專利名稱：：一種胞內(nèi)融合表達(dá)型前t載體及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可用于快速構(gòu)建目的基因胞內(nèi)融合表達(dá)工程菌的胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體及其制備與應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
：利用大腸桿菌制備具有藥用價(jià)值的生物活性肽是基因工程最常用的技術(shù)路線，但是目的基因表達(dá)產(chǎn)物在過(guò)表達(dá)時(shí)容易形成包含體，第一個(gè)氨基酸一般為曱硫氨酸，與天然生物活性肽的氨基酸序列不一致，作為藥用時(shí)容易產(chǎn)生免疫原性。需要探索純化工藝，難以表達(dá)分子量小的多肽。利用融合蛋白表達(dá)策略可以很好地解決上述問題目的基因融合表達(dá)以后，可以利用融合伴侶攜帶的純化標(biāo)簽，用親和純化工藝純化目標(biāo)蛋白，快速高效純化目標(biāo)蛋白，融合蛋白用特異性蛋白酶酶切后可以得到氨基酸序列與天然生物活性肽完全一致的產(chǎn)物，可以表達(dá)分子量小的多肽。還可以利用融合伴侶增加表達(dá)產(chǎn)物的溶解性，從而有助于目標(biāo)蛋白的純化和后續(xù)復(fù)性。大腸桿菌二硫鍵形成蛋白DsbA是一種周質(zhì)蛋白，天然的DsbA基因上游有編碼信號(hào)肽的基因序列，指導(dǎo)DsbA分泌于周質(zhì)空間。DsbA具有很好的溶解性，具有分子伴侶的功能，幫助其他周質(zhì)蛋白形成分子內(nèi)二疏鍵。有文獻(xiàn)報(bào)道，利用分子生物學(xué)技術(shù)，去除DsbA信號(hào)肽基因，定點(diǎn)突變Cys殘基，使不含Cys殘基的DsbA在胞內(nèi)表達(dá)，許多單獨(dú)表達(dá)容易形成包含體的生物活性肽與DsbA突變體融合后，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在。將目的基因重組于無(wú)信號(hào)肽DsbA基因的下游，在胞內(nèi)可溶性表達(dá)目的基因，是新法制備各類生物活性肽的有效方法。但是常規(guī)的基因重組工序復(fù)雜，需要涉及基因拼接，DNA重組等。雖然現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為這種重組提供了可行的多樣的方法，但是過(guò)程較為復(fù)雜，耗時(shí)、耗材，需要使用多種限制性內(nèi)切酶、DNA純化等工序。T-載體是近年發(fā)M來(lái)的一種用于直接克隆PCR產(chǎn)物的新型載體。T-載體一般為線性，其分子末端各有一個(gè)3'dT(脫氧胸苷)突出。PCR技術(shù)是分子生物學(xué)和基因工程研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)，它被廣泛用于體外擴(kuò)增已知或未知的特異DNA片段。利用％《DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在擴(kuò)增DNA的3'末端非模板依賴地加上一個(gè)核苷酸，通常為脫氧腺苷酸(dA)。這個(gè)3'dA突出端被用于把PCR產(chǎn)物插入到插入位點(diǎn)有一個(gè)3'dT突出的T-載體上。這樣就將PCR產(chǎn)物以粘性末端連接的方式直接克隆到載體上。這種方式不僅克服了常規(guī)克隆方法的缺點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)便、方法快捷、連"f妄效率高，因而其應(yīng)用范圍非常廣泛。有多種方法制備T載體，利用限制性內(nèi)切酶制備T-載體是最為先進(jìn)的方式，其中ZcmI最適合于制備T-載體，該酶的特異性識(shí)別序列為5'CCANNNNN*NNNNTGG3',N可以是A、T、G、C的任意一種。酶法制備T載體首先要得到一個(gè)環(huán)狀的前T質(zhì)粒載體，經(jīng)Xc附I酶切兩個(gè)位點(diǎn)后，載體的大片段DNA線性化，而且兩個(gè)3，末端均帶dT,從而得到可用于PCR產(chǎn)物快速克隆的T栽體，如市場(chǎng)上供應(yīng)pUCm-T。目前市場(chǎng)上供應(yīng)的主要是克隆型T載體，主要滿足基因保存和測(cè)序的需要，如果構(gòu)建一種表達(dá)型T載體，將PCR產(chǎn)物直接連接于表達(dá)型T載體上，使目的基因位于表達(dá)框架內(nèi)，直接得到表達(dá)載體，即可一省略復(fù)雜的DNA重組步驟。不僅克隆目的DNA，而且還可以直接表達(dá)目的基因。另外，用酶法制備T載體有可能存在以下幾個(gè)方面的問題，一，如果酶切質(zhì)粒DNA質(zhì)量不高，外源基因不能插入載體中，而載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后能夠在抗性平板上生長(zhǎng)。pUCm-T載體設(shè)計(jì)了藍(lán)白斑篩選方案以篩選目的DNA片段是否插入載體，如果插入栽體，編碼半乳糖苷酶ot肽的基因LacZ被插入失活，細(xì)胞內(nèi)沒有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的篩選平板中白色菌落為插入失活陽(yáng)性克隆，而蘭色菌落為不含外源基因的陰性克隆。這種方法需要使用價(jià)格昂貴的X—gal,制備藍(lán)白斑篩選平板也比較麻煩。在特定融合表達(dá)載體中不適合應(yīng)用，需要采用別的篩選方案。