāo)產(chǎn)物的合成將步驟b)得到的中間體II的純品用乙醇溶解之后與水合肼加熱回流反應(yīng)0.5-2小時(shí)，減壓除去反應(yīng)液中未反應(yīng)的肼和溶劑乙醇，即得目標(biāo)產(chǎn)物粗品；d)目標(biāo)產(chǎn)物的純化向步驟c)目標(biāo)產(chǎn)物粗品中加少量水和氯仿，加鹽酸使水相呈酸性，會(huì)有白色蓬松固體析出，過濾可得目標(biāo)產(chǎn)物的鹽酸鹽；取鹽酸鹽溶于水，加氨水使溶液呈堿性，使目標(biāo)產(chǎn)物游離成為羥胺的形式，用氯仿萃取，氯仿層用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓除凈氯仿即得目標(biāo)產(chǎn)物O-(ω-(9H-咔唑-9-基)烷基)羥胺的純品。本發(fā)明中衍生化試劑的制備條件反應(yīng)溫度要求低，反應(yīng)迅速，副產(chǎn)物少，操作簡便，純化方法簡單易行，經(jīng)上述步驟制備的目標(biāo)產(chǎn)物可用于醛類化合物的衍生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明制備的熒光衍生化試劑熒光強(qiáng)度大，反應(yīng)活性高，衍生化速度快，產(chǎn)物穩(wěn)定，能提高檢測(cè)靈敏度，是理想的體內(nèi)醛類化合物分析測(cè)定的衍生化試劑。附圖說明圖1O-取代羥胺衍生化試劑與醛基的反應(yīng)。圖2O-(2-(9H-咔唑-9-基)乙基)羥胺作為衍生化試劑的色譜圖。圖中衍生化產(chǎn)物為雙峰，是由于生成了C＝N雙鍵而產(chǎn)生順反異構(gòu)體。圖3O-(2-(9H-咔唑-9-基)丙基)羥胺作為衍生化試劑的色譜圖。C2為乙醛、C3為丙醛、C4為丁醛、C5為戊醛、C6為己醛、C7為庚醛、C8為辛醛、C9為壬醛、C10為癸醛，使用該試劑時(shí)每種醛的衍生化產(chǎn)物均顯示為單峰，可能是異構(gòu)體極性一致未能分開。圖4O-(2-(9H-咔唑-9-基)丙基)羥胺作為衍生化試劑的色譜圖。使用該試劑衍生化不飽和醛時(shí)，同樣觀察到有異構(gòu)體出現(xiàn)，且分離較好，可能是C＝C雙鍵存在的原因。具體實(shí)施方式具體實(shí)施例1.下面以1，2-二氯乙烷(同時(shí)作為反應(yīng)溶劑)為例說明本發(fā)明的內(nèi)容：a)向裝置在磁力攪拌器上的圓底燒瓶中加入5g咔唑，0.96g的四丁基溴化胺和50mL的1，2-二氯乙烷，邊攪拌邊用滴液漏斗逐滴加入60g50％的KOH水溶液，之后升溫至90℃反應(yīng)6個(gè)小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除掉未反應(yīng)的1，2-二氯乙烷得棕色固體，水洗固體后過濾，烘干得淺棕色粉末狀固體，為未純化處理的中間體1。b)將上一步得到的中間體I、5.35gN-羥基-5-降冰片烯-2，3-二酰亞胺、4.14g碳酸鉀加入圓底燒瓶中，再加入適量的N，N-二甲基甲酰胺，以沒過固體為宜，在磁力攪拌器中75℃下反應(yīng)10h；反應(yīng)結(jié)束后加水和乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯層，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙酸乙酯和溶劑N，N-二甲基甲酰胺蒸出，得淡黃色固體，為未純化處理的中間體II粗品。將中間體II粗品用100-200目的硅膠柱進(jìn)行洗脫純化。雜質(zhì)洗脫用的溶劑為體積比石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1(v/v)，直至將除中間體II的其他物質(zhì)都洗脫干凈后換用乙酸乙酯沖洗即得中間體II的乙酸乙酯溶液，旋蒸除乙酸乙酯后得淡黃色固體約8.9g，即為中間體II純品。c)將8.9g的中間體II用乙醇溶解，加5mL水合肼，100℃回流反應(yīng)2h，反應(yīng)液旋蒸除去乙醇和未反應(yīng)的水合肼，得淡黃色的液體，即為目標(biāo)產(chǎn)物粗品。d)向目標(biāo)產(chǎn)物粗品中加少量水和氯仿，加鹽酸至水相呈酸性，有白色蓬松固體析出，過濾除去能溶于有機(jī)相的雜質(zhì)，可得目標(biāo)產(chǎn)物的鹽酸鹽；取鹽酸鹽固體溶于水，加氨水調(diào)至堿性使目標(biāo)產(chǎn)物重新變?yōu)榱u胺的形式，用氯仿萃取兩次，合并氯仿層，無水硫酸鈉干燥，減壓除凈氯仿即得目標(biāo)產(chǎn)物O-(2-(9H-咔唑-9-基)乙基)羥胺，該化合物物在常溫下為液體，放置于-20℃冷凍即得淡黃色固體。具體實(shí)施例2.以1，4-二氯丁烷為例，以四氫呋喃為溶劑，說明本發(fā)明的內(nèi)容：a)向裝置在磁力攪拌器上的圓底燒瓶中加入5g咔唑，0.96g的四丁基溴化胺，10mL1，4-二氯丁烷，30mL四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑，邊攪拌邊用滴液漏斗逐滴加入60g50％的KOH水溶液，滴加完畢后升溫至50℃反應(yīng)2個(gè)小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束加入水和乙酸乙酯，搖勻，靜置分層，分取乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，旋蒸除凈溶劑得固體，烘干得粉末狀固體，為未純化處理的中間體I。b)將上一步得到的中間體I、5.35gN-羥基-5-降冰片烯-2，3-二酰亞胺、4.14g碳酸鉀加入圓底燒瓶中，再加入適量的N，N-二甲基甲酰胺，以沒過固體為宜，在磁力攪拌器中60℃下反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后加水和氯仿?lián)u勻，靜置分層，取氯仿層用無水硫酸鈉干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將氯仿和溶劑N，N-二甲基甲酰胺蒸出，得灰白色固體，為未純化處理的中間體II粗品。