一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含用于檢測APOE基因rs7259620單核苷酸多態(tài)性的APOE基因引物和用于檢測APOA5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性的APOA5基因引物；其通過將檢測試劑盒的APOE基因引物和APOA5基因?qū)悠稤NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光定量PCR儀分析熔解曲線，再將熔解曲線與標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線進(jìn)行比較，對比PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值，獲得相應(yīng)的基因分型結(jié)果。本檢測試劑盒可以預(yù)測受試者的冠心病，檢測方法簡單，檢測效率高，針對性強(qiáng)，從而能夠促進(jìn)冠心病的早期預(yù)防和為用藥治療提供參考。
【專利說明】一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及冠心病的輔助診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冠心病亦稱為缺血性心臟病(coronary heart disease, CHD),涉及供應(yīng)心肌血液的動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化，即冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔狹窄或斑塊形成甚至破裂、完全堵塞，限制或完全中斷了心肌的血液供應(yīng)，引起臨床上心絞痛、心肌梗死等一系列嚴(yán)重的心肌缺血病癥。冠心病是現(xiàn)今威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，人類健康的主要?dú)⑹?。隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，世界范圍的疾病譜發(fā)生了明顯的變化，心血管疾病逐漸成為了主要疾病。在2008年大概有1730萬人死于心血管病，占全球死亡人數(shù)的30%。其中，死于冠心病的約有730萬，占了總數(shù)的近42%。有流行病學(xué)研究顯示，到2020年，每年將有2500萬人死于心血管疾病，且心血管疾病預(yù)計(jì)將超過傳染性疾病成為全球死亡和殘疾的主要原因。雖然據(jù)世界衛(wèi)生組織MONICA資料統(tǒng)計(jì)，我國發(fā)病率較西方國家低，但我國冠心病發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。冠心病的發(fā)生是許多因素參與的復(fù)雜過程，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。眾所周知，冠心病的發(fā)病與吸煙，飲酒，肥胖，高血壓，糖尿病，血脂異常等有關(guān)。但遺傳因素起了獨(dú)特的作用，特別是家族遺傳因素是冠心病的一個(gè)重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。基因檢測可對冠心病防治做出巨大貢獻(xiàn)，發(fā)展疾病診斷和治療新手段，具有很大前景。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，血脂異常與冠心病的發(fā)生有很大的關(guān)系，據(jù)統(tǒng)計(jì)冠心病患者血清中低密度脂蛋白(LDL-C)，甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)明顯高于非冠心病患者，而高密度脂蛋白(HDL-C)明顯低于非冠心病患者。而且國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)SNPrs7259620和rs662799與TC, TG, LDL-C, HDL-C等存在相關(guān)性。而血脂異常還與其他很多疾病有關(guān)，如代謝綜合征，腦卒中，中風(fēng)，腎衰，阿爾茲海默癥等。故我們可能可以通過檢測SNPrs7259620和rs662799與其他相關(guān)疾病的相關(guān)性，輔助判斷，做到提早預(yù)防及用藥參考等。
[0004]單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化，是第三代分子標(biāo)記。據(jù)估計(jì)，大約有10億個(gè)SNP分子標(biāo)記將被用于基因功能及與疾病的相關(guān)性的關(guān)聯(lián)研究。國內(nèi)外已經(jīng)有部分有關(guān)于rs7259620和rs662799與冠心病相關(guān)性的研究。APOE即載脂蛋白E，具有多態(tài)性，多態(tài)性決定個(gè)體血脂水平與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是動(dòng)脈粥樣硬化早期及發(fā)展過程中個(gè)體差異的主要原因，增加冠心病風(fēng)險(xiǎn)。對于rs662799，國外研究發(fā)現(xiàn)AP0A5啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性為冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與其發(fā)生存 在強(qiáng)相關(guān)性。但目前，國內(nèi)外還沒有公開任何用于檢測APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性(SNP)與冠心病相關(guān)程度的試劑盒的相關(guān)研究報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供檢測方便、檢測準(zhǔn)確率高的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒；通過基因引物對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并建立熔解曲線與標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線相比較得出結(jié)論，其檢測方法簡單、高效。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:
一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含用于檢測APOE基因rs7259620單核苷酸多態(tài)性的APOE基因引物和用于檢測AP0A5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性的AP0A5基因引物；
所述的APOE基因引物為包括以下序列的核苷酸片段:
APOE 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向測序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’ ；
所述的AP0A5基因引物為包括以下序列的核苷酸片段:
AP0A5 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向測序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0007]為優(yōu)化上述技術(shù)方案，采取的具體措施還包括:
所述的APOE基因引物為:
APOE 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向測序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’。
[0008]所述的AP0A5基因引物為:
AP0A5 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向測序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0009]一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:包括以下步驟:
步驟一:對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增建立標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線；
步驟二:用檢測試劑盒的APOE基因引物和AP0A5基因?qū)悠稤NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟三:將步驟二中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光定量PCR儀分析熔解曲線，并與步驟一中建立的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線進(jìn)行比較，對比PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值，獲得相應(yīng)的基因分型結(jié)果。
[0010]所述的步驟二中的APOE基因引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C初始變性階段30s ;接著循環(huán)進(jìn)行95°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0011]所述的步驟三中APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的分析方法為:將APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于熒光定量PCR儀中，95°C變性15s，60°C復(fù)性30s，再以0.1re /s的速度上升到95°C，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)，40°C維持；根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析獲得熔解曲線數(shù)據(jù)。
[0012]所述的步驟三中APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線中，熔解溫度77±0.5°C的為AA型，熔解溫度82±0.5°C的為GG型，熔解溫度77±0.5°C和82±0.5°C的為AG型。
[0013]所述的步驟二中的AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?95°C初始變性階段30s ;接著循環(huán)進(jìn)行95°C變性30s，59°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。[0014]所述的步驟三中AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的分析方法為:將AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于熒光定量PCR儀中，95°C變性15s，60°C復(fù)性30s，再以0.1re /s的速度上升到95°C，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)，40°C維持；根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析獲得熔解曲線數(shù)據(jù)。
[0015]所述的步驟三中AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線中，熔解溫度81±0.5°C的為AA型，熔解溫度86±0.5°C的為GG型，熔解溫度81 ±0.5°C和86±0.5°C的為AG型。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含用于檢測APOE基因rs7259620單核苷酸多態(tài)性的APOE基因引物和用于檢測AP0A5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性的AP0A5基因引物，由于APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性(SNP)與冠心病具有強(qiáng)相關(guān)性；
因此通過檢測APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799位點(diǎn)G等位基因，可以預(yù)測受試者的冠心病，檢測效率高，針對性強(qiáng)，從而能夠促進(jìn)冠心病的早期預(yù)防和為用藥治療提供參考。
[0017]本檢測方法米用SYBR Green I 的 Melting Temperature shift (Tm_shift)法來檢測病例組和對照組基因型。Tm-shift是一種新的基因分型方法，主要通過在兩條特異性引物5'端加入不同長度的GC序列，PCR擴(kuò)增后根據(jù)熔解曲線中產(chǎn)物Tm值的差異來完成分型。SYBR Green I是一種在Real-time PCR中使用廣泛且成熟的雙鏈DNA(dsDNA)染料。其非特異性地嵌合于雙鏈DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝內(nèi)，一般不與單鏈DNA結(jié)合，結(jié)合狀態(tài)的熒光強(qiáng)度較之游離狀態(tài)的熒光增加數(shù)千倍。在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光信號(hào)。熒光強(qiáng)度隨溫度變化，當(dāng)兩條DNA分子復(fù)性結(jié)合時(shí)熒光最強(qiáng)，隨溫度上升熒光強(qiáng)度降低并出現(xiàn)一較恒定的坡度。當(dāng)DNA片段在加熱過程中達(dá)到熔解溫度，即達(dá)到Tm值時(shí)，雙鏈分開，SYBRGreen I從DNA上釋放出來，導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱。經(jīng)過軟件分析可得到熔解曲線圖，其波峰所在的溫度代表雙鏈DNA分子的Tm值。Tm值的大小取決于DNA分子的長度及其序列中G/C含量。熔解曲線完成后，根據(jù)特異性引物的設(shè)計(jì)，即可獲得相應(yīng)的基因分型結(jié)果。判讀分型結(jié)果時(shí)，將HH純合子與LL純合子峰值最小差距3°C作為分型判斷的依據(jù)。為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，選取基因型已知的3種不同基因型的樣本，在每一塊96孔板中放入標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，以區(qū)分3種基因型的熔解峰。
