重組酶基因bet作為一種大腸桿菌異源蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種將來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為融合標(biāo)簽的方法。本方法是將來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為融合標(biāo)簽。將六個組氨酸、bet基因、TEV酶切位點和一段填充片段等元件的核苷酸序列克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)，獲得bet基因融合表達(dá)載體。待表達(dá)的目的基因可通過取代填充片段而與六個組氨酸標(biāo)簽和bet基因在讀碼框內(nèi)融合，在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)而表達(dá)獲得標(biāo)簽蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。融合表達(dá)可大大地提高目的蛋白的可溶性組份比例。
【專利說明】重組酶基因bet作為一種大腸桿菌異源蛋白表達(dá)融合標(biāo)簽的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種利用新型的融合標(biāo)簽在大腸桿菌中表達(dá)異源蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]異源基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達(dá)以獲得足夠量和高活性的蛋白是蛋白質(zhì)藥物、分子生物學(xué)以及生物化學(xué)研究的重要內(nèi)容。獲得高活性蛋白的前提之一是在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的蛋白分泌至細(xì)胞間質(zhì)，即以可溶性的形式存在?？扇苄缘牡鞍捉?jīng)超聲破碎后，即釋放至緩沖液中，隨后可通過親和層析等方法加以純化?？扇苄缘牡鞍滓哉_的折疊形式存在而保持活性。然而許多蛋白，尤其是異源蛋白(如與大腸桿菌種屬差別較大的生物尤其是真核生物的基因)常以不可溶性的形式呈現(xiàn)。不可溶性的蛋白存在于包涵體內(nèi)，其分離純化需要首先以強離子去污劑變性處理將蛋白從包涵體中釋放出來，再以還原劑進行復(fù)性，還需透析以去除離子。這種變性和復(fù)性的過程不僅僅煩瑣耗時，更不利的是損害蛋白的活性、降低蛋白的收率，并對后續(xù)的實驗產(chǎn)生不良的影響。
[0003]有許多方法以提高蛋白可溶性組份占總蛋白的比例，其中將目的蛋白和標(biāo)簽蛋白的融合表達(dá)是提高目的蛋白可溶性組份的有效手段。已開發(fā)出了一系列融合表達(dá)標(biāo)簽，如麥芽糖結(jié)合蛋白(mMBP)、小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)、翻譯起始因子(IF2-1)、氮源利用物質(zhì)A(NusA)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、伴侶蛋白GroEL、伴侶蛋白DnaK和啟動因子(TF)等。但目前的融合標(biāo)簽種類還不足，由于蛋白的特殊性，沒有一種通用的融合標(biāo)簽?zāi)芙鉀Q提高所有的異源蛋白的可溶性問題。常常有目的基因難以實現(xiàn)可溶性表達(dá)的情形。因此開發(fā)新型的表達(dá)方式對蛋白質(zhì)藥物的開發(fā)以及基礎(chǔ)研究均有著重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)手段的不足，提供更多的融合標(biāo)簽用于目的蛋白的表達(dá)。
[0005]本發(fā)明公開了來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為異源基因在大腸桿菌內(nèi)進行蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽的用途。
[0006]本發(fā)明構(gòu)建了以來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為異源基因在大腸桿菌內(nèi)進行蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體。即將六個組氨酸序列、bet基因、煙草蝕刻病毒蛋白酶(TEV)酶切位點和一段填充片段等元件的核苷酸序列融合后，克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)，獲得了 bet基因融合表達(dá)載體pLS2723。待表達(dá)的目的基因可通過取代填充片段而與六個組氨酸標(biāo)簽和bet基因在讀碼框內(nèi)融合。重組克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21(DE3)后，在異丙基_β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)下表達(dá)標(biāo)簽蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。
[0007]在填充片段的5'端設(shè)計有NcoI和BamHI酶切位點，3'端保留原載體pET30a (+)上的Hindlll、NotI和XhoI酶切位點。外源基因可以選擇5'端和3'端酶切位點來進行克隆。由于BsaI和AflIII與NcoI為同尾酶，BglII和BamHI為同尾酶，SaII和XhoI同尾酶，故如外源DNA片段中含有填充片段兩側(cè)的酶切位點，也可通過設(shè)計同尾酶的酶切位點進行克隆。所純化的蛋白的可利用6個組氨酸標(biāo)簽以N1-NTA樹脂親和層析進行分離純化，純化的蛋白可以使用專一性很強的TEV蛋白酶酶切使得目的蛋白和Beta標(biāo)簽進行分離。高活性的TEV蛋白酶可以在實驗室自制，這就大大地降低了蛋白表達(dá)和純化的成本。此后，可再經(jīng)過N1-NTA樹脂親和層析,含6個組氨酸標(biāo)簽的Beta標(biāo)簽蛋白和N1-NTA樹脂結(jié)合，而目的蛋白不結(jié)合而洗脫。
