基因工程IFNα-2b融合蛋白質(zhì)新型制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了基因工程IFNα-2b融合蛋白質(zhì)新型制備工藝，為解決無法去除錯(cuò)配異構(gòu)體的現(xiàn)狀，采用融合表達(dá)載體，將促進(jìn)干擾素α-2b二硫鍵正確折疊的蛋白質(zhì)及高效蛋白酶底物片段與干擾素α-2b基因融合表達(dá)，形成可溶性天然結(jié)構(gòu)表達(dá)形式；目的蛋白以可溶性天然結(jié)構(gòu)形式表達(dá)，活性高，無需復(fù)性處理，避免蛋白質(zhì)異構(gòu)體產(chǎn)生；蛋白質(zhì)純化工藝簡(jiǎn)潔，僅需一步金屬螯合親和層析產(chǎn)品純度即可達(dá)到90%以上，去除融合蛋白片段，再利用該親和層析獲得純度95%以上的終產(chǎn)品，產(chǎn)量高，活性明顯提升，成本低；達(dá)全菌體蛋白的30%以上；獲得了干擾素α-2b天然結(jié)構(gòu)的表達(dá)產(chǎn)物，產(chǎn)品活性優(yōu)于現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)和國(guó)際產(chǎn)品。
【專利說明】基因工程IFN a-2b融合蛋白質(zhì)新型制備工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因工程干擾素(IFN) a _2b融合蛋白質(zhì)的新型制備工藝，更具體地說，本發(fā)明涉及基因工程IFN a _2b融合蛋白質(zhì)的基因重新構(gòu)建、可溶性形式表達(dá)和新型純化制備工藝。
【背景技術(shù)】 [0002]干擾素是一種重要的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子。干擾素具有廣譜的抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，是一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物。
[0003]干擾素的種類繁多，有人體干擾素、動(dòng)物干擾素、昆蟲干擾素、植物干擾素和細(xì)胞干擾素。人干擾素主要來自人體白細(xì)胞和類淋巴細(xì)胞株，分α、β、Y、ω四個(gè)型別，其中人ct干擾素有15種亞型(a 1、a2a、a2b )。人的β型干擾素(HuIFN2 β )和Y型干擾素(HuIFN2y)公認(rèn)的只有一個(gè)亞型。白細(xì)胞干擾素的制劑化面臨有兩個(gè)問題:首先大量生產(chǎn)必須保證有足夠數(shù)量的外周血白細(xì)胞，其次以數(shù)百上千人血液中采集的白細(xì)胞用仙臺(tái)病毒誘生時(shí)，必須保證不混入來自人體的病毒和基因。雖然采用目前的精制技術(shù)和處理方法提純是可靠的，但由于這種干擾素難以制備，產(chǎn)量有限，價(jià)格昂貴，限制了其臨床應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)批量生產(chǎn)干擾素使之臨床應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)。
[0004]20世紀(jì)80年代中期:第二代基因工程IFN a -2b問世，其分子結(jié)構(gòu)、功能與人IFN幾乎一致，于1986年被FDA批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎、丙型肝炎(1991年2月)，繼而被批準(zhǔn)用于毛細(xì)胞白血病(1986年6月)、生殖器疣(1988年6月)、AIDS相關(guān)的Kaposi ; s肉瘤(1988年11月)及多種腫瘤治療如膀胱癌，CML，頭頸部腫瘤、惡性黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非Hodgkin' s淋巴瘤，腎細(xì)胞癌等。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)重組人干擾素的企業(yè)有30多家:其中半數(shù)以上企業(yè)生產(chǎn)IFNa -2b品種。其劑型主要包括注射劑、栓劑、滴眼液、乳膏等共有290多個(gè)文號(hào)。
[0006]在國(guó)內(nèi)重組人干擾素市場(chǎng)，呈現(xiàn)國(guó)產(chǎn)藥品和進(jìn)口藥品并存的格局。進(jìn)口重組人干擾素主要有先靈葆雅、羅氏制藥生產(chǎn)的PEG修飾的長(zhǎng)效干擾素，價(jià)格偏高，平均單價(jià)在1,300元左右。國(guó)產(chǎn)重組人干擾素主要為普通干擾素，注射用干擾素a _2b單價(jià)(300萬單位)在30元/支左右，普通干擾素市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)主要集中在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)之間。國(guó)內(nèi)主要生物制藥企業(yè)正在積極研制長(zhǎng)效重組人干擾素，一旦研制成功正式投產(chǎn)，憑借區(qū)位及價(jià)格優(yōu)勢(shì)，國(guó)產(chǎn)重組人干擾素生產(chǎn)企業(yè)的市場(chǎng)份額將顯著擴(kuò)大。
