檢測融合基因atic-alk相對表達(dá)量的方法和寡核苷酸的制作方法

檢測融合基因atic-alk相對表達(dá)量的方法和寡核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了定量檢測樣本中ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量的方法和寡核苷酸，通過利用檢測ATIC-ALK的上游引物ATIC-ALK-F、下游引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe以及檢測內(nèi)參基因abl的上游引物abl-F、下游引物abl-R和探針abl-Probe，能夠?qū)颖局械腁TIC-ALK融合基因相對表達(dá)量進(jìn)行定量檢測，將融合基因相對表達(dá)量作為一種中間的輔助手段，有助為人類間變性大細(xì)胞瘤患者尋找最佳的治療方案。
【專利說明】檢測融合基因ATIC-ALK相對表達(dá)量的方法和寡核苷酸
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種定量檢測樣本中融合基因ATIC-ALK相對表達(dá)量的方法和寡核苷酸，通過采用實時熒光定量PCR技術(shù)，能夠?qū)颖局械腁TIC-ALK相對表達(dá)量進(jìn)行定量檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]間變性大細(xì)胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma, ALCL),是非霍奇金淋巴瘤中的一種獨(dú)立類型，由德國病理學(xué)家Stein等于1985年應(yīng)用K1-1 (⑶30)抗體識別，常呈間變性特征，被命名為間變性大細(xì)胞淋巴瘤。REAL分類將B細(xì)胞表型者歸為彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤。目前，ALCL只包括T表型和Null (非T非B)表型。對ALCL確切的病理機(jī)制尚知之不多，約60%-85%左右ALCL病例表達(dá)間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase, ALK)融合蛋白，這是由于2號染色體上的ALK基因位點(diǎn)的畸變所致。最常見的是t(2 ；5) (p23 ;q35)而形成融 合基因NPM-ALK，它是由位于5號染色體上的核仁磷酸蛋白B23(NPM)基因與位于2號染色體的ALK基因相融合形成，表達(dá)的融合蛋白為NPM-ALK蛋白；最近尚有更多的ALK基因與其他基因通過染色體轉(zhuǎn)位或者是染色體的倒轉(zhuǎn)而形成的融合基因被發(fā)現(xiàn)，如t (I ；2) (q25 ;p23)所形成的TPM3-ALK基因，t (2 ；3) (p23 ;q21)產(chǎn)生的TFG-ALKs 基因，TFG-ALKL 基因和 TFG-ALKxL 基因，inv (2) (p23 ；q35)所形成的 ATIC-ALK基因，t (2 ；17) (p23 ;q23)形成的 CLTCL-ALK 基因及 t (X ；2) (qlI ;p23)形成的 MSN-ALK基因。
[0003]ALK基因位于染色體2p23位點(diǎn)，正常情況下人源的ALK可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大小6222bp的mRNA,由29個外顯子構(gòu)成，編碼1620個氨基酸序列200kD的I型穿膜蛋白ALK，該蛋白為一種受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK),是RTK胰島素超家族的成員。完整的ALK具有典型的RTK三部分結(jié)構(gòu)，即胞外區(qū)、親脂性穿膜區(qū)和胞漿內(nèi)酪氨酸激酶。據(jù)文獻(xiàn)報道，ALK蛋白除在極少部分彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)外，可在60%~85%的原發(fā)性系統(tǒng)性ALCL中表達(dá)，是原發(fā)性系統(tǒng)性ALCL相對特異的免疫表型特征。
[0004]受體型酪氨酸激酶間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase, ALK)最早發(fā)現(xiàn)于間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)中，由2號及5號染色體易位所形成的融合蛋白質(zhì)包含了 ALK的3’端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，以及核磷蛋白(Nucleophosmin, NPM)的5’端的結(jié)構(gòu)域。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，正常的ALK專一表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中，如腦和神經(jīng)索，尤其是新生兒的腦中。
[0005]基因ATIC位于2號染色體的長臂35的位置(2q35)。正常情況下人源的ATIC基因可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大小2084bp的mRNA,由16個外顯子構(gòu)成。它所編碼的蛋白為5-氨基咪唑-4-甲酸胺的核苷酸甲酸轉(zhuǎn)移酶(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotideformyltransferase/IMP cyclohydrolase,由 592 個氨基酸序列組成，分子量為 38kD,是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的雙功能蛋白，催化嘌呤合成的最后兩個途徑。該蛋白的N端結(jié)構(gòu)具有催化磷酸氨基咪唑甲酰胺甲酰轉(zhuǎn)移的作用，C端結(jié)構(gòu)具有IMP環(huán)，包含核定位信號以及二聚體結(jié)構(gòu)域，可以產(chǎn)生大的同源二聚體及異源二聚體。該蛋白還與前核糖體顆粒運(yùn)輸及核糖體生物發(fā)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)。
