一株銅綠假單胞菌及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株銅綠假單胞菌及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。銅綠假單胞菌（peudomonas?aeruginosa）31號，其保藏編號為CCTCC?No.M2013697。本發(fā)明的銅綠假單胞菌（peudomonas?aeruginosa）31號具有拮抗作用，因此可以將本發(fā)明的銅綠假單胞菌（peudomonas?aeruginosa）31號用于制備防控水產(chǎn)弧菌制劑中，該防控水產(chǎn)弧菌制劑可作為替代化學(xué)藥品的有益微生物制劑，用于改善水質(zhì)，清除水產(chǎn)品養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水產(chǎn)弧菌，從而預(yù)防水產(chǎn)弧菌，如副溶血弧菌或溶藻弧菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的危害，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展；避免水產(chǎn)品攜帶弧菌，保障人類健康安全。
【專利說明】一株銅綠假單胞菌及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，具體涉及一株抗活性成分穩(wěn)定性高，能作為多種菌的拮抗菌的銅綠假單胞菌及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus, V.alginolyticus)隸屬弧菌科(Vibrionaceae),弧菌屬(Vibrio)，該菌存在于海水、河口、海洋動(dòng)物體中。溶藻弧菌對魚、蝦、貝等養(yǎng)殖動(dòng)物都有較強(qiáng)的致病性，可引起養(yǎng)殖動(dòng)物急性出血性敗血癥。這種疾病，也稱爆發(fā)性流行病、弧菌病、體表潰瘍等，能感染多種海水養(yǎng)殖品種，如大黃魚、鱸魚、牙鲆、點(diǎn)帶石斑魚、黑鯛、平鯛、軍曹魚、中國明對蝦、日本對蝦、斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦、文蛤、烏賊等，是我國流行較廣的一種水生動(dòng)物條件致病菌。該菌為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢、莢膜，單獨(dú)存在或尾端相連成“C”或“S”形，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧海生弧菌，適宜溫度為17~350C，生長最適pH值范圍為6.0~9.0，近年來在我國海南、廣東、福建等省養(yǎng)殖魚類蝦類爆發(fā)性傳染病，多流行與夏季，很多報(bào)道系為該菌所致敗血癥，而且海水養(yǎng)殖病害防治比淡水困難。此外溶藻弧菌對人的致病性也有大量報(bào)道，可引起人食物中毒、耳炎等。溶藻弧菌是海水養(yǎng)殖品種暴發(fā)性傳染病的主要病原菌之一。
[0003]該細(xì)菌的防治方法主要有:抗生素防治、中草藥防治、疫苗防控、益生菌生防。
[0004](I)抗生素防治?？股厥怯脕碇委熂?xì)菌性傳染病的首選藥物，抗生素對病原菌具有顯著的抑制或殺滅作用，研究證實(shí)磺胺+TMP、環(huán)丙沙星、呋喃妥因等藥物對溶藻弧菌具有較強(qiáng)的抑菌效果。但是隨著抗生素的廣泛使用，近年來不同地區(qū)由于用藥種類和用法不同，產(chǎn)生了大量的耐藥菌株、水產(chǎn)品藥物殘留等威脅養(yǎng)殖業(yè)和人類健康，同時(shí)水產(chǎn)品耐藥又會(huì)加大劑量就陷入惡性循環(huán)。(2)中草藥防治。中草藥無抗藥性，無殘留，無環(huán)境污染，不會(huì)引發(fā)藥源性疾病且抑菌效果明顯，已經(jīng)越來越引起人們的關(guān)注。研究普遍表明單方使用石榴皮、地榆、五味子、大黃、烏梅、公丁香、連翹、板藍(lán)根等中草藥具有很強(qiáng)的抑菌能力，在實(shí)際生產(chǎn)中，將具有抑菌作用的中草藥組合成復(fù)方，適當(dāng)利用不同中草藥相互協(xié)同作用來防治溶藻弧菌引起的疾病，可以更好的發(fā)揮中草藥的抑菌作用。但是，配方不合理、濫用偏方、加工工藝落后、理論研究較少等問題，使很多養(yǎng)殖者盲目用藥。(3)疫苗防控。水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用的疫苗主要分為兩類:一類是減毒疫苗，另一類是滅活疫苗。減毒疫苗含有減毒的活病原，能誘導(dǎo)特異性抗體，并與自然感染相似；滅活的疫苗是由死的病原或者病原的一些成分如細(xì)菌脂多糖或滅活的毒素組成的，能刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)。其免疫方式有浸泡、口服、注射和噴霧等，注射方式效果最佳但費(fèi)時(shí)費(fèi)力且損傷蝦體，浸泡疫苗需要量大；疫苗的研制處于起步階段，減毒疫 苗還缺乏安全性保障，制備麻煩，成本高等；還缺乏簡易、高效、經(jīng)濟(jì)的接種途徑。(4)益生菌防控。隨著耐藥性問題的出現(xiàn)和環(huán)境的惡化使抗生素的使用受到越來越多的考驗(yàn)，而益生菌憑借無毒高效的優(yōu)點(diǎn)，通過改善水質(zhì)，在宿主體內(nèi)分泌營養(yǎng)物質(zhì)競爭或者有附著位點(diǎn)，增強(qiáng)宿主免疫力，提高抗病性，降低疾病的發(fā)病率，進(jìn)而提高水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，正受到越來越多的關(guān)注。目前，在水產(chǎn)病害控制上使用較多的益生菌為乳酸菌、弧菌屬、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌、假單胞菌屬等單一或多種有益菌組成的復(fù)合活性
微生物制劑，應(yīng)用于魚、蝦、蟹、貝、軟體動(dòng)物的養(yǎng)殖和餌料的培養(yǎng)中。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號,該菌株可以以拮抗菌的作用有效消除水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水產(chǎn)弧菌，解決了現(xiàn)有技術(shù)中水產(chǎn)品攜帶水產(chǎn)弧菌的防疫問題。