[0007]近年來，我國(guó)重組人干擾素的銷售額保持逐年平穩(wěn)的增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)在未來三到五年內(nèi)，重組人干擾素國(guó)內(nèi)市場(chǎng)年增長(zhǎng)率將保持在10%-15%之間，預(yù)計(jì)到2015年我國(guó)重組人干擾素市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到48億元左右。
[0008]然而，與市場(chǎng)需求不相適應(yīng)的是國(guó)內(nèi)幾乎所有生產(chǎn)企業(yè)一直沿用舊的生產(chǎn)工藝，如大腸桿菌表達(dá)、包涵體分離純化、尿素變性、再?gòu)?fù)性、純化，尤其變性過程中使用高純度尿素和復(fù)性過程中使用氧化-還原型谷胱甘肽為主要原料的復(fù)性劑，致使生產(chǎn)成本顯著提高，復(fù)性率較低，同時(shí)產(chǎn)品中殘存無活性的二硫鍵錯(cuò)配異構(gòu)體，盡管純度檢測(cè)能夠通過國(guó)家規(guī)定的95%，但無活性的二硫鍵錯(cuò)配異構(gòu)體成分約占終產(chǎn)品的10-15%，故國(guó)內(nèi)產(chǎn)品活性低、療效差、副作用大，且通過傳統(tǒng)工藝根本無法解決。近年來有人嘗試?yán)酶邏阂合喾聪嗌V進(jìn)行錯(cuò)配異構(gòu)體的去除實(shí)驗(yàn)，通過C18層析柱+進(jìn)口乙腈+進(jìn)口三氟乙酸可以達(dá)到95%純度，但工藝成本顯著提高，其成本是原產(chǎn)品的三倍以上，盡管國(guó)家科技部新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)將干擾素長(zhǎng)效技術(shù)改造和提取工藝改造列為重點(diǎn)資助方向，但成效至今尚未顯現(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明目的無法去除錯(cuò)配異構(gòu)體的現(xiàn)狀及制造成本高的問題，而提供基因工程IFN a-2b融合蛋白質(zhì)新型制備工藝。
[0010]基因工程IFN a-2b融合蛋白質(zhì)基因，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0011]用于制備基因工程IFN a-2b融合蛋白質(zhì)的基因，其堿基序列如序列表SEQ IDN0.1所示。
[0012]用于制備基因工程IFN a-2b融合蛋白質(zhì)的基因，其堿基序列如序列表SEQ IDN0.2所示。
[0013]一種表達(dá)載體，它是攜帶T7強(qiáng)啟動(dòng)子且含有多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體，并將其堿基序列如序列表SEQ ID N0.3所示的基因，克隆到該表達(dá)載體的T7啟動(dòng)子之后；
所述的多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體為PETlla。
[0014]基因工程IFN a- O人工合成堿基序列如序列表SEQ ID N0.1和2所示的基因；
2)用Ndel、EcoRI雙酶切堿基序列如序列表SEQID N0.1所示的基因和PETlla，T4連接酶連接，構(gòu)建的mmTrxA-HIS6-SUM0質(zhì)粒；
3)利用Ncol、EcoRI雙酶切如序列表SEQID N0.2所示的基因和步驟2)所構(gòu)建的PETlIa-TrxA-HIS6-SUM0 質(zhì)粒；T4 連接酶連接，構(gòu)建的 pETlla_7E?-5Z繼9-1FNa -2b 質(zhì)粒；
4MfpETlla-7E?-5Z#(9- TTWff質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)，純
化；
5)用SUMO酶切步驟4)純化的融合蛋白；酶切融合蛋白去除融合蛋白分子中轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO酶切底物部分，再純化；
步驟4)得到的純化蛋白經(jīng)過緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱,用含有(T0.5M NaCl的TE緩沖液連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分；目的組分峰部分經(jīng)小型中空纖維超濾器作用30分鐘超濾濃縮換液后，使?jié)饪s物通過用20mM Tris-HCl,pH8.0,0.15M NaCl 緩沖液平衡過的 1.6X 100cm IMAC 柱(Pharmacia)，并用含有 0.15MNaCl的緩沖液洗脫。收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，并再次過IMAC液相色譜柱，收集蛋白質(zhì)峰值部分，并在30mM PBS中徹底透析，透析后于-20°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆?；所述?0.15M NaCl 的緩沖液為 20mM Tris-HCl, ρΗ8.0,200mM 咪唑。