[0006]基因ALK在某些ALCL中的異常表達(dá)來源于不同的染色體易位。ALK易位的基因組斷裂點(diǎn)多發(fā)生在16及17號外顯子中間的內(nèi)含子，而17-26號外顯子編碼ALK胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，每個易位產(chǎn)生一種不同的融合蛋白，由配偶體的5’端和ALK酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域3’端融合得到。大多數(shù)情況下，5’端的配偶體具有可以形成同源或異源二聚體的結(jié)構(gòu)域，使得ALK激酶結(jié)構(gòu)域交互磷酸化，相互作用增強(qiáng)并且使多種下游蛋白質(zhì)磷酸化。基因ATIC的5’端與ALK的3’端融合，導(dǎo)致ATIC的氨基端與ALK梭基端的酪氨酸激酶增高，使其功能近似原癌蛋白質(zhì)，這些融合蛋白質(zhì)定位在不同的亞細(xì)胞區(qū)域上，因此可能導(dǎo)致不同的細(xì)胞功能改變。
[0007]大約10-20%ALK陽性的ALCL表達(dá)ATIC-ALK，它是由染色體inv (2) (p23)和酪氨酸激酶功能區(qū)融合。ATIC對ATIC-ALK融合蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能非常重要，缺乏ATIC 二聚體結(jié)構(gòu)域的突變體小能轉(zhuǎn)化細(xì)胞，提示二聚化作用是信號傳遞的關(guān)鍵因素。轉(zhuǎn)基因模型小鼠的研究結(jié)果顯示ATIC-ALK可導(dǎo)致惡性的淋巴瘤。
[0008]正常情況下ALK只在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。人體中ALK基因表達(dá)量隨著大腦的發(fā)育成熟而下降，成熟大腦組織中的量很低，表達(dá)存在一定的區(qū)域性；其它系統(tǒng)尤其是造血系統(tǒng)中未發(fā)現(xiàn)ALK的表達(dá)。ALK基因在絕大多數(shù)非造血系統(tǒng)腫瘤和正常組織中缺乏表達(dá)，表明ALK蛋白的分布范圍是極其狹窄的。ALK蛋白是ALCL重要的分子標(biāo)志物，在ALCL的診斷中具有很高的價值。
[0009]許多學(xué)者認(rèn)為ALCL患者預(yù)后與其染色體是否發(fā)生易位有關(guān)。在兒童和年青患者的侵襲性NHL中，ALK陽性系統(tǒng)性ALCL治愈可能性最大，預(yù)后優(yōu)于任何其他形式的外周T細(xì)胞淋巴瘤。ALK陽性和ALK陰性ALCL之間預(yù)后的差異性首先由Shiota等報道，他們指出，ALK陽性病例的5年生存率(79.8%)遠(yuǎn)好過ALK陰性病例(32.9%),P<0.01。fcunangeloFalini等對78例ALCUALK陽性53例，ALK陰性25例)患者預(yù)后統(tǒng)計顯示，ALK陽性病例中有77.3%獲得完全緩解，15.0%獲得了部分緩解，緩解率達(dá)到92.3%，同時4例(7.7%)對化療耐受；ALK陰性病例中有56.0`%獲得完全緩解，28.0%獲得了部分緩解，緩解率達(dá)到84.0%，同時4例(16.0%)對化療耐受；所有病例中位生存年領(lǐng)為2.1年(0.07年-13.17年)，ALK陽性病例總生存率(71.0%±6.0%)遠(yuǎn)好過ALK陰性病例(15.0%±11.0%)，P〈0.0007。ALK陽性病例10年無病生存率(82.0%±6.0%)也遠(yuǎn)好過ALK陰性病例(28.0%±14.0%), Ρ〈0.0001。Randy D等研究也顯示ALK陽性ALCL病例的5年生存率(93.0%)遠(yuǎn)好過ALK陰性ALCL病例(37.0%)，Ρ〈0.00001。眾多研究表明有ALK融合基因的ALCL病例的預(yù)后明顯好于陰性病例，但確切的機(jī)制倘不清楚，但有一點(diǎn)是可以肯定的，就是ALK陽性的ALCL的預(yù)后明顯好于ALK陰性病例，因此對于臨床診斷來說很有必要檢測ALCL中有無ALK融合基因。目前，染色體易位和ALK的表達(dá)已經(jīng)被WHO規(guī)定為ALCL的臨床診斷中間指標(biāo)之一。
[0010]目前臨床上已經(jīng)將ATIC-ALK融合基因作為動態(tài)評估患者病情及預(yù)后的輔助方法中的一種。常用的檢測融合基因的技術(shù)有熒光原位雜交(FISH)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實時熒光定量PCR(RQ-PCR)等方法。FISH法是現(xiàn)今經(jīng)典的融合基因檢測方法，結(jié)果較為直觀，具有較高的檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，而且對于融合基因表達(dá)量低的樣本具有較高的檢出率，杜絕了微小殘留漏檢現(xiàn)象，提高了檢測精度。但FISH需要花費(fèi)大約2天時間，試劑種類繁多，方法繁瑣，步驟多導(dǎo)致的各種誤差，還存在環(huán)境因素對結(jié)果產(chǎn)生的不確定性，且結(jié)果需經(jīng)驗豐富的專業(yè)人士來判讀，結(jié)果判讀存在較大的主觀性。而單純RT-PCR法則為終點(diǎn)定量，無法對起始模板量進(jìn)行準(zhǔn)確的估算。此外，由于砷劑及全反式維甲酸的應(yīng)用，急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)治療效果得到很大的提高，微小殘留是其復(fù)發(fā)的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、污染控制好的方法來對融合基因mRNA殘留進(jìn)行檢測。
[0011]實時熒光定量PCR技術(shù)(real time quantitative PCR, RQ-PCR)具有較高的靈敏度和特異性，而且能對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時檢測。常見的實時熒光定量PCR技術(shù)有SYBRGreen I染料法,雙探針雜交法以及Taqman探針法等。其中SYBR Green I由于采用非飽和染料，對于任何DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)都能夠產(chǎn)生非特異性結(jié)合，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性，因而特異性不理想；雙探針雜交法由于使用了 2條探針，盡管特異性非常好，但是成本過于昂貴。而Taqman探針法,采用I條Taqman探針,利用報告基團(tuán)、淬滅基團(tuán)的相互作用，既保證了反應(yīng)的特異性，同時很好地控制了成本，該法綜合生物學(xué)、酶學(xué)和熒光化學(xué)于一體，從擴(kuò)增到結(jié)果分析均在PCR反應(yīng)管封閉狀態(tài)下進(jìn)行，解決了 PCR產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結(jié)果用拷貝數(shù)表示，實現(xiàn)了對PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，與定性PCR技術(shù)相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關(guān)系好，操作簡單，自動化程度高、防污染，有較大的線性范圍等優(yōu)點(diǎn)，而且也能夠滿足ATIC-ALK融合基因mRNA微量殘留的檢測，被認(rèn)為是目前首選檢測方法，用于評價治療效果、預(yù)測預(yù)后。