[0018]Tm-shift法方法簡單易行，耗時(shí)僅2小時(shí)左右，每次可同時(shí)檢測96個(gè)標(biāo)本，操作簡便，是一種既能滿足中低通量研究需要又能高性價(jià)比完成基因分型的方法。由于實(shí)驗(yàn)全程閉管操作，避免了 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，減少了假陽性結(jié)果，準(zhǔn)確性高。某一型的引物只與相同型的模板結(jié)合才發(fā)生PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而保證了檢測的特異性。
[0019]Tm-shift法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，成本低廉，是在擴(kuò)增結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析的終點(diǎn)分析方法，無需一直進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為APOE基因rs7259620 Tm-shift法檢測基因型的熔解溫度曲線；
圖2為AP0A5基因rs662799 Tm-shift法檢測基因型的熔解溫度曲線。
【具體實(shí)施方式】[0021]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0022]一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含用于檢測APOE基因rs7259620單核苷酸多態(tài)性的APOE基因引物和用于檢測AP0A5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性的AP0A5基因引物；
所述的APOE基因引物為包括以下序列的核苷酸片段:
APOE 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向測序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’ ；
所述的AP0A5基因引物為包括以下序列的核苷酸片段:
AP0A5 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向測序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0023]所述的APOE基因引物為:
APOE 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向測序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’。
[0024]所述的AP0A5基因引物為:
AP0A5 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向測序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0025]一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:包括以下步驟:
步驟一:對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增建立標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線；
步驟二:用檢測試劑盒的APOE基因引物和AP0A5基因?qū)悠稤NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟三:將步驟二中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光定量PCR儀分析熔解曲線，并與步驟一中建立的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線進(jìn)行比較，對比PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值，獲得相應(yīng)的基因分型結(jié)果。
[0026]所述的步驟二中的APOE基因引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C初始變性階段30s ;接著循環(huán)進(jìn)行95°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0027]所述的步驟三中APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的分析方法為:將APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于熒光定量PCR儀中，95°C變性15s，60°C復(fù)性30s，再以0.1re /s的速度上升到95°C，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)，40°C維持；根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析獲得熔解曲線數(shù)據(jù)。
[0028]所述的步驟三中APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線中，熔解溫度77±0.5°C的為AA型，熔解溫度82±0.5°C的為GG型，熔解溫度77±0.5°C和82±0.5°C的為AG型。
[0029]所述的步驟二中的AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?95°C初始變性階段30s ;接著循環(huán)進(jìn)行95°C變性30s，59°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0030]所述的步驟三中AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的分析方法為:將AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于熒光定量PCR儀中，95°C變性15s，60°C復(fù)性30s，再以
0.1re /s的速度上升到95°C，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)，40°C維持；根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析獲得熔解曲線數(shù)據(jù)。
[0031]所述的步驟三中AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線中，熔解溫度81±0.5°C的為AA型，熔解溫度86±0.5°C的為GG型，熔解溫度81 ±0.5°C和86±0.5°C的為AG型。
[0032]APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性(SNP)與冠心病具有強(qiáng)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)證明:
研究對象的收集:從寧波李惠利醫(yī)院、寧波鄞州人民醫(yī)院、浙江杭州第二醫(yī)院住院病人中收集冠心病患者，共1521例，其中783名男性，738名女性，平均年齡在62歲上下；同時(shí)在這些住院病人中收集每條冠狀動(dòng)脈血管狹窄小于50%的病人作為對照組，共738例，其中421名男性，327名女性，平均年齡在58歲上下。所有的參與者都沒有心肌梗塞、先天性心臟疾病、肝臟或者腎臟疾病。
[0033]1.血清DNA的提取 應(yīng)用Lab-Aid 820全自動(dòng)核酸提取儀(中國廈門致善生物科技有限公司，500ul體系)提取樣本的全血基因組DNA，再通過核酸蛋白測定儀檢測所得DNA的濃度。
[0034]2.引物設(shè)計(jì):根據(jù)NCBI dbSNP網(wǎng)站下載的目標(biāo)SNP rs7259620、rsl800686及rs662799附近序列，設(shè)計(jì)特異性引物，并在特異性上游引物5'端分別加入富含GC的序
列-14 bp 的長序列(5' - GCGGGCAGGGCGGC-3')和 6bp 的短序列(5' - GCGGGC-3')，
并且在3'末端加入到堿基與SNP的等位基因變異體配對，人為地?cái)U(kuò)大了 PCR產(chǎn)物Tm值的差距，使產(chǎn)物的Tm值更易區(qū)分。
[0035]APOE基因rs7259620引物序列如下:
Tm-shift APOE基因特異性上游引物一，如SEQ ID N0.1，用于檢測g等位基因:
5’ - gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg -3’ ；
Tm-shift APOE基因特異性上游引物二，如SEQ ID N0.2，用于檢測a等位基因:
5’ - gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa -3’ ；
Tm-shift APOE基因反向測序引物，如SEQ ID N0.3:
5， - AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA -3，。
[0036]AP0A5基因rs662799引物序列如下:
Tm-shift AP0A5基因特異性上游引物一，如SEQ ID N0.7，用于檢測g等位基因:
5’ - gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg -3’ ；
Tm-shift AP0A5基因特異性上游引物二，如SEQ ID N0.8，用于檢測a等位基因:
5’ - gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa -3’ ；
Tm-shift AP0A5基因反向測序引物，如SEQ ID N0.9:
5， - CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT -3，。
[0037]3.PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析
(I)建立APOE基因rs7259620 PCR反應(yīng)體系:總反應(yīng)體系為12 μ L，兩條特異性上游引物和一條反向引物各0.25 μ L (體系中引物含量分別為0.lymol/L)，2yL的基因組DNA(20ng), LightCycler? 480 SYBR Green I Master (包含 FastStart Taq DNA 聚合酶，反應(yīng)緩沖液，dNTP混合物，SYBR Green I染料，MgCl2) 6 μ L，加高純水補(bǔ)足至12 μ L。
[0038]建立ΑΡ0Α5基因rs662799 PCR反應(yīng)體系:總反應(yīng)體系為12 μ L，兩條特異性上游引物和一條反向引物各0.25 μ L (體系中引物含量分別為0.lymol/L)，2yL的基因組DNA(20ng), LightCycler? 480 SYBR Green I Master (包含 FastStart Taq DNA 聚合酶，反應(yīng)緩沖液，dNTP混合物，SYBR Green I染料，MgCl2) 6 μ L，加高純水補(bǔ)足至12 μ L。
[0039](2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，APOE基因rs7259620擴(kuò)增程序:95°C初始變性階段30s ;接著95°C變性30s，56。。復(fù)性30s，72。。延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0040]AP0A5基因rs662799擴(kuò)增程序:95°C初始變性階段30s ;接著95°C變性30s，59°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0041](3)熔解曲線分析:將PCR產(chǎn)物放入Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀中。APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799熔解曲線程序:95°C變性15s，60°C復(fù)性30s，再以0.1l0C /s的速度上升到95°C，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)，40°C維持。熔解曲線數(shù)據(jù)由Roche提供的機(jī)載軟件自動(dòng)根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析獲得。熔解曲線完成后，對比Tm值，即可獲得相應(yīng)的基因分型結(jié)果。為了確保分型的準(zhǔn)確性，我們在每一塊96孔板中放入標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，以區(qū)分3種基因型的熔解峰。在我們的實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)品對照的重復(fù)性達(dá)到了 100%。
[0042]4.數(shù)據(jù)分析
本次研究采用Arlequin軟件(v3.5), CLUMP22軟件，在線軟件(http://faculty,vassar.edu/lowry/odds2x2.html), R軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。
[0043]為驗(yàn)證上述方法的準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取80個(gè)樣本進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果顯示，上述Tm-shift檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。
[0044]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.基因分型結(jié)果:
本發(fā)明根據(jù)Tm值判斷基因型，
APOE 基因 rs7259620:LL 純合子，即 AA:Tm 為 77±0.5 °C ；HH 純合子，即 GG:Tm 為82±0.50C ;LH 雜合子即 AG，Tm 為 77±0.5°C和 82±0.5°C。
[0045]應(yīng)用Tm-shift法檢測基因型，1521例患者中，GG占了 49.90%(759/1521) ；AG占7 41.42% (630/1521) ；AA 占了 8.68% (132/1521)。