[0006]本發(fā)明的銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號于2013年12月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCN0.M2013697。
[0007]本發(fā)明的銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號對多種菌具有拮抗作用，因此可以將本發(fā)明的銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號用于制備抗菌藥物中，如防控枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、紫色色桿菌制劑，特別是防控水產(chǎn)弧菌制劑中，如防控水產(chǎn)溶藻弧菌或副溶血弧菌制劑。適用于魚、蝦等水產(chǎn)動(dòng)物，可用于防治水產(chǎn)弧菌引起的疾病。
[0008]本發(fā)明的銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號具有拮抗作用，因此可以將本發(fā)明的銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號用于制備防控水產(chǎn)弧菌制劑中，該防控水產(chǎn)弧菌制劑可作為替代化學(xué)藥品的有益微生物制劑，用于改善水質(zhì)，清除水產(chǎn)品養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水產(chǎn)弧菌，從 而預(yù)防水產(chǎn)弧菌，如副溶血弧菌或溶藻弧菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的危害，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展；避免水產(chǎn)品攜帶弧菌，保障人類健康安全。
[0009]本發(fā)明的銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號于2013年12月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCN0.M2013697。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0010]圖1是拮抗菌的篩選；
[0011]圖2是鹵蟲保護(hù)實(shí)驗(yàn)圖，其中實(shí)驗(yàn)組ZJO表示只添加溶藻弧菌、實(shí)驗(yàn)組31#表示只加溶藻弧菌拮抗菌發(fā)酵劑，實(shí)驗(yàn)組ZJ0+31#表示加溶藻弧菌和溶藻弧菌拮抗菌發(fā)酵劑。
【具體實(shí)施方式】:
[0012]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0013]實(shí)施例1:銅綠假單胞菌(peudomonas aeruginosa) 31號的篩選和鑒定
[0014](I)溶藻弧菌拮抗菌尋找、篩選
[0015](A)原料
[0016]溶藻弧菌
[0017]待篩的拮抗菌株:從西沙海域、龍蝦腸道、海參腸道等分離得到311株菌。
[0018]所用培養(yǎng)基試劑:LB培養(yǎng)基，從試劑公司采購。
[0019]LB培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L。
[0020](B)溶藻弧菌液的制備:通過無菌操作，接種環(huán)將溶藻弧菌接種到LB培養(yǎng)基中，30 °C 200rpm過夜培養(yǎng)。
[0021](C)溶藻弧菌拮抗菌分離篩選
[0022](I)細(xì)菌分離
[0023]通過無菌操作，將在西沙采樣的龍蝦腸道等用PBS研磨并稀釋成10倍梯度，各取IOOul涂布于LA，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h-48h，反復(fù)劃線2_3次，直至得到單菌落，并且記錄培養(yǎng)皿中菌落的大小、形狀、顏色、光澤等培養(yǎng)特征，共分離得到311株細(xì)菌，作為待篩拮抗菌，300C 200rpm培養(yǎng)24_48h，作為待測的細(xì)菌純培養(yǎng)液。
[0024](2)拮抗菌的篩選
[0025]通過無菌操作，將過夜培養(yǎng)的溶藻弧菌稀釋10倍，取IOOul涂布于LA平板，之后用打孔器在培養(yǎng)基上均勻打直徑為9mm的孔，然后分別吸取待測的拮抗菌發(fā)酵液各lOOul，加入孔中，培養(yǎng)皿于30°C培養(yǎng)24-48h，觀察培養(yǎng)基打孔周圍抑菌圈的大小，初步篩選得到對溶藻弧菌有抑制效果的菌株。
[0026]通過在LA培養(yǎng)基上打孔抑菌實(shí)驗(yàn)，從311株細(xì)菌中找到一株對溶藻弧菌有抑制作用的拮抗菌株。代號為菌株31號，其培養(yǎng)特征與對溶藻弧菌的抑制效果見表1。其抑菌圈見圖1，最左邊一個(gè)為陰性對照，中間和右邊(箭頭所指)均為銅綠假單胞菌31號的抑菌效果圖，中間添加的量較少，抑制作用小，圈較小。
[0027]表1:菌株31號的培養(yǎng)特征及其對溶藻弧菌的抑制
【權(quán)利要求】
1.銅綠假單胞菌(peudomonasaeruginosa)31 號,其保藏編號為 CCTCC N0.M2013697o
2.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌(peudomonasaeruginosa) 31號在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗菌藥物為防控水產(chǎn)弧菌制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的防控水產(chǎn)弧菌制劑為防控溶藻弧囷或副溶血弧囷制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗菌藥物為防控枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌或紫色 色桿菌制劑。
【文檔編號】C12N1/20GK103966121SQ201410159343
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】陳償, 韋露, 胡超群 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所