對于大量樣本，尤其是高危人群的的篩查具有極大的現(xiàn)實意義。因此本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針法應(yīng)用于ATIC-ALK融合基因的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明設(shè)計了檢測ATIC-ALK融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括檢測AT IC-ALK的上游引物AT IC-ALK-F、下游引物AT IC-ALK-R和探針AT I C-ALK-Probe以及檢測內(nèi)參基因Ab I的上游引物ab 1-F、下游引物ab 1-R和探針ab 1-Probe，采用熒光定量PCR技術(shù)，利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，分別構(gòu)建內(nèi)參基因Abl和目的基因ATIC-ALK的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測ATIC-ALK相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量。通過調(diào)整兩個基因的引物探針比例，以及PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增效率和速率均達(dá)到最佳。
[0013]本發(fā)明提供用于定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括檢測所述融`合基因的上游引物ATIC-ALK-F、下游引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe，其序列為:
[0014]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG
[0015]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT
[0016]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；以及檢測內(nèi)參基因
[0017]Abl的上游引物abl-F、下游引物abl_R和探針abl-Probe，其序列為:
[0018]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
[0019]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC
[0020]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0021]進(jìn)一步地，ATIC-ALK-F:ATIC-ALK-R:ATIC-ALK-Probe的使用濃度比為 2:2:1。
[0022]進(jìn)一步地，abl-F、abl-R和 abl-Probe 的使用濃度比為 2:2:1。
[0023]本發(fā)明還提供一種定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量的方法，包括:
[0024](I)提取樣本中的RNA ；[0025](2)將(I)提取出的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將所產(chǎn)生的cDNA加入到反應(yīng)管中；
[0026](3)加入檢測內(nèi)參基因Abl的上游引物abl-F、下游引物abl-R和探針abl-Probe ；
[0027](4)加入檢測所述融合基因的上游引物ATIC-ALK-F、下游引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe ；
[0028](5)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0029](6)計算所述融合基因的相對表達(dá)量，其特征在于:
[0030]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG[0031 ] ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT
[0032]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA
[0033]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
[0034]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC
[0035]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0036]進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性Imin ；95°C 15s，58°C 35sec，40個循環(huán)。
[0037]本發(fā)明還提供一種定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，其包括紅細(xì)胞裂解液，TRIzol，氯仿，無水乙醇；檢測體系PCR反應(yīng)液；陽性對照品，陰性對照品和空白對照品，其中，所述檢測體系`PCR反應(yīng)液包括檢測所述融合基因的上游引物ATIC-ALK-F、下游引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe以及檢測內(nèi)參基因Abl的上游引物abl_F、下游引物abl-R和探針abl-Probe,其特征在于:
[0038]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG ；
[0039]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT ；
[0040]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；
[0041 ] abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；
[0042]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC ；