二，如果兩個(gè)Xc/wI酶切位點(diǎn)空間位置較近，將影響載體的酶切效率，即使載體DNA的純度很高，酶的質(zhì)量也很好，也會(huì)出現(xiàn)酶切載體一"刀，，的情況，這種線性的載體不能和PCR產(chǎn)物連接，而是載體自連，從而導(dǎo)致陰性克隆的產(chǎn)生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明則是為了提供一種胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體及其制備方法，可利用這種前T載體得到的T載體，簡(jiǎn)單地、快速地構(gòu)建表達(dá)于胞內(nèi)的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用XcwI夕卜，無(wú)需其他限制性內(nèi)切酶即可快速構(gòu)建胞內(nèi)融合表達(dá)型基因工程菌。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體，由如下方法制備得到(l)構(gòu)建編碼^spTI-GSGSG畫HHHHHH國(guó)義c附I-Ampr-Xc附I誦州"din的DNA片段——DNA1;(2)定點(diǎn)突變pET39質(zhì)粒中Lacl基因內(nèi)部的三個(gè)義cml位點(diǎn)，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcwI識(shí)別位點(diǎn)喪失，得到定點(diǎn)突變消除位點(diǎn)的pET39-l;(3)利用fo;TI和///"dill將DNA1定向重組于pET39-l中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號(hào)肽基因，得到所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體。所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體質(zhì)粒圖鐠如圖l所示。本發(fā)明還涉及所述的胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體的制備方法，所述方法如下(1)構(gòu)建編碼JR^TI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-ZcmI-///"dIII的DNA片段——DNA1;2)定點(diǎn)突變pET39質(zhì)粒中Lacl基因內(nèi)部的三個(gè)XcmI位點(diǎn)，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使ZcwI識(shí)別位點(diǎn)喪失，得到定點(diǎn)突變消除XcwI位點(diǎn)的pET39-l;(3)利用說(shuō):/TI和歷'"dIII將DNA1定向重組于pET39-l中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號(hào)肽基因，得到所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體。所構(gòu)建的5^TI-GSGSG-HHHHHH-ZcwI-Ampr-Xc附I-歷"din目的結(jié)構(gòu)如下<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>所構(gòu)建的5s/7TI-GSGSG-HHHHHH-^"cmI-Ampr^rcwI-//z"din目的基因序列，其序列可以有變化，前部分它只要編碼這些氨基酸(GSGSG-HHHHHH)就可以，不過(guò)編碼第五個(gè)組氨酸的密碼子必須設(shè)計(jì)為CAC,使該密碼子的第三個(gè)堿基與第六個(gè)組氨酸的密碼子的前兩個(gè)堿基組成義cwl識(shí)別序列(CCANNNNN*NNNNTGG的前半部分關(guān)4建識(shí)別序列CCA,其下游第五個(gè)堿基N、殳計(jì)為T);因此，所述DNA1在滿足編碼所述氨基酸序列的前提下，還應(yīng)滿足如下條件含有片段CCANNNNTNNNNTGG,N選自A、T、C、G中的一種，才艮據(jù)其編碼的氨基酸進(jìn)行設(shè)計(jì)。其中，下劃線標(biāo)記的為關(guān),列，中間的T是制備T載體所必須的堿基，可作為絲氨酸密碼子第一個(gè)堿基，在本發(fā)明中第六個(gè)組氨酸密碼子下游設(shè)計(jì)為氨基酸密碼子，不可以設(shè)計(jì)為TAA、TAG或TGA等終止密碼子，否則不能表達(dá)為融合蛋白。優(yōu)選設(shè)計(jì)甘氨酸密碼子。優(yōu)選的，所述DNA1序列如下5，-ATAC77^4GCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC國(guó)3，。翻譯情況如下5，-TACJGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTyrLeuSerGluLysLysGlySerGlyTCTGGTCATCATCATCATCACCA*GGASerGlyHisHisHisHisHisHisGlyTCTAATGfeATAGGTTAATGTC-3，Ser恭附I所述DNA1中含有卡那霉素除外的普通大腸桿菌敏感的抗生素抗性基因，如氨千青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因或氯霉素抗性基因等。前T載體有雙抗性，如果外源DNA成功地插入于兩個(gè)Jc/z/I位點(diǎn)之間，前T載體中位于兩個(gè)Jc邁I位點(diǎn)之間的抗生素抗性消失，只留下卡那霉素抗性，有利于用影印法快速篩選陽(yáng)性克隆。所述DNA1構(gòu)建方法如下(1)引物A、B互為模板進(jìn)行PCRl反應(yīng)A:5，-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3';B:5,-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3，；PCR反應(yīng)條件94。C變性10min,48。C退火300s,72。