專利名稱：一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用，特別是一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3及其表達(dá)基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Smads蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，它在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)是由一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽生長因子亞家族組成，廣泛存在于各種生物中，具有廣泛的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、粘附，參與早期胚胎發(fā)生和器官發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，創(chuàng)傷修復(fù)、骨的形成和重建等，另外在調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌方面也起著重要的作用。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物，激活Smads進(jìn)入核內(nèi)，共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。有目的地調(diào)控和干預(yù)Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有助于促進(jìn)對創(chuàng)傷愈合與胚胎發(fā)育的理解，加深對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)等。Smad家族成員有3種受體活化型或通路限制型Smad (receptor-associatedSmads, R-Smad),共同通路型 Smad (co-operating Smads, Co-Smads)和抑制型 Smad(inhibitory Smads, Ι-Smads)。R-Smad 包括 BMP 下游的 Smadl、Smad5、Smad8 和 TGF β 及 activin 下游的 Smad2 和Smad3。他們都包含2個(gè)保守的Mad結(jié)構(gòu)域(Mad-homology, MH),位于N-端的MHl domain和C-端的MH2domain，并通過連接區(qū)形成球狀結(jié)構(gòu)。MHl是小DNA結(jié)合域，MH2負(fù)責(zé)與受體結(jié)合、反式激活及同聚化/異聚化。位于MHl和MH2之間可變的連接區(qū)富含Pro并具有serine/threonine磷酸化潛能。R-Smad通過T β RI的磷酸化主要發(fā)生在C端保守的SS (M/V) S motif中的2個(gè)絲氨酸中。R-Smad通過膜集合胞質(zhì)蛋白SARA( Smad Anchor forReceptor Activation)聚集到T β RI。未被憐酸化的R-Smad被SARA或endofin運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)中。通過T β RI的磷酸化,R-Smad與Co-Smad,如Smad4形成異構(gòu)復(fù)合物。TGF β家族受體下游的Smad通路中Co-Smad作為聚集點(diǎn),使R-Smad復(fù)合化。R_Smad/Smad4復(fù)合物通過胞質(zhì)蛋白importin定位到細(xì)胞核中。復(fù)合物作為轉(zhuǎn)錄因子直接或通過其他DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到DNA上。一旦進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化的R-Smad/Co-Smad復(fù)合物通過MHl結(jié)構(gòu)域與DNA上的 SBEs (Smad-binding elements)結(jié)合。Smad3/Smad4 通過 5bp 序列(CAGAC)結(jié)合到DNA上，而Smad4、Smadl、Smad5和Smad8則識(shí)別不同的富含GC的基序。盡管Smad復(fù)合物與DNA的結(jié)合力很低，但對Smad靶基因的轉(zhuǎn)錄激活是必須的；這就需要與其他轉(zhuǎn)錄因子的額外相互作用形成大的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物從而與染色質(zhì)具有較強(qiáng)的附著力。Smad2的MHl中的30個(gè)氨基酸的插入片段使其不能結(jié)合到DNA上。Smad2需要Fast家族的核DNA結(jié)合蛋白與DNA結(jié)合，并通過Smad4的輔助激活轉(zhuǎn)錄以應(yīng)答TGFP和activin。利用生物信息學(xué)手段我們在文昌魚中找到一種R-Smad ;而在脊椎動(dòng)物的該通路中通常具有2個(gè)R-Smad (Smad2和Smad3)，分工更細(xì)。我們對上述基因進(jìn)行了分離，并發(fā)現(xiàn)細(xì)菌沖擊后Bb-Smad2基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生上調(diào)，這說明TGF β -SMAD信號(hào)通路很可能參與了免疫應(yīng)答。文昌魚既具有脊椎動(dòng)物的基本特征，又具有許多無脊椎動(dòng)物的特征。深入開展文昌魚免疫系統(tǒng)的研究不僅有助于闡明脊椎動(dòng)物和人類免疫性的起源和進(jìn)化，更可以與其它海洋生物進(jìn)行縱向比較，幫助找到海洋生物特異的防御機(jī)制，認(rèn)識(shí)和闡明海水養(yǎng)殖動(dòng)物免疫防御機(jī)制對病原感染應(yīng)答的規(guī)律，為海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病害控制提供解決方法，為病害的免疫防治技術(shù)提供理論依據(jù)。從而為我國海水養(yǎng)殖業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展提供有力的保障和促進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用。術(shù)語說明 I. PCR技術(shù)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP進(jìn)行體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。2.⑶D分析軟件NCBI網(wǎng)站上提供的一種用來推測和分析特定氨基酸序列形成的結(jié)構(gòu)域信息的軟件。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)基因，核苷酸序列如SEQID No. I所示。一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。一種重組載體，插入了 SEQ ID NO. I所示核苷酸序列。