[0043]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0044]進(jìn)一步地，所述紅細(xì)胞裂解液由NH4C1、NaHC03、EDTA 二鈉和ddH20組成。
[0045]進(jìn)一步地，所述陽性對照品為含ATIC-ALK基因的溶液；所述陰性對照品為不含ATIC-ALK基因的溶液；所述空白對照品為生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
[0046]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明將實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合采用Taqman探針，利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，分別構(gòu)建內(nèi)參基因abl和目的基因ATIC-ALK的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測受試者體內(nèi)ATIC-ALK的相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量。相比于以往的免疫組化方法和現(xiàn)今流行的AACT法，該試劑盒具有精度高，結(jié)果便于判讀等優(yōu)點(diǎn)。加之該方法將反應(yīng)體系所需的引物、探針進(jìn)行合理配比和優(yōu)化，使實驗條件達(dá)到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環(huán)節(jié)，大大提升了實驗效率。該方法經(jīng)測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助于臨床上ACLC患者體內(nèi)ATIC-ALK融合基因的微量殘留檢測，對于及時干預(yù)治療避免血液學(xué)復(fù)發(fā)、調(diào)整治療方案、評價治療效果、預(yù)測預(yù)后、預(yù)防臨床復(fù)發(fā)都具有重要輔助意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1ATIC-ALK陽性結(jié)果圖；[0048]圖2ATIC-ALK陰性結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0049]下面結(jié)合具體實施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0050]實施例1
[0051]檢測ATIC-ALK融合基因的寡核苷酸和試劑盒
[0052]用于定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量的寡核苷酸，包括檢測所述融合基因的上游引物AT IC-ALK-F、下游引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe，其序列為:
[0053]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG
[0054]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT
[0055]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA `；以及檢測內(nèi)參基因
[0056]Abl的上游引物abl-F、下游引物abl_R和探針abl-Probe，其序列為:
[0057]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
[0058]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC
[0059]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0060]一種檢測樣本中ATIC-AL`K融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，將檢測到的ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量用作輔助臨床上人類ACLC早期預(yù)防、早期診斷的輔助性指標(biāo)；還可以對高危人群進(jìn)行較為準(zhǔn)確的篩查。該試劑盒包括:
[0061]紅細(xì)胞裂解液；TRIzol ;氯仿；無水乙醇；
[0062]檢測體系PCR 反應(yīng)液:ReverTra Ace qPCR RT Kit (T0Y0B0 公司)；THNDERBIRDProbe qPCR Mix (2X )、作為目的基因的ATIC-ALK上、下游引物各0.8uM、ATIC-ALK探針
0.4uM ;作為內(nèi)參基因的abl上、下游引物各0.8uM、探針abl-probe0.4uM，其中，
[0063]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG ；
[0064]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT ；
[0065]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；
[0066]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；
[0067]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC ；
[0068]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ；
[0069]陽性對照品:含ATIC-ALK基因的溶液；
[0070]陰性對照品:不含ATIC-ALK基因的溶液；
[0071]空白對照品:生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
[0072]實施例2
[0073]本發(fā)明試劑盒的使用方法:
[0074](I)抽提血液中的組織RNA:在潔凈的1.5ml的離心管中加入Iml紅細(xì)胞裂解液，取抗凝血0.5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清，收集底部的細(xì)胞；再次加入0.5ml紅細(xì)胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細(xì)胞；向細(xì)胞中加入Iml TRIzol,反復(fù)吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5min ;加入0.2ml氯仿，震蕩均勻；14000rpm4°C離心lOmin，吸取上清層轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ;14000rpm4°C離心IOmin,棄上清，加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm4°C離心5min,棄乙醇；室溫干燥10_15min,加入20ulRNase-free水溶解沉淀。其中，IOX紅細(xì)胞裂解液配方為:NH4C182g，NaHC038.4g，EDTA 二鈉 3.72g，加 ddH20 定容至 1000ml0