[0015]發(fā)明詳述:本發(fā)明IFN a -2b大腸桿菌偏性密碼子為主體，以人工體外基因合成，將有促進(jìn)外源蛋白質(zhì)二硫鍵正確形成的轉(zhuǎn)硫酶A(TrxA)基因以第一順位克隆到表達(dá)載體的T7啟動(dòng)子之后；將便于純化和組氨酸標(biāo)簽(His6-Tag)基因以第二順位克隆到TrxA之后；將SUMO蛋白酶識(shí)別底物序列以第三順位克隆到組氨酸標(biāo)簽His6之后；將大腸桿菌偏性密碼子組成的IFN a -2b基因以第四順位克隆在SUMO蛋白酶識(shí)別底物序列之后；在咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化，一步獲得90%純度的融合蛋白。利用高特異性和高活性SUMO蛋白酶對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行酶切，使標(biāo)簽部分與IFN a _2b目的蛋白解離，并利用金屬螯合介質(zhì)將標(biāo)簽部分與IFN a -2b目的蛋白分離。從而獲得純度達(dá)95%的天然結(jié)構(gòu)的目的蛋白；高度純化的目的蛋白質(zhì)在多種保護(hù)劑存在下，制備成具有藥用價(jià)值的藥物組合物。
[0016]本文中所使用術(shù)語(yǔ)“干擾素IFN a _2b”，是指能夠在體內(nèi)外發(fā)揮人干擾素功能的基因工程產(chǎn)品，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，為忠實(shí)于天然IFN a -2b氨基酸序列，合成基因時(shí)特意設(shè)計(jì)將天然IFN a -2b首位氨基酸Cys的密碼子TGC置于SUMO蛋白酶識(shí)別底物氨基酸序列Gly-Gly之后，所說的IFN a -2b是以不含Met為首位密碼子的基因工程重組IFN a -2b ο
[0017]文中所用的氨基酸符號(hào)為本領(lǐng)域通用的三字母縮寫符號(hào)，其中為了基因連接方便在基因合成時(shí)于融合蛋白N末端添加了 NcoI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，并利用NcoI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)中的ATG作為首位啟動(dòng)密碼子，翻譯表達(dá)融合蛋白首位氨基酸Met。同時(shí)在融合的蛋白基因的3'端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列GAATTC，以便使基因片段和載體連接時(shí)均形成粘性末端，利于基因連接。為使表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到高效表達(dá)，將大腸桿菌偏性密碼子引入到其中，以使表達(dá)產(chǎn)物適合在大腸桿菌中表達(dá)。
[0018]利用本發(fā)明方法制備的IFN a -2b與原工藝產(chǎn)物進(jìn)行了活性對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明專利制備的樣品活性顯著優(yōu)于原工藝產(chǎn)品。
[0019]本文中所使用術(shù)語(yǔ)“IU”是指利用中國(guó)生物制品規(guī)程所描述的干擾素活性檢定標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的活性單位數(shù)，即利用體外培養(yǎng)的人羊膜細(xì)胞(WISH)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)的破壞作用(參見中國(guó)藥典附錄，干擾素生物活性測(cè)定法)。
[0020]用于構(gòu)建本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的IFN a-2b分子可以是缺失了 N端Met的天然IFN a -2b分子,其氨基酸序列完全一致于Genbank報(bào)道的人IFN a -2b序列，同時(shí)其二硫鍵正確形成，其活性等同或高于人天然干擾素a _2b。其中所說的IFN a _2b是以單體分子形式存在的，也可以通過PEG修飾形成長(zhǎng)效干擾素。
[0021]由于暫時(shí)缺乏作為本發(fā)明融合IFN a -2b分子中轉(zhuǎn)硫酶A、His-Tag和SUMO酶切底物的現(xiàn)成序列，所以在本發(fā)明中使用通用的DNA合成儀在1000A固相載體上合成編碼這些融合蛋白的核苷酸序列。為了便于與特定重組載體進(jìn)行連接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶(如NcoI和EcoRI)酶切位點(diǎn)，并造成適于連接的粘性末端。可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)，克隆編碼這些合成的閱讀框架通暢的基因(或以其cDNA或基因組DNA形式)，DNA重組操作中，一般使用標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆和亞克隆技術(shù)進(jìn)行基因片段的轉(zhuǎn)移和連接。使用限制性酶切法鑒定序列連接方向的正確性和可能的突變，最后以DNA測(cè)序進(jìn)行序列確認(rèn)。