C延伸10min;(2)以pETllb為模板，利用引物Ampl、Amp2進(jìn)行PCR2反應(yīng)Ampl:5'扁CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA國(guó)3';Amp2:5'-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3';Amp2引物的5，末端含有//z'wdlll和JTcmI識(shí)別序列(CCANNNNN*NNNNTGG,其中N承設(shè)計(jì)為T,N選自A、T、C、G中的一種)。(3)將PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2進(jìn)行基因拼接，得到所述編碼^^TI-GSGSG-HHHHHH國(guó)Xcml-Ampr陽(yáng)Xcml-歷"din的DNA片段——DNA1;拼接反應(yīng)條件94。C預(yù)變性3min,94。C變性30s，60。C退火30s,72。C延伸120s,30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。所述的定點(diǎn)突變?nèi)齻€(gè)ZcwI位點(diǎn)，采用常規(guī)SOE技術(shù)，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變改變Lacl的基因DNA序列，使Xcml識(shí)別位點(diǎn)喪失，得到定點(diǎn)突變消除Xc附I位點(diǎn)的pET39-l所述的DsbA信號(hào)肽基因的去除(1)以pET39為模板，以DsbA-l:5，國(guó)AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，、DsbA畫2:5,-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3，為引物進(jìn)行PCR3反應(yīng)，PCR條件94。C3min;94。C30s、40°C30s、72°Clmin，3個(gè)循環(huán)；94°C30s、48°C30s、72°Clmin,27個(gè)循環(huán)；72°C10min;4°C10min;(2)以7V"&I和BwTI酶切PCR3產(chǎn)物和pET39-2,使不含信號(hào)肽基因的DNA片段置換pET39-2中原有的DsbA基因，得到胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體。所述的胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體主要用于制備胞內(nèi)融合表達(dá)型T載體。具體的，所述應(yīng)用如下將胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體用限制性內(nèi)切酶Xcml在37。C下酶切2h，再進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條明顯的亮帶，切取大片段，用3SDNAGelPurificationKit純化回收，得到線性化的胞內(nèi)融合表達(dá)型T載體。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在利用本發(fā)明得到的T載體可簡(jiǎn)單地、快速地構(gòu)建表達(dá)于胞內(nèi)的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用Xcml外，無(wú)需其他限制性內(nèi)切酶即可快速構(gòu)建胞內(nèi)融合表達(dá)型基因工程菌。(四)圖1為本發(fā)明所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體質(zhì)粒圖譜。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此(實(shí)施例中所有試劑、質(zhì)粒、酶、引物等，均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)實(shí)施例l:Lacl基因定點(diǎn)突變消除義cml位點(diǎn)采用SOE法，以pET39為PCR模板，六條引物分別設(shè)計(jì)為L(zhǎng)ac-1:5，誦ttaggatccgcgacccatttgct-3,(含丑o附HI.位點(diǎn))Lac-2:5，陽(yáng)agagatatccgcaccaacgcgca-3，(含五coRV位點(diǎn))Lac國(guó)3:5'國(guó)ctgattggcgttgctacctccagtctggccctgca-3，(用于哭變4立,存、1)Lac-4:5'-gccagactggaggtagcaacgccaatcagcaacga-3，(用于哭變位點(diǎn)l)Lac國(guó)5:5'-tcccactgcgatgttagttgctaacgatcagatggcgct國(guó)3，(用于突變4立點(diǎn)2、3)Lac國(guó)6:5，誦catctgatcgttagcaactaacatcgcagtgggaacgatgc3，(用于哭變位點(diǎn)2、3)表2:位點(diǎn)突變前后序列對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以Lac-1和Lac-2為引物，pET-39質(zhì)粒為才莫板，PCR擴(kuò)增Lacl序列。反應(yīng)參數(shù)如下94。C預(yù)變性3min，進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性0.5min,50。C退火0.5min,72。C延伸2min，30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min,產(chǎn)物標(biāo)記為"Lacl/2"。(1)定點(diǎn)突變979bp處的Xcml位點(diǎn)以Lac-l和Lac-4為引物、Lacl/2為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，參數(shù)為94。C預(yù)變性3min,進(jìn)入PCR循環(huán)94°C變性0.5min,50。C退火0.5min，72。