一種用于擴(kuò)增鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的背對背引物對及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于擴(kuò)增鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的背對背引物對。本發(fā)明還公開了一種鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的擴(kuò)增方法。本發(fā)明還公開了一種鴿細(xì)環(huán)病毒的檢測試劑盒。本發(fā)明還公開了一種鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的全基因組序列，所述全基因組序列具有兩個(gè)主要的ORF，編碼Rep復(fù)制蛋白的ORF1和編碼Cap外殼蛋白的ORF2，ORF1對應(yīng)第464–923位核苷酸序列，編碼154個(gè)氨基酸，ORF2對應(yīng)第788–1189位核苷酸序列，編碼134個(gè)氨基酸，第1457–1462位核苷酸序列對應(yīng)polyA序列區(qū)。
【專利說明】—種用于擴(kuò)增鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的背對背引物對及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于擴(kuò)增鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的背對背引物對及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)環(huán)病毒(Torque teno virus, TTV)是繼甲、乙、丙、丁、戍及庚型肝炎病毒之后又發(fā)現(xiàn)的一種新型肝炎相關(guān)病毒，最初是由日本學(xué)者于1997年運(yùn)用代表性差異分析(representational difference analysis, RDA)技術(shù)從輸血后非甲至非戍型肝炎病人血漿中分離鑒定出的一種新病毒，并把該病毒以患者名字命名為TTV，又稱輸血傳播病毒。該病毒在人群中感染率較高，據(jù)各國對不同人群TTV感染的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人群中TTV陽性率一般在10%以上。TTV宿主范圍很廣，除人類、非人靈長類和和野生動物外，豬、牛、羊、貓、狗、家禽等多種動物體內(nèi)也相繼發(fā)現(xiàn)TTV感染，且該病毒具有種屬特異性。由于TTV廣泛存在于健康/非健康人或動物體內(nèi)，其具體的感染機(jī)制和生物學(xué)意義尚不清楚。
[0003]根據(jù)物種不同所報(bào)道的TTV基因組長度也不同。感染人和猿的TTV基因組長度在3.7kb - 3.9kb之間，感染豬和狗的TTV基因組長度分別為2.8kb和2.9kb左右，而在貓?bào)w內(nèi)獲得的TTV基因組長度約為2.lkb。TTV基因組分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)(UTR)兩個(gè)部分，其中UTR特定區(qū)域內(nèi)核苷酸序列較為保守。對于TTV編碼區(qū)組成的報(bào)道不盡相同，有人認(rèn)為TTV含有4個(gè)開放閱讀框(open reading frame, 0RF)，也有人認(rèn)為其含有6個(gè)0RF，但是目前研究較多的是已經(jīng)確定的2個(gè)0RF，即ORFl和0RF2，并認(rèn)為ORFl可能編碼病毒的衣殼蛋白(R印)，0RF2可能編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)。
[0004]TTV為單股環(huán)狀DNA病毒。盡管不同物種TTV基因組長度不同，并且其DNA呈現(xiàn)出高度變異的特點(diǎn)，但是物種間TTV卻具有一些相似的基因結(jié)構(gòu)，即:翻譯開始于ssDNA，UTR擁有GC含量在90%左右的GC富集區(qū)，ORFl和0RF2均具有一小部分的重疊。TTV的4個(gè)ORF位于互補(bǔ)的正鏈上，該病毒可以通過mRNA的剪輯作用產(chǎn)生其他的轉(zhuǎn)錄本。研究認(rèn)為，TTV的ORFl編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep蛋白)，0RF2編碼最大的核衣殼蛋白(Cap蛋白)。不同物種ORFl編碼的蛋白長度不等，但均存在被稱作是Rep結(jié)構(gòu)域的滾環(huán)復(fù)制結(jié)構(gòu)域，并具有與CAV的VPl蛋白相似的N端精氨酸富集區(qū)。0RF2的編碼蛋白與CAV編碼蛋白具有類似的一個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域，并認(rèn)為該結(jié)構(gòu)域可能與病毒感染細(xì)胞期間病毒或細(xì)胞蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，研究認(rèn)為，Cap蛋白可能會參與機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答，這對TTV致病機(jī)理的研究有重要意義。