該重組載體由pEASY_T3載體插入SEQ ID NO. I所示核苷酸序列獲得,該表達(dá)載體購自德國Novagen公司。一種重組大腸桿菌，轉(zhuǎn)入了 SEQ ID No. I所示核苷酸序列或上述重組載體。上述文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)基因、重組載體或重組大腸桿菌在制備海水養(yǎng)殖免疫防治藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明從模式動(dòng)物青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtauense)中克隆了文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)基因并利用該基因表達(dá)了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3。經(jīng)驗(yàn)證其在成體文昌魚各組織中廣泛分布，在細(xì)菌沖擊成體文昌魚后表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，從而揭示了其在先天免疫中的作用。本發(fā)明所述的表達(dá)基因有助于從理論上提高對免疫系統(tǒng)構(gòu)成和免疫應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為在基因水平生產(chǎn)開發(fā)新的細(xì)菌防治藥物奠定基礎(chǔ)，并可為海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病害控制提供新思路，為病害的免疫防治技術(shù)提供理論依據(jù)和基因來源。
圖I.青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtauense)成體總 RNA 提取的電泳圖；其中左側(cè)泳道、DNA分子量標(biāo)記(marker)，右側(cè)泳道、青島文昌魚成體總RNA ；
圖2.通過PCR擴(kuò)增克隆的編碼文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3基因片段的電泳圖；其中左側(cè)泳道、DNA分子量標(biāo)記(marker)，右側(cè)泳道、擴(kuò)增的DNA片段；圖3、文昌魚不同組織中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3表達(dá)量的柱狀圖；圖4、革蘭氏陽性 、陰性細(xì)菌沖擊成體文昌魚后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3表達(dá)量的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例I青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3編碼基因的克隆I. I青島文昌魚總RNA的的提取(提取步驟參照Takara公司的相關(guān)試劑盒說明書)I)將IOOmg新鮮組織(文昌魚成體)剪碎放入預(yù)I. 5mlep管中。2)加入ImlTrizol試劑,用研磨件快速研磨組織至無大的組織塊,室溫靜置5min,使組織充分裂解。此時(shí)樣品可放入-80°C長期保存。3)每ImlTrizol試劑加入O. 2ml的三氯甲烷(氯仿)，加蓋封嚴(yán)，劇烈震蕩15s，室溫靜置15分鐘。4)4°C,1000g,離心15min。此時(shí)樣品分為三層下層的紅色有機(jī)相，中間層及上層水相，RNA即留在上層水相中。5)將上層水相轉(zhuǎn)移如一干凈的離心管中。6)在水相中按O. 5ml異丙醇/ImlTrinzol加入異丙醇，混勻，室溫放置5min_10mino7)4°C，12000g，離心lOmin，棄上清。RNA沉淀在管底呈凝膠狀。8)按lml75%乙醇(DEPC水配制)/ImlTrizol試劑加入75%乙醇，溫和振蕩，懸浮沉淀。9) 4°C, 8000g,離心 5min,棄上清。10)室溫晾干或真空干燥5-10min。11)用50 μ IDEPC水或TE緩沖液溶解RNA，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或在_70°C冰箱。得到的成體文昌魚總RNA經(jīng)lwt%瓊脂糖凝膠電泳檢測，沒有發(fā)生降解，結(jié)果如圖I所示。I. 2cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)(合成步驟參照TIANGEN公司的相關(guān)試劑盒說明書)以文昌魚組織中提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)cDNA第一鏈，按以下順序及量力口入 200μ1ΕΡ 管中25mM MgCl2，4y I ;10Xbuffer，2y I ;dNTP, 2μ I ;RNaseinhibitor, 0. 5 μ I ；AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 6 μ I ；01igoT primer, I μ I ;模板，8 μ I ；ddH20 2 μ I ；共 20μ 1，42°C，50 分鐘；經(jīng)PCR擴(kuò)增，制得第一鏈cDNA。I. 3利用PCR進(jìn)行基因序列擴(kuò)增以第一鏈cDNA為模板，做PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物如下
BbSmad2/3-F :CCTGGAAAAGCGATGACGTCTATGC，和BbSmad2/3-R CGACATTACGACATGCTCGAACACG 為引物；PCR反應(yīng)條件為98°C，5分鐘；然后94°C，O. 5分鐘；55°C，I. 5分鐘；72°C，2分鐘，35個(gè)循環(huán)后，72 °C，延伸10分鐘。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明獲得一條約1400bp的DNA片段。然后用TIANGEN公司的DNA回收試劑盒按照其說明回收擴(kuò)增DNA片段。結(jié)果如圖2所
/Jn ο實(shí)施例2基因序列測定2. I. DNA片段與克隆載體連接將回收DNA片段連接到Transgene公司的pEASY_T3載體上。連接反應(yīng)體系連接載體酶混合物1μ 1，外源DNA片段4μ 1，手指輕彈離心管，混勻樣品，離心2秒鐘，把樣品集中在管底，37°C連接5分鐘。2. 2.按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》上制備大腸桿菌感受態(tài)的方法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)。2. 3.按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》上的熱激轉(zhuǎn)化方法將連接好的重組載體PEASY-T3轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5a感受態(tài)。2. 4.轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 a涂于含100 μ g/L氨芐青霉素的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 °C過夜培養(yǎng)，挑選白色轉(zhuǎn)化子作為模板，用T7和SP6作為引物，通過菌落PCR驗(yàn)證白色轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒是否含有PCR擴(kuò)增的DNA片段；T7和SP6的引物序列如下Τ7 TAATACGACTCACTATAGGGSP6:ATTTAGGTGACACTATAG2. 5.將質(zhì)粒含有PCR擴(kuò)增的DNA片段的轉(zhuǎn)化子送上海博尚生物技術(shù)公司測序。因此，獲得青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)基因的核苷酸序列，如SEQ IDNO. I所示。通過NCBI網(wǎng)站的blastX軟件分析發(fā)現(xiàn)其中含有一個(gè)1359bp的編碼青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的開放閱讀框架，共編碼452個(gè)氨基酸，氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。實(shí)施例3青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3成體表達(dá)模式研究3. I青島文昌魚新鮮成體組織/器官(鰓、肝盲囊、腸、表皮、肌肉、卵巢、精巢)RNA的提取。具體步驟同1.1。3. 2cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)。具體步驟同I. 2。3. 3Real_Time PCR將10 μ I SYBR Premix Ex Taq (2χ)，O. 4 μ I PCR Forward Primer (10 μ M), 0. 4 μ IPCR Reverse Primer (10 μ Μ)，2 μ I DNA template (成體文昌魚免疫沖擊前后各組織 cDNA)和 6. 8 μ I Sterilized ddH20 混勻，微離心。按照如下程序運(yùn)行real-time PCR 95°C 30s，I 個(gè)循環(huán)一95°C 5s,60°C 30s，40 個(gè)循環(huán)—95Γ 15s,60°C lmin,95°C 15s，I 個(gè)循環(huán)。3. 4對PCR產(chǎn)物濃度作定量分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3在成體文昌魚的肝盲囊(HC)、表皮(Epi)、肌肉、鰓、腸、卵巢和精巢中都有不同程度的表達(dá)。并且在鰓中表達(dá)量很高,約為同組織中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的3倍，如圖3所示。實(shí)施例4青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3免疫沖擊前后表達(dá)模式研究4. I免疫沖擊將成體文昌魚(Branchiostoma belcheri )培養(yǎng)在IO7大腸桿菌(Ε· coli)或金黃色葡萄球菌(S. aureus)PBS溶液中。等量PBS溶液作為對照。第0，2，4，8，12和24小時(shí)取適量文昌魚進(jìn)行組織分離。4. 2組織進(jìn)行RNA提取。具體步驟同I. I。·
4. 3cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)。具體步驟同I. 2。4. 4Real-Time PCR0 具體步驟同 3. 3。4. 5對PCR產(chǎn)物濃度作定量分析，分析結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3在大腸桿菌沖擊2h后轉(zhuǎn)錄持續(xù)升高；到12h時(shí)約為正常水平的3倍。沖擊24h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平降低，但仍高于正常狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄水平。金葡菌沖擊后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)變化與大腸桿菌沖擊后的應(yīng)答模式相似，如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3在成體文昌魚各組織中廣泛分布以及在細(xì)菌沖擊成體文昌魚后表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，從而揭示該表達(dá)基因在先天免疫中發(fā)揮作用的可能。
權(quán)利要求
1.一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)基因，核苷酸序列如 SEQ ID No. I 所示。
2.一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
3.一種重組載體，插入了 SEQ ID NO. I所示核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的重組載體，該重組載體由pEASY-T3載體插入SEQID NO. I所示核苷酸序列獲得。
5.一種重組大腸桿菌，轉(zhuǎn)入了 SEQ ID No. I所示核苷酸序列或含有權(quán)利要求3所述的重組載體。
6.權(quán)利要求I所述文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)基因、權(quán)利要求3所述重組載體或權(quán)利要求5所述的重組大腸桿菌在制備海水養(yǎng)殖免疫防治藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用，文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3的表達(dá)基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；該文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白BbSmad2/3，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明所述的表達(dá)基因有助于從理論上提高對免疫系統(tǒng)構(gòu)成和免疫應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為在基因水平生產(chǎn)開發(fā)新的細(xì)菌防治藥物奠定基礎(chǔ)，并可為海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病害控制提供新思路，為病害的免疫防治技術(shù)提供理論依據(jù)和基因來源。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102911944SQ201210441929
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者馮力駿, 張妍, 孔雨, 張長青, 閆杰, 王建峰, 劉歡歡, 荊韌威, 李開霖, 劉凱興, 董璇 申請人:山東大學(xué)