一株具有抑菌活性的變色曲霉的制作方法
【專利摘要】一株具有抑菌活性的變色曲霉，涉及一株變色曲霉。本發(fā)明提供一株變色曲霉，對枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌有較好的抑制作用，為開發(fā)新的抗菌藥物及食品防腐劑提供依據(jù)。本發(fā)明具有抑菌活性的變色曲霉為變色曲霉CWJ2，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年4月16日，保藏編號為CCTCC?NO：M2014130。本發(fā)明變色曲霉CWJ2對枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌具有較強的抑制作用。
【專利說明】一株具有抑菌活性的變色曲霉
【技術(shù)領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株變色曲霉。
【背景技術(shù)】
[0002]作為一類重要的微生物資源，植物內(nèi)生菌已經(jīng)成為研究的熱點，其在植物組織器
官中分布廣泛，是極具代謝多樣性的微生物菌群。自科學家Fleming發(fā)現(xiàn)第一種抗生素-
青霉素以來，抗生素的發(fā)現(xiàn)與應用成功地防治了微生物引起的疾病感染。但是，近年來，隨著青霉素、頭孢菌素等廣譜抗生素的廣泛應用，各種抗生素不斷更新?lián)Q代，以及臨床上存在不合理使用抗生素，導致微生物的抗藥性不斷增強，耐藥菌株的出現(xiàn)限制了現(xiàn)有抗生素的臨床效果，要解決這一問題，最有效的辦法就是加大力度，篩選開發(fā)新型的抗生素。
[0003]由于傳統(tǒng)研究方法重復發(fā)現(xiàn)天然抗菌活性產(chǎn)物的機率不斷增加，從普通環(huán)境來源的微生物中分離新的抗菌活性物質(zhì)日 益困難。因此，研究者們逐漸將目光投向了研究相對較少植物內(nèi)生菌。研究表明，藥用植物內(nèi)生真菌是新型抗菌藥物的微生物來源，其中很多已經(jīng)在社會多領域內(nèi)產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟價值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明提供一株變色曲霉，對枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌有較好的抑制作用，為開發(fā)新的抗菌藥物及食品防腐劑提供依據(jù)。
[0005]本發(fā)明具有抑菌活性的變色曲霉為變色曲霉CWJ2