[0005]到目前為止，TTV對宿主的致病性尚不清楚，但有數(shù)據(jù)顯示其和其他病毒共感染會引起一些疾病。2006年kekarainen等研究人員發(fā)現(xiàn)TTV和PCV2混合感染能導(dǎo)致仔豬斷奶后多系統(tǒng)呼吸綜合征(PMWS)的 發(fā)生。2008年另有報(bào)道TTV能促進(jìn)PRRS的爆發(fā)。2009年Tuijak等對商業(yè)化疫苗、藥品及實(shí)驗(yàn)室常用酶進(jìn)行豬TTV的檢測，結(jié)果在豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒和豬肺炎支原體疫苗等中都檢測到TTV的存在。[0006]TTV感染呈全球性分布，在人群以及家畜、家禽等動物中感染率較高。目前鴿養(yǎng)殖現(xiàn)已成為畜牧業(yè)中相對獨(dú)立的新興產(chǎn)業(yè)，世界食品消費(fèi)市場把肉鴿列為優(yōu)質(zhì)肉食。國內(nèi)市場對乳鴿需求量日益增大，發(fā)展鴿養(yǎng)殖潛力巨大，市場前景十分廣闊。在我國鴿群細(xì)環(huán)病毒明顯高感染率的背景下，盡快了解鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列與其他病毒株的同源性、基因結(jié)構(gòu)和功能以及各分離株之間的遺傳變異和進(jìn)化的關(guān)系，對我國鴿市場的穩(wěn)定發(fā)展具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和市場價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種用于擴(kuò)增鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的背對背引物對。
[0008]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是一種鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的擴(kuò)增方法。
[0009]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種鴿細(xì)環(huán)病毒的檢測試劑盒。
[0010]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種用于擴(kuò)增鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的背對背引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0011]一種鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的擴(kuò)增方法，包括以下步驟:
[0012]1)引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank已發(fā)表的人TTV基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物；
[0013]2)鴻細(xì)環(huán)病毒的PCR檢測:鴻細(xì)環(huán)病毒基因組DNA提取,將病毒基因組DNA進(jìn)行PCR檢測獲得陽性DNA樣品；
[0014]3)以上述的陽性DNA樣品為模板，將所述的背對背引物對擴(kuò)增PTTV全基因組序列得到 PCR 產(chǎn)物:PCR 反應(yīng)體系為:LA Taql μ L，10XLA PCR Buffer 15 μ L, dNTPMixture8 μ L，模版DNA4 μ L，上游引物Pl和下游引物P2各I μ L，ddH2030 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin,40個(gè)循環(huán)；72°C再延伸8分鐘；
[0015]4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析并測序。
[0016]一種鴿細(xì)環(huán)病毒的檢測試劑盒，它包含所述的引物對。
[0017]其中，上述的鴿細(xì)環(huán)病毒的檢測試劑盒，包括:
[0018]1)預(yù)混劑A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P115 μ L，核苷酸序列如SEQ ID NO:2 的下游引物 Ρ215μ L，2XPCR pre_mix200 μ L，ddH20100 μ L 組成；
[0019]4)陰性對照:非鴿細(xì)環(huán)病毒的DNA600 μ L ；
[0020]3)陽性對照:鴿細(xì)環(huán)病毒基因組DNA600 μ L。
[0021]一種鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的全基因組序列，所述全基因組序列具有兩個(gè)主要的0RF，編碼R印復(fù)制蛋白的ORFl和編碼Cap外殼蛋白的0RF2，ORFl對應(yīng)第464 - 923位核苷酸序列，編碼154個(gè)氨基酸，0RF2對應(yīng)第788 - 1189位核苷酸序列，編碼134個(gè)氨基酸，第1457 - 1462位核苷酸序列對應(yīng)polyA序列區(qū)。