[0022]這里應(yīng)特別指出的是，由于相對(duì)于IFN a -2b分子來講，融合表達(dá)的轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO酶切底物部分分子量偏大，所以由三者產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)中很可能形成新的高級(jí)空間構(gòu)象，導(dǎo)致前導(dǎo)部分對(duì)IFN a -2b的卷曲形成影響，影響IFN a -2b的活性和空間構(gòu)像。然而通過技術(shù)人員計(jì)算機(jī)分析和園二色譜檢測(cè)證明IFN a _2b蛋白質(zhì)分子是以正確的二硫鍵形式進(jìn)行折疊的。
[0023]重組蛋白質(zhì)基因?qū)⒈豢刹倏v地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列上，如連接到適于在大腸桿菌中使用的T7、trp或λ啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)上。可使用已知的轉(zhuǎn)化方法，如適于原核細(xì)胞的氯化鈣處理法或適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的電穿孔法將本發(fā)明的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到選擇的宿主細(xì)胞中。可基于質(zhì)粒上所含抗生素抗性基因所賦予的抗生素抗性來選擇被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性細(xì)胞。一旦表達(dá)了所需的融合蛋白質(zhì)，即可按照本領(lǐng)域已知的方法分離并純化該融合蛋白質(zhì)。例如，可從發(fā)酵培養(yǎng)物中離心收集菌體細(xì)胞并用溶菌酶和超聲波裂解之，然后超速離心并在低濃度磷酸鹽(約20mM)溶液中加入飽和硫酸銨進(jìn)行分步沉淀。依次經(jīng)離子交換層析(IEC)和IMAC層析純化所需的IFN a -2b重組蛋白質(zhì)。。
[0024]一般說來，使用聚丙烯酰胺凝膠以SDS-PAGE電泳法分析各柱層析洗脫部分，并以免疫印跡法監(jiān)測(cè)之。對(duì)重組融合蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞病毒抑制試驗(yàn)以檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(具體操作見中國(guó)生物制品規(guī)程2010版)。
[0025]可將本發(fā)明的IFN a-2b蛋白質(zhì)作為基本活性成分，并加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床應(yīng)用的藥物組合物。所說的載體或賦形劑包括但不只限于磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據(jù)所治療的疾病的不同，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入一種或多種與本發(fā)明的蛋白質(zhì)有輔助或協(xié)同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物。另外，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽(yáng)離子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑，以及聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑。
[0026]可以通過常規(guī)給藥途徑，特別是胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物，例如通過靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或粘膜內(nèi)途徑給藥。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾毫微克至幾十毫克/公斤體重/天，但針對(duì)每個(gè)特定病人的具體用藥劑量將根據(jù)待治療疾病或病理狀態(tài)的性質(zhì)及嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重、對(duì)藥物的反應(yīng)能力及給藥方式等因素而定。