[0008]優(yōu)選實施例中選擇的是來源于豬腎細(xì)胞的腎素結(jié)合蛋白基因pRnBP和來源于聚胞藻Synechocystis sp.PCC6803的slrl975基因，這兩個基因單獨表達(dá)時不可溶性蛋白占總蛋白的比例極少。而與Beta的融合表達(dá)后，可溶性均得以大大提高。pRnBP和Slrl975的生物化學(xué)活性均為N-乙酰-D-葡萄糖胺2-異構(gòu)酶，此酶是酶法催化合成抗流感引物扎那米韋的關(guān)鍵中間體，高表達(dá)量的酶將使得大規(guī)模和高產(chǎn)的酶法催化更加簡便和快捷。
[0009]蛋白表達(dá)應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，前景廣闊，本發(fā)明所述的載體可廣泛運用與目的基因的表達(dá)和通過目的蛋白的可溶性，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物以及分子生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是7624個堿基對的bet基因作為融合標(biāo)簽的大腸桿菌蛋白表達(dá)載體PLS2723的質(zhì)粒限制性酶切圖譜。其中:
[0011]219-235是T7啟動子序列；
[0012]310-327 是編碼6個組氨酸位點的核苷酸序列；
[0013]328-1110是bet基因的開放閱讀框序列；
[0014]1111-1131是TEV蛋白酶的酶切位點序列，以S表示；
[0015]1144-2677是填充片段序列，目的基因取代填充片段后克隆至表達(dá)載體；
[0016]2699-2716是6個組氨酸位點的核苷酸序列；
[0017]2769-2787是T7終止子序列；
[0018]2867-3322是單鏈DNA的功能區(qū)域序列；
[0019]3415-4230是卡那霉素抗性基因kan的開放閱讀框序列；
[0020]4325-4940是質(zhì)粒復(fù)制子區(qū)域序列；
[0021]6370-7452是編碼調(diào)控蛋白基因的開放閱讀框IacI的序列。
[0022]NcoI,BamHI,Hindlll,NotI和XhoI等用于克隆外源基因的位點以粗體表示，其他的SphI，ClaI, XbaI等為常規(guī)標(biāo)識的限制性酶切位點，括號內(nèi)的數(shù)字表示限制性酶切位點在質(zhì)粒上的位置。
[0023]圖2是pRnBP基因表達(dá)以及pRnBP基因與bet基因融合表達(dá)的SDS-PAGE
[0024](十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)圖譜。其中:
[0025]1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，大小分別為 116.0kDa, 66.2kDa, 45.0kDa, 35.0kDa,25.0kDa, 18.4kDa, 14.4kDa ；
[0026]2.pRnBP基因表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pLS2314誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白；
[0027]3.pRnBP基因表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pL2314誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白；[0028]4.pRnBP基因與bet基因融合表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pLS2375誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白；
[0029]5.pRnBP基因與bet基因融合表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pLS2375誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白。
[0030]圖3是slrl975基因表達(dá)以及slrl975基因與bet基因融合表達(dá)的SDS-PAGE圖譜。其中:
[0031]1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，大小分別為 116.0kDa, 66.2kDa，45.0kDa, 35.0kDa,25.0kDa, 18.4kDa, 14.4kDa ；
[0032]2.slrl975基因表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pLS2315誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白；
[0033]3.slrl975基因表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pLS2315誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白；
[0034]4.slrl975基因與bet基因融合表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pLS2377誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白；