C延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。其產(chǎn)物標(biāo)記為"Lacl/4"。以Lac-2和Lac-3為引物、Lacl/2為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94。C預(yù)變性3min，進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性0.5min,48。C退火0.5min，72。C延伸1min,30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。產(chǎn)物標(biāo)記為"Lac2/3",置-20。C保存。(2)Lac-l和Lac-2為引物對(duì)Lacl/4和Lac2/3進(jìn)行SOE拼接SOE參數(shù)94。C預(yù)變性3min，進(jìn)入PCR循環(huán)94°C變性0.5min,56。C退火0.5min,72。C延伸2min,30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。產(chǎn)物標(biāo)記為"Lac979"。(3)定點(diǎn)突變1495bp和1513bp兩處的Xcml位點(diǎn)以Lac-l和Lac-6為引物、Lac979為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94。C預(yù)變性3min,進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性0.5min，50。C退火0.5min,72。C延伸2min,30個(gè)循環(huán),72。C延伸10min。產(chǎn)物標(biāo)記為"Lacl/6"。以Lac-2和Lac-5為引物、Lac979為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94。C預(yù)變性3min，進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性0.5min,47。C退火0.5min,72。C延伸0.5min,4個(gè)循環(huán)；再94。C變性0.5min，50。C退火0.5min，72。C延伸0.5min，26個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。產(chǎn)物標(biāo)記為"Lac2/6"。(4)以Lac-l和Lac-2為引物對(duì)Lacl/6和Lac2/5進(jìn)行SOE拼接SOE參數(shù)94。C預(yù)變性3min，進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性0.5min，56。C退火0.5min,72。C延伸2min,30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。產(chǎn)物標(biāo)記為"LacI'"。拼接產(chǎn)物L(fēng)acl'利用fiamHI和五coRV定向重組于pET39中(具體方法為以5awHI和￡coRV分別雙酶切Lacl'PCR產(chǎn)物和pET39,切膠回收pET39質(zhì)粒的大片段DNA,與Lacl'PCR產(chǎn)物的酶切回收產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主DH5a),得到LacI基因的三個(gè)ZcmI位點(diǎn)定點(diǎn)突變的pET39-l質(zhì)粒。實(shí)施例2:Icwl酶切盒的制備及前T載體的構(gòu)建引物A、B互為模板進(jìn)行PCR1反應(yīng)A:5'國(guó)ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3'B:5'-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC誦3'反應(yīng)參數(shù)如下94。C變性10min，48。C退火300s,72。C延伸10min。以pETl1b為模板，利用下列兩條引物進(jìn)行PCR2反應(yīng)Ampl:5'-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3'Amp2:5'-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3'反應(yīng)參數(shù)如下94。C預(yù)變性3min,94。C變性30s,55。C退火30s,72°C延伸120s,30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。上述兩PCR1和PCR2產(chǎn)物片^殳用引物A和Amp2進(jìn)行基因拼接反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)如下94。C預(yù)變性3min,94。C變性30s,60。C退火30s，72°C延伸120s,30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。得到編碼5^TI-GSGSG-HHHHHH-Zc附I-Ampr-義cwI-歷"dni的DNA片段，利用fe/TI和///mini定向重組于實(shí)施例1已定點(diǎn)突變消除XcwI位點(diǎn)的pET39-l中，得到pET39-2。實(shí)施例3:DsbA信號(hào)肽基因的去除(保留ATG作為起始密碼子)設(shè)計(jì)引物DsbA-l:5，-AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3',(劃線部分為識(shí)別序列)DsbA-2:5，-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3，，(劃線部分為^y;TI識(shí)別序列)PCR模板pET39質(zhì)粒(或大腸桿菌基因組DNA也可，推薦pET39質(zhì)粒作為模板)PCR參數(shù)94。