[0027]本發(fā)明提供了基因工程IFN a -2b融合蛋白質(zhì)新型制備工藝，為解決無法去除錯(cuò)配異構(gòu)體的現(xiàn)狀，采用融合表達(dá)載體，將促進(jìn)干擾素a -2b 二硫鍵正確折疊的蛋白質(zhì)及高效蛋白酶底物片段與干擾素a-2b基因融合表達(dá)，形成可溶性天然結(jié)構(gòu)表達(dá)形式；目的蛋白以可溶性天然結(jié)構(gòu)形式表達(dá)，活性高，無需復(fù)性處理，避免蛋白質(zhì)異構(gòu)體產(chǎn)生；蛋白質(zhì)純化工藝簡(jiǎn)潔，僅需一步金屬螯合親和層析產(chǎn)品純度即可達(dá)到90%以上，去除融合蛋白片段，再利用該親和層析獲得純度95%以上的終產(chǎn)品，產(chǎn)量高，活性明顯提升，成本低；達(dá)全菌體蛋白的30%以上；獲得了干擾素a _2b天然結(jié)構(gòu)的表達(dá)產(chǎn)物，產(chǎn)品活性優(yōu)于現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)和國(guó)際產(chǎn)品。
[0028]應(yīng)特別指出的是，盡管更深入的作用機(jī)理尚不明確，但我們的實(shí)驗(yàn)室已證明本發(fā)明的IFN a -2b蛋白質(zhì)對(duì)包括結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、卵巢癌0VCAR3細(xì)胞、子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞及肝癌H印G-2細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系均有明顯的抑制作用，同時(shí)證明本發(fā)明的IFN a -2b蛋白質(zhì)對(duì)包括水泡性口炎病毒等具有顯著的抑制作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1顯示用于表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。
【具體實(shí)施方式】 [0030]以下借助實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍的限制。
[0031]實(shí)施例1:1FN a -2b蛋白質(zhì)的制備 A.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
a.基因合成:本發(fā)明中參考已經(jīng)公開認(rèn)知的轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO酶識(shí)別底物序列，人工體外合成如下序列:
NdeI內(nèi)切酶識(shí)別序列(CATATG) +轉(zhuǎn)硫酶A+HIS6+NcoI識(shí)別序列(CCATGG) +SUMO酶識(shí)別底物序列+EcoRI內(nèi)切酶識(shí)別序列(GAATTC)，基因序列見SEQ ID NO: 1，本合成序列直接克隆入大連Takara公司提供的T載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)菌，經(jīng)PCR鑒定確定陽(yáng)性克隆株，陽(yáng)性克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)，常規(guī)分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒DNA，利用Nde1、EcoRI雙酶切本質(zhì)粒和PETlla質(zhì)粒，回收目的片段和PETlla質(zhì)粒載體粘性末端片段，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下將目的片段插入到同樣酶切的PETlla質(zhì)粒載體中，構(gòu)建融合蛋白前部雙鏈表達(dá)基因。
[0032]b.然后人工合成NcoI識(shí)別序列(CCATGG) +SUMO酶識(shí)別底物序列+IFN a -2b+EcoRI內(nèi)切酶識(shí)別序列(GAATTC)序列，基因序列見SEQ ID NO: 2,使IFN a -2b的N端第一個(gè)氨基酸密碼子與SUMO酶識(shí)別底物序列C端的密碼子GGAGGC直接相連，合成的雙鏈基因直接克隆入大連Takara公司提供的T載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)菌，經(jīng)PCR鑒定確定陽(yáng)性克隆株，陽(yáng)性克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)，常規(guī)分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒DNA，利用Ncol、EcoRI雙酶切本質(zhì)粒和步驟I所構(gòu)建的PETlla-TrxA-HIS6-SUM0質(zhì)粒，回收目的片段和PETlla-TrxA-HIS6-SUM0質(zhì)粒載體粘性末端片段，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下將目的片段插入到同樣酶切的載體質(zhì)粒中，構(gòu)建融合蛋白全序列雙鏈表達(dá)基因。構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM105細(xì)胞，并將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)于含氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB 培養(yǎng)基中，以擴(kuò)增質(zhì)粒DNA。