[0075](2)RNA逆轉(zhuǎn)錄:參考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0076](3)試劑配置:按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應(yīng)液各X ul，每人份23ul分裝:
[0077]X=23ul反應(yīng)液X (8份內(nèi)參基因(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+8份目的基因(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+η份標(biāo)本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；
[0078](4)加樣:取2ul (2)中的cDNA，加入到檢測體系PCR反應(yīng)液中；對陽性對照和陰性對照實驗而言，直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；對空白對照實驗而言，加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)；對空白對照實驗而言，加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
[0079](5)檢測:檢測在實時熒光PCR儀上進(jìn)行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec40 個循環(huán)，突光信號于58°C 35sec時米集。
[0080](6)結(jié)果判斷:將閾值線調(diào)整至背景信號及陰性擴(kuò)增線以上，系統(tǒng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值自動計算出拷貝數(shù)。
[0081]I)內(nèi)參陽性時，檢測結(jié)果才認(rèn)為有效；
[0082]2)判斷標(biāo)準(zhǔn):Ct<35,為結(jié)果陽性；35 ^ Ct ^ 38，為需要再次驗證；Ct > 38，為結(jié)果陰性。
[0083]實施例3
[0084]臨床標(biāo)本檢測
[0085]取送檢ALCL患者抗凝血樣本共10例，按實施例2所述方法提取組織RNAjf RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA、配制試劑、加樣和進(jìn)行熒光定量檢測。
[0086]對每份樣本而言，取2ul經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，加入到檢測體系PCR反應(yīng)液中，同時做陽性、陰性、空白對照實驗各一次，內(nèi)參基因/目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線各一份。一臺96孔的熒光PCR儀可同時檢測38份樣本，每個樣本2次重復(fù)。用熒光PCR儀檢測，時間為100分鐘。
[0087]實驗結(jié)果與融合基因檢測方法FISH法的報告結(jié)果相比較，確定樣本檢測的準(zhǔn)確率。部分陽性結(jié)果如下表1:
[0088]表1:
[0089]
樣本編號 Ifish法檢測結(jié)果(%) |本方法檢測結(jié)果(%)
61323.6523.60
6li2.372.40
【權(quán)利要求】
1.用于定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括檢測所述融合基因的上游引物ATIC-ALK-F、下游引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe，其序列為:
ATIC-ALK-F: ACGCTCGAGTGACAGTGG
ATIC-ALK-R: CTACAACCCCAACTACTGCT ATIC-ALK-Probe: FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；以及檢測內(nèi)參基因 Abl 的上游引物abl-F、下游引物abl-R和探針abl-Probe，其序列為:abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，
AT IC-ALK-F: AT IC-ALK-R: AT I C-ALK-Pr ob e 的使用濃度比為 2:2:1。
3.如權(quán)利要求1至2之一所述的寡核苷酸,其特征在于，abl-F、abl_R和abl-Probe的使用濃度比為2:2:1。
4.一種定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達(dá)量的方法，包括: (1)提取樣本中的RNA； (2)將(I)提取出的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將所產(chǎn)生的cDNA加入到反應(yīng)管中； (3)加入檢測內(nèi)參基因Abl的上游引物abl-F、下游引物abl-R和探針abl-Probe； (4)加入檢測所述融合基 因的上游引物ATIC-ALK-F、下游引物AT IC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe ； (5)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； (6)計算所述融合基因的相對表達(dá)量，其特征在于:
ATIC-ALK-F: ACGCTCGAGTGACAGTGG
ATIC-ALK-R: CTACAACCCCAACTACTGCT
ATIC-ALK-Probe: FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性Imin ；95°C 15s,58°C 35sec，40 個循環(huán)。
【文檔編號】C12N15/11GK103757101SQ201310717956
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】王淑一, 李文靜 申請人:成都艾迪康醫(yī)學(xué)檢測實驗室有限公司