C3min94°C30s40°C30s72°Clmin3個(gè)循環(huán)94°C30s48°C30s72°Clmin27個(gè)循環(huán)72。ClOmin4°ClOmin以iV&I和^;TI酶切PCR產(chǎn)物和pET39-2,-使不含信號(hào)肽基因的DNA片段置換pET39-2中原有的DsbA基因，獲得不含DsbA信號(hào)肽基因的重組質(zhì)粒，即胞內(nèi)融合表達(dá)型前T栽體，為實(shí)現(xiàn)DsbA融合蛋白胞內(nèi)表達(dá)創(chuàng)造條件。實(shí)施例4:目的基因與融合表達(dá)型T載體的重組TnaAl:5,-CTGATGACGATGACAAAATGGAAAACTTTAAACATCTC畫3，38bpTnaA2:5，-AAGCTTTTAAACTTCTTTAA-3,21bp以K-12為模板，TnaA1和TnaA2為引物，用plusDNA聚合酶PCR擴(kuò)增色氨酸酶基因，反應(yīng)參數(shù)如下94。C預(yù)變性3min，94。C變性30s，42。C退火30s,72。C延伸90s,30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。將實(shí)施例2的表達(dá)型前T載體用限制性內(nèi)切酶在37。C下酶切2h,再進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果可見兩條明顯的亮帶，切取大即得到線性化表達(dá)型T載體。將PCR產(chǎn)物直接與線性化T載體用T4DNAligase在4。C冰箱中連接16h,連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化五.cc^DH5a。實(shí)施例5:正向連接重組子的篩選以及胞內(nèi)融合表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建表達(dá)型重組轉(zhuǎn)化子的篩選引物check:5'-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTT國(guó)3'首先，將連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化液在含100ng/mL卡那霉素的LB固體平板均勻鋪開，35。C恒溫箱培養(yǎng)1620h。正向篩選能正常生長(zhǎng)的菌落。然后將在卡那霉素抗性LB固體平板上正常生長(zhǎng)的菌落影印到含100pg/mL氨爺霉素LB固體平板上。3(TC恒溫箱培養(yǎng)1620h。在卡那霉素抗性平板上挑選相應(yīng)的不能在氨千霉素抗性平板上生長(zhǎng)的克隆。這一步可以將未酶切和只有一個(gè)位點(diǎn)酶切的重組質(zhì)粒篩掉，稱為反向篩選。最后，將篩選到的克隆，用單菌落PCR法，以鑒定引物check和目的基因的下游引物和用PCR進(jìn)行鑒定，這一步可以消除平板上殘余的未轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的重組質(zhì)粒的影響并能確定目的基因的插入方向，稱為正向篩選。其體系和參數(shù)分別為10xBuffer(wkhMg2+)5|iL10mmol/LeachdNTPs210mmolTnaA12|jL10mmol/Lcheck2|jL相應(yīng)陽(yáng)性單克隆無(wú)菌牙簽蘸取TaqDNA聚合酶0.5MuL無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至50MuL94。C預(yù)變性3min,進(jìn)入PCR循環(huán)94'C變性0.5min,42。C退火0.5min,72。C延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并攝片，有分子量約1500bp條帶出現(xiàn)的為陽(yáng)性克隆。經(jīng)check引物鑒定為陽(yáng)性的克隆送英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序證實(shí)，正向測(cè)序引物為T7promoterprimer#69348-3,反向測(cè)序引物為T7terminatorprimer#69337-3。權(quán)利要求1.一種胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體，由如下方法制備得到:(1)構(gòu)建編碼BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；(2)定點(diǎn)突變pET39質(zhì)粒中LacI基因內(nèi)部的三個(gè)XcmI位點(diǎn)，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcmI識(shí)別位點(diǎn)喪失，得到定點(diǎn)突變消除XcmI位點(diǎn)的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII將DNA1定向重組于pET39-1中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號(hào)肽基因，得到所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體。2.如權(quán)利要求1所述的胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體，其特征在于所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體質(zhì)粒圖i普如圖1所示。3.