培養(yǎng)完成后，破碎細(xì)胞，離心收集質(zhì)粒并純化質(zhì)粒DNA測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒將被轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，用酶切鑒定法和瓊脂糖凝膠(2%)電泳法進(jìn)行鑒定，然后陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析。SEQ ID N0:3顯示了所測(cè)得的融合蛋白重組基因的核苷酸序列。圖1顯示了重組質(zhì)粒pETlIa-TRXA-SUMO-1FN a -2b的構(gòu)建。
[0033]B.TRXA-SUMO-1FNa-2b融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及產(chǎn)物的純化:
將攜帶重組基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)(含有T7 RNA聚合酶基因)培養(yǎng)在含有氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB瓊脂平皿上。培養(yǎng)后挑選氨芐青霉素抗性菌落，于含氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，當(dāng)A_達(dá)到約0.4~0.6時(shí)加入ImM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度lmM)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，以誘導(dǎo)目的產(chǎn)物的表達(dá)。然后離心分離細(xì)胞和培養(yǎng)基，并將含有目的蛋白質(zhì)的菌體中加入緩沖液成分，終濃度達(dá)50mMTris-HCl, pH8.0, ImM EDTA,超聲破碎，4°C離心(20，OOOg，30分鐘)，取上清(可溶性部分)即為融合蛋白粗提物。
[0034]粗提物經(jīng)過緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia),用含有(T0.5M NaCl 的 TE 緩沖液(20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA)連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分。目的組分峰部分經(jīng)小型中空纖維超濾器(Milipore)作用30分鐘超濾濃縮換液后，使?jié)饪s物通過用20mM Tris-HCl, pH8.0,，0.15M NaCl緩沖液平衡過的
1.6X IOOcm IMAC柱(Pharmacia)，并用含有 0.15M NaCl 的緩沖液(20mM Tris-HCl, pH8.0,200mM咪唑)洗脫。收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，30°C，4hr，并再次過IMAC液相色譜柱，收集蛋白質(zhì)峰值(A28tl)部分并在30mM PBS中徹底透析，透析后于_20°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ绱思兓牡鞍踪|(zhì)純度>97%。
[0035]實(shí)施例2:利用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定新工藝制備的IFNa -2b對(duì)人羊膜細(xì)胞(WISH)免受水皰性口炎病毒破壞作用，(具體操作見中國(guó)藥典2005版第三部附錄XC)。
[0036]細(xì)胞病變抑制試驗(yàn):
將培養(yǎng)的人羊膜細(xì)胞單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，吹打收集細(xì)胞懸液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板記數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為60000個(gè)/ml，按照80 μ I/孔加入到96孔培養(yǎng)板中(每孔5000細(xì)胞)，5% 0)2，371:條件下培養(yǎng)411。調(diào)整購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定院的IFN a-2b標(biāo)準(zhǔn)品和新工藝制備的IFNa -2b蛋白質(zhì)樣品濃度為lmg/ml，定量的樣品經(jīng)過濾除菌，按等倍稀釋法將不同量的樣品加入各細(xì)胞孔中，然后補(bǔ)足培養(yǎng)基，使之總體積為100 μ 1， 5% CO2,37°C條件下培養(yǎng)24h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，將_70°C保存的水泡性口炎病毒(VSV)用攻毒培養(yǎng)液稀釋至100CCID50，每孔100μ 1，于5% C02，37°C條件下培養(yǎng)24h，然后棄去細(xì)胞板中上清液,每孔加入50 μ I染色液,室溫放置30min后，用流水沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100 μ 1，室溫放置5min，混勻后，用酶標(biāo)儀以630nm為參比波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果。