[0022]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明提供的背對背引物對能準(zhǔn)確擴(kuò)增出江蘇6個(gè)地區(qū)的鴿細(xì)環(huán)病毒的全基因組序列，全基因片段大小約為1585bp，BLAST比對結(jié)果證實(shí)獲得了 6個(gè)PTTV全基因序列，將其上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，取得了 6個(gè)江蘇株P(guān)TTV全基因序列對應(yīng)的登錄號，序列名稱及登錄號分別為:NJGC (KF372027)、NJLH(KF477317)、NJPK (KF477318)、NJJN (KF477319)、NTHA (KF477320)和 ZJDY (KF477321)。本發(fā)明還對該全基因序列進(jìn)行了同源性分析，該試劑盒具有較高的特異性和穩(wěn)定性，構(gòu)建了進(jìn)化樹，并進(jìn)而研究其基因結(jié)構(gòu)和功能以及各分離株之間的遺傳變異和進(jìn)化的關(guān)系，通過分析得出，不同地區(qū)和不同物種的TTV在親緣關(guān)系上表現(xiàn)出明顯的分歧。同時(shí)本發(fā)明的試劑盒檢測靈敏度達(dá)5pg，是一種快速準(zhǔn)確檢測鴿細(xì)環(huán)病毒的方法。因此本試劑盒可以作為快速檢測鴿細(xì)環(huán)病毒的有效工具。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1PTTV全基因序列的同源性分析；
[0024]圖2全基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析；
[0025]圖3Rep基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析；
[0026]圖4Cap基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析；
[0027]圖5部分陽性病料的PCR鑒定電泳圖；
[0028]圖6PTTV毒株全基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1:試劑盒的制備。
[0030]1、病毒及病料的來源和處理
[0031]從江蘇的南京浦口、江寧、六合、高淳、南通海安、鎮(zhèn)江丹陽的6個(gè)鴿場采集到144份血清或組織樣品。參見表1
[0032]表1本實(shí)驗(yàn)所檢測的鴿血清或組織樣品
【權(quán)利要求】
1.一種用于擴(kuò)增鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的背對背引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.一種鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的擴(kuò)增方法，其特征在于，包括以下步驟: O引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank已發(fā)表的人TTV基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物； 2)鴿細(xì)環(huán)病毒的PCR檢測:鴿細(xì)環(huán)病毒基因組DNA提取，將病毒基因組DNA進(jìn)行PCR檢測獲得陽性DNA樣品； 3)以上述的陽性DNA樣品為模板，將權(quán)利要求1所述的背對背引物對擴(kuò)增PTTV全基因組序列得到 PCR 產(chǎn)物:PCR 反應(yīng)體系為:LA Taql μ L, IOXLA PCR Buffer 15 μ L, dNTPMixture8 μ L，模版DNA4 μ L，上游引物Pl和下游引物P2各I μ L，ddH2030 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin,40個(gè)循環(huán)；72°C再延伸8分鐘； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析并測序。
3.一種鴿細(xì)環(huán)病毒的檢測試劑盒，它包含權(quán)利要求1所述的引物對。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴿細(xì)環(huán)病毒的檢測試劑盒，其特征在于包括: 1)預(yù)混劑A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P115 μ L，核苷酸序列如SEQ IDNO:2 的下游引物 Ρ215μ L，2XPCR pre-mix200 μ L, ddH20100 μ L 組成； 2)陰性對照:非鴿細(xì)環(huán)病毒的DNA片段600μ L ; 3)陽性對照:鴿細(xì)環(huán)病 毒基因組DNA片段600μ L0
5.一種鴿細(xì)環(huán)病毒全基因組序列的擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的全基因組序列，其特征在于，所述全基因組序列具有兩個(gè)主要的ORF，編碼Rep復(fù)制蛋白的ORFl和編碼Cap外殼蛋白的0RF2，ORFl對應(yīng)第464 - 923位核苷酸序列，編碼154個(gè)氨基酸，0RF2對應(yīng)第788 - 1189位核苷酸序列，編碼134個(gè)氨 基酸，第1457 - 1462位核苷酸序列對應(yīng)polyA序列區(qū)。
【文檔編號】C12N15/10GK103882018SQ201410158964
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】張志成, 胡志華, 茅慧華, 戴鼎震 申請人:金陵科技學(xué)院