將中間體II粗品用100-200目的硅膠柱進(jìn)行洗脫純化。雜質(zhì)洗脫用的溶劑為體積比石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1(v/v)，直至將除中間體II的其他物質(zhì)都洗脫干凈后換用乙酸乙酯沖洗即得中間體II的乙酸乙酯溶液，旋蒸除乙酸乙酯后得淡黃色固體約9.8g，即為中間體II純品。c)將9.8g的中間體II純品用乙醇溶解，加5mL水合肼，100℃回流反應(yīng)1.5h，反應(yīng)液旋蒸除去乙醇和未反應(yīng)的水合肼，得淡黃色的液體，即為目標(biāo)產(chǎn)物III粗品。d)向目標(biāo)產(chǎn)物III粗品中加少量水和氯仿，加鹽酸至水相呈酸性，會(huì)有白色蓬松固體析出，過濾除去能溶于有機(jī)相的雜質(zhì)，可得目標(biāo)產(chǎn)物III的鹽酸鹽；取此鹽酸鹽固體溶于水，加氨水使目標(biāo)產(chǎn)物III重新變?yōu)榱u胺的形式，用氯仿萃取2次，合并氯仿層，無水硫酸鈉干燥，減壓除凈氯仿即得目標(biāo)產(chǎn)物O-(4-(9H-咔唑-9-基)丁基)羥胺純品，此產(chǎn)物在常溫下為液體，放置于-20℃冷凍即得淡黃色固體。醛的衍生化操作條件及效果1、衍生化試劑的配制：a)準(zhǔn)確稱取22.6mgO-(2-(9H-咔唑-9-基)乙基)羥胺于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濃度為10mmol/L；b)準(zhǔn)確稱取24.0mgO-(2-(9H-咔唑-9-基)丙基)羥胺于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濃度為10mmol/L；2、醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：a)正己醛溶液的配制：取2.46μl的正己醛于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濃度為2mmol/L；b)飽和混合醛溶液的配制：取11.3μl乙醛，14.3μl正丙醛，17.8μl正丁醛，21.0μl正戊醛，24.6μl正己醛，27.9μl正庚醛，31.3μl辛醛，34.3μl壬醛，37.7μl癸醛于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制為濃度20mmol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋50倍為濃度0.4mmol/L；c)不飽和混和醛溶液的配制：取11.5μl己烯醛，22.0μl己二烯醛，34.9μl癸二烯醛于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，為儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋10倍，配制成濃度分別為1mmol/L、2mmol/L、2mmol/L的溶液；3、衍生化操作過程及色譜分離條件：a)O-(2-(9H-咔唑-9-基)乙基)羥胺與正己醛的反應(yīng)：取10μl2mmol/L正己醛溶液和10μl10mmol/LO-(2-(9H-咔唑-9-基)乙基)羥胺溶液，加入100μl10-4mol/L的磷酸溶液后加水至1000μl，40℃震蕩反應(yīng)15min后，取5μl進(jìn)樣。色譜分離條件：色譜柱為AgilentEclipse-C18鍵合硅膠柱(4.6mm×75mm，3.5μm)，柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-水(80∶10)，流速0.4mL/min；衍生化試劑的熒光激發(fā)和發(fā)射波長是λex/λem＝292/348nm；色譜圖見圖2。b)O-(2-(9H-咔唑-9-基)丙基)羥胺與飽和混合醛的反應(yīng)：取10μl0.4mmol/L飽和混合醛溶液和20μl10mmol/LO-(2-(9H-咔唑-9-基)丙基)羥胺溶液，加入100μl10-4mol/L的磷酸溶液后加水至1000μl，40℃震蕩反應(yīng)15min后，取10μl進(jìn)樣。色譜分離條件：色譜柱為AgilentEclipse-C18鍵合硅膠柱(4.6mm×75mm，3.5μm)，柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，梯度見下表，流速0.4mL/min；衍生化試劑的熒光激發(fā)和發(fā)射波長是λex/λem＝292/348nm；色譜圖見圖3。時(shí)間(min)流動(dòng)相比例流速(ml/min)070％乙腈0.41095％乙腈0.42595％乙腈0.4c)O-(2-(9H-咔唑-9-基)丙基)羥胺與不飽和混合醛的反應(yīng)：取30μl不飽和混合醛溶液、2μl2mmol/L正己醛溶液、90μl10mmol/LO-(2-(9H-咔唑-9-基)丙基)羥胺溶液，加入100μl10-4mol/L的磷酸溶液后加水至1000μl，30℃震蕩反應(yīng)2h后，取10μl進(jìn)樣。色譜分離條件：色譜柱為AgilentEclipse-C18鍵合硅膠柱(4.6mm×75mm，3.5μm)，柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，梯度見下表，流速0.4mL/min；衍生化試劑的熒光激發(fā)和發(fā)射波長是λex/λem＝292/348nm；色譜圖見圖4。時(shí)間(min)流動(dòng)相比例流速(ml/min)070％乙腈0.41595％乙腈0.42595％乙腈0.4當(dāng)前第1頁1 2 3