[0037]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行參數(shù)回歸計(jì)算:
供試品生物活性(IU/mg) =Pr X(Ds X Es) / (Dr X Er)
公式中:Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物活性，IU/mg ；
Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Es為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；
Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效量稀釋倍數(shù)。
【權(quán)利要求】
1.基因工程IFNa-2b融合蛋白質(zhì)基因，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
2.用于制備基因工程IFNa-2b融合蛋白質(zhì)的基因，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
3.用于制備基因工程IFNa-2b融合蛋白質(zhì)的基因，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
4.一種表達(dá)載體，它是攜帶T7強(qiáng)啟動(dòng)子且含有多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體，并將其堿基序列如序列表SEQ ID N0.3所示的基因，克隆到該表達(dá)載體的T7啟動(dòng)子之后。
5.權(quán)利要求4所述的一種表達(dá)載體,其特征在于:所述的多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體為PETlla0
6.基因工程IFNa-2b融合蛋白質(zhì)新型制備方法，步驟如下: O人工合成堿基序列如序列表SEQ ID N0.1和2所示的基因； 2)用Ndel、EcoRI雙酶切堿基序列如序列表SEQID N0.1所示的基因和PETlla，T4連接酶連接，構(gòu)建的mmTrxA-HIS6-SUM0質(zhì)粒； 3)利用Ncol、EcoRI雙酶切如序列表SEQID N0.2所示的基因和步驟2)所構(gòu)建的PETlIa-TrxA-HIS6-SUM0 質(zhì)粒；T4 連接酶連接，構(gòu)建的 pETlla_7E?-5Z繼9-1FNa -2b 質(zhì)粒；4MfpETlla-7E?-5Z#(9- TTWff質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)，純化； 5)用SUMO酶切步驟4)純化的融合蛋白；酶切融合蛋白去除融合蛋白分子中轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO酶切底物部分，再純化。
7.權(quán)利要求6所述的基因工程IFNa _2b融合蛋白質(zhì)新型制備方法，其特征在于:步驟4)得到的純化蛋白經(jīng)過緩沖液平衡的DEAE-S印harose Fast Flow柱，用含有0-θ.5M NaCl的TE緩沖液連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分；目的組分峰部分經(jīng)小型中空纖維超濾器作用30分鐘超濾濃縮換液后，使?jié)饪s物通過用20mM Tris-HCl, pH8.0,0.15M NaCl緩沖液平衡過的1.6X 100cm IMAC柱，并用含有0.15M NaCl的緩沖液洗脫；收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，并再次過IMAC液相色譜柱，收集蛋白質(zhì)峰值部分，并在30mM PBS中徹底透析，透析后于_20°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>
8.權(quán)利要求7所述的基因工程IFNa _2b融合蛋白質(zhì)新型制備方法，其特征在于:所述的 0.15M NaCl 的緩沖液為 20mM Tris-HCl, ρΗ8.0,200mM 咪唑。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103805622SQ201410082516
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月21日
【發(fā)明者】張國(guó)利, 張培培, 李澤鴻, 史飛, 田園, 劉雨玲 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所