[0035]6.slrl975基因與bet基因融合表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3)/pLS2377誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白。
【具體實施方式】
[0036]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0037]下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0038]在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0039]實施例中所用到的菌株和質(zhì)粒，均為已公開的菌株和質(zhì)粒:
[0040]1.E.coli DH10B?；蚩寺∷拗骶；蛐?F!ncrAΛ (mrr-sdRMS-crBC)801acZΔ M15 Δ lacX74deoR recAlaraD139 Δ ara, leu) 697galU galKrpsL endAlnupG。文獻:LifeTechnologies, Inc.Focus (1990) 12，19。購自美國 Invitrogen 公司。
[0041]2.E.coli BL21(DE3)。蛋白表達(dá)宿主菌。基因型:B F^dcm ompT hsdS(rB_mB0gal λ (DE3)。購自美國 Stratagen 公司。
[0042]3.pBluescript KS (-)。 文獻:Alting-Mees, M.A.and Short, J.Μ.(1989)pBluescript I1: gene mapping vectors.Nucleic Acids Res, 17，9494。購自美國 Novagen公司。
[0043]4.pET30a。大腸桿菌表達(dá)載體。購自美國Novagen公司。
實施例
[0044]實施例1.pRnBP表達(dá)載體的構(gòu)建和在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0045]設(shè)計引物PRl:5' -GGGGGATCCATGGAGAAGGAGCGCGAAAC-3'，(SEQ ID N0.1)，PR2:5' -GGGAAGCTTCTAGGCGAGGCGGCTCAGCAG-3'，(SEQ ID N0.2)，引入的 BamHI 和 HindIII 酶切位點以下劃線表示。以豬腎細(xì)胞的mRNA為模板，PRl和PR2逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到1266bp的豬的腎素結(jié)合蛋白基因PRnBP。DNA片段以BamHI和HindIII酶切后，與大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)的BamHI和HindIII酶切的載體于16°C連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DHlOB的感受態(tài)細(xì)胞，在30μ g/ml卡那霉素的LB平板上篩選重組克隆。重組克隆經(jīng)酶切和測序驗證其序列正確后，命名為PLS2314。pLS2314轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，His-hRnBP表達(dá)的蛋白大小為53.1kDa,與預(yù)期相符，但BandScan分析蛋白的可溶性比例在5%以下，SDS-PAGE的結(jié)果見圖2。
[0046]實施例2.slrl975表達(dá)載體的構(gòu)建和在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0047]設(shè)計引物SLl:5' ~GGGGGATCCATGATTGCCCATCGCCGTCAG~3/，(SEQ ID N0.3)，SL2:5 ' -GGGAAGCTTTTAACTAACCGGAAGTTGGAG-3 '，(SEQ ID N0.4)，引入的 BamHI 和 HindIII酶切位點以下劃線表示。以聚胞藻Synechocystis sp.PCC6803的基因組DNA (來源自德國 University of Rostock 的 Martin Hagemann 教授)為模板，PCR 擴增得到 1176bp的slrl975基因。DNA片段以BamHI和HindIII酶切后，按照上述的克隆方法，克隆至pET30a(+)的BamHI和HindIII位點，經(jīng)酶切和測序正確，獲得重組克隆pLS2315。pLS2315轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，His_Slrl975表達(dá)的蛋白大小為51.0kDa，與預(yù)期相符，但BandScan分析蛋白的可溶性比例在10%以下，SDS-PAGE的結(jié)果見圖3。
[0048]實施例3.bet為融合標(biāo)簽的融合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0049]設(shè)計引物STFl:5' -GAAGGATCCTCACAGGCTTCCGACGACCTC-3 '，(SEQ ID N0.5),STF2:5 ' -GAAAAGCTTGCTTCCGCCAGGCCCTCGACC-3 '，(SEQ ID N0.6),引入的 BamHI 和HindIII酶切位點以下劃線表不。以Streptomyces peucetius ATCC29050基因組DNA為模板，PCR擴增出阿霉素生物合成基因簇dnrl和dnrl基因區(qū)域(GenBank登錄號M80237)的1560bp DNA片段。DNA片段以BamHI和HindIII酶切后，按照上述的克隆方法，克隆至pBluescript KS (-)的BamHI和HindIII位點，經(jīng)酶切和測序正確，獲得重組克隆pLS2321。PLS2321用作填充片段載體。