[0046]AP0A5 基因 rs662799:LL 純合子，即 AA:Tm 為 81 ±0.5°C ；HH 純合子，即 GG:Tm 為86±0.50C ;LH 雜合子即 AG，Tm 為 81 ±0.5°C和 86±0.5°C。
[0047]應(yīng)用Tm-shift法檢測基因型，1521例患者中，GG占了 9.20%(140/1521) ；AG占了39.71% (604/1521) ；AA 占了 51.08% (777/1521)。
[0048]2.APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799與冠心病的相關(guān)性(P < 0.05即
存在相關(guān)性)
APOE基因rs7259620與冠心病的相關(guān)性(P < 0.05即存在相關(guān)性)
通過對比患者和對照組，我們發(fā)現(xiàn):如表1所示，病例組的APOE基因rs7259620的危險(xiǎn)基因G基因明顯高于對照組，且其遺傳方式為顯性遺傳。
[0049]表1 rs7259620基因型和等位基因分布結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，其特征是:所述的檢測試劑盒包含用于檢測APOE基因rs7259620單核苷酸多態(tài)性的APOE基因引物和用于檢測AP0A5基因rs662799單核苷酸多態(tài)性的AP0A5基因引物； 所述的APOE基因引物為包括以下序列的核苷酸片段: APOE 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ； APOE 基因反向測序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’ ； 所述的AP0A5基因引物為包括以下序列的核苷酸片段: AP0A5 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ； AP0A5 基因反向測序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，其特征是:所述的APOE基因引物為: APOE 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ； APOE 基因反向測序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，其特征是:所述的AP0A5基因引物為: AP0A5 基因特異性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特異性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ； AP0A5 基因反向測序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:包括以下步驟: 步驟一:對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增建立標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線； 步驟二:用檢測試劑盒的APOE基因引物和AP0A5基因?qū)悠稤NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟三:將步驟二中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光定量PCR儀分析熔解曲線，并與步驟一中建立的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線進(jìn)行比較，對比PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值，獲得相應(yīng)的基因分型結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:所述的步驟二中的APOE基因引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C初始變性階段30s ;接著循環(huán)進(jìn)行95°C變性30s，56。。復(fù)性30s，72。。延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:所述的步驟三中APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的分析方法為:將APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于熒光定量PCR儀中，95°C變性15s，60°C復(fù)性30s，再以0.11°C /s的速度上升到95°C，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)，40°C維持；根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析獲得熔解曲線數(shù)據(jù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:所述的步驟三中APOE基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線中，熔解溫度77±0.5°C的為AA型，熔解溫度82±0.5°C的為GG型，熔解溫度77±0.5°C和82±0.5°C的為AG型。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:所述的步驟二中的AP0A5基因引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?95°C初始變性階段30s ;接著循環(huán)進(jìn)行95°C變性30s，59°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:所述的步驟三中APOA5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的分析方法為:將APOA5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于熒光定量PCR儀中，95°C變性15s，60°C復(fù)性30s，再以0.11°C /s的速度上升到95°C，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)，40°C維持；根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行聚類分析獲得熔解曲線數(shù)據(jù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:所述的步驟三中APOA5基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線中，熔解溫度81±0.5°C的為AA型，熔解溫度 86±0.5°C的為GG型，熔解溫度81 ±0.5°C和86±0.5°C的為AG型。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898233SQ201410159391
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】葉華丹, 段世偉, 周安楠, 洪青曉, 李奕潤 申請人:寧波大學(xué)