制備如權(quán)利要求1或2所述的胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體的方法，所述方法如下(1)構(gòu)建編碼5s/TI-GSGSG-HHHHHH-ZcmI-Ampr-Xc附I國(guó)歷"dIII的DNA片段——DNA1;(2)定點(diǎn)突變pET39質(zhì)粒中Lacl基因內(nèi)部的三個(gè)Xcml位點(diǎn)，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使Xc附I識(shí)別位點(diǎn)喪失，得到定點(diǎn)突變消除位點(diǎn)的pET39-l;(3)利用^spTI和///"dill將DNA1定向重組于pET39-l中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號(hào)肽基因，得到所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1序列含有如下片段CCANNNNTNNNNTGG。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA1序列如下5'-ATACr編GCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCA￡￡4TGGAICTAAI^￡ATAGGTTAATGTC-3'6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1中含有卡那霉素除外的普通大腸桿菌敏感的抗生素抗性基因。7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1構(gòu)建方法如下(1)引物A、B互為模板進(jìn)行PCR1反應(yīng)A:5，誦ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3，；B:5，畫GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3,;PCR反應(yīng)條件94。C變性10min,48。C退火300s，72。C延伸10min;(2)以pETllb為模板，利用引物Ampl、Amp2進(jìn)行PCR2反應(yīng)Ampl:5'-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3';Amp2:5'國(guó)CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3';所述編碼5^TI-GSGSG-HHHHHH-XcwI-AmpLXcmI-///"dIII的DNA片段——DNA1;拼接反應(yīng)條件94。C預(yù)變性3min,94。C變性30s,60°C退火30s，72。C延伸120s,30個(gè)循環(huán),72。C延伸10min。8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的去除信號(hào)肽基因的方法如下(1)以pET39為模板，以DsbA誦l:5,國(guó)AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，、DsbA-2:5，-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3，為引物進(jìn)行PCR3反應(yīng),PCR條件:94。C3min;94°C30s、40°C30s、72。Clmin,3個(gè)循環(huán)；94°C30s、48°C30s、72°Clmin，27個(gè)循環(huán)；72°C10min;4°C10min;(2)以MM和5s/TI酶切PCR3產(chǎn)物和pET39-2，使不含信號(hào)肽基因的DNA片段置換pET39-2中原有的DsbA基因，得到胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體。39.如權(quán)利要求1或2所述的胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體在制備胞內(nèi)融合表達(dá)型T載體中的應(yīng)用。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用如下將胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體用限制性內(nèi)切酶Xcml在37。C下酶切2h,再進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條明顯的亮帶，切取大片段，用DNA純化試劑盒回收DNA,得到胞內(nèi)融合表達(dá)型T載體。全文摘要本發(fā)明提供了一種胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體，由如下方法制備得到(1)構(gòu)建編碼BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp<sup>r</sup>-XcmI-HindIII的DNA1片段；(2)定點(diǎn)突變pET39質(zhì)粒中LacI基因內(nèi)部的三個(gè)XcmI位點(diǎn)，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcmI識(shí)別位點(diǎn)喪失，得到定點(diǎn)突變消除XcmI位點(diǎn)的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII將DNA1定向重組于pET39-2中；(4)去除pET39-2中DsbA信號(hào)肽基因，得到所述胞內(nèi)融合表達(dá)型前T載體。本發(fā)明除了使用XcmI制備線形T載體外，不需要用其它限制性內(nèi)切酶，可一步法構(gòu)建融合表達(dá)基因工程菌，為大量制備活性肽工程菌庫(kù)提供了可行的技術(shù)方法。文檔編號(hào)C12N15/63GK101381738SQ20071007121公開日2009年3月11日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者于真真,任慧穎,楊丹燕,林陳水,明許申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)