[0050]設(shè)計引物R47IF: 5' -GGGGAATTCATATGCACCATCATCATCATCACATGAGTACTGCACTCGCAACGC-3' ,(SEQ ID N0.7)，EcoRI和NdeI酶切位點以下劃線表示，編碼6個組氨酸的核苷酸序列以斜體表示；R471R:5 ' -GAAGGATCCCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTCTGCTGCCACCTTCTGCTCTGC-3'，(SEQ ID N0.8)，BamHI和NcoI酶切位點以下劃線表示，編碼TEV酶切位點的核苷酸序列以斜體表示。以lambda噬菌體的基因組DNA (購自大連寶生物生物技術(shù)公司)為模板，PCR擴增得到0.8kb的含6個組氨酸堿基、bet基因和TEV酶切位點DNA片段。DNA片段以EcoRI和BamHI酶切后，同上方法克隆至pBluescript KS (-)的EcoRI和BamHI酶切位點，經(jīng)酶切和測序正確，獲得重組克隆PLS2372。
[0051]pLS2372 以 NdeI 和 BamHI 酶切后，分離 0.8kb 的 DNA 片段；pLS2321 以 BamHI 和HindIII酶切后，分離1.5kb的DNA片段。兩個DNA片段和以NdeI和HindIII酶切并經(jīng)堿性磷酸酯酶處理的pET30a(+)提高三片段連接，經(jīng)酶切正確，獲得重組克隆pLS2373。pLS2373即為含6個組氨酸堿基、bet基因和填充片段(這三個元件在讀碼框內(nèi)融合)以及填充片段的克隆載體。
[0052]實施例4.bet-pRnBP融合表達(dá)載體的構(gòu)建及融合表達(dá)
[0053]pLS2314 以 BamHI 和 HindIII 酶切后，分離 1.2kb 的 pRnBP 基因片段，與 6.1kbPLS2373以BamHI和HindIII酶切的載體相連，轉(zhuǎn)化E.coli DH10B，重組克隆經(jīng)酶切驗證正確后，獲得 bet-pRnBP 融合表達(dá)載體 pLS2775。pLS2375 轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)后，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，His-Beta-pRnBP表達(dá)的蛋白大小為79.6kDa，與預(yù)期相符，SDS-PAGE的結(jié)果見圖2。BandScan分析可溶性蛋白比例在80%以上，可見pRnBP和融合標(biāo)簽Beta融合表達(dá)后，可溶性蛋白的比例得到了顯著的提高。
[0054]實施例5.bet-slrl975融合表達(dá)載體的構(gòu)建及融合表達(dá)
[0055]pLS2315 以 BamHI 和 HindIII 酶切后，分離 1.2kb 的 pRnBP 基因片段，與 6.1kbPLS2373以BamHI和HindIII酶切的載體相連，轉(zhuǎn)化E.coli DH10B，重組克隆經(jīng)酶切驗證正確后，獲得 bet-pRnBP 融合表達(dá)載體 pLS2777。pLS2377 轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)后，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，His-Beta-Slrl975表達(dá)的蛋白大小為77.4kDa，與預(yù)期相符，SDS-PAGE的結(jié)果見圖3。BandScan分析可溶性蛋白比例在70%以上，可見Slrl975和融合標(biāo)簽Beta融合表達(dá)后，可溶性蛋白的比例顯著提高。
[0056]從這兩個實施例可見，Beta可作為一個非常好的標(biāo)簽來進行融合蛋白的表達(dá)來使用。
【權(quán)利要求】
1.來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為異源基因在大腸桿菌內(nèi)進行蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽的用途。
2.一種在大腸桿菌內(nèi)進行蛋白表達(dá)方法，其特征在于，以來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為融合標(biāo)簽；具體是將六個組氨酸、bet基因、TEV酶切位點和一段填充片段元件的核苷酸序列融合后，克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)，獲得bet基因融合表達(dá)載體pLS2723 ;待表達(dá)的目的基因通過取代填充片段而與六個組氨酸和bet基因在讀碼框內(nèi)融合；重組克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21(DE3)后，在異丙基_β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)下表達(dá)標(biāo)簽蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。
3.一種用于權(quán)利要求1所述用途的融合表達(dá)載體，是將六個組氨酸、bet基因、TEV酶切位點和填充片段克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)而獲得。
【文檔編號】C12N15/70GK103667331SQ201310669870
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】尚廣東, 凌文, 張青, 駱希, 楊瑤 申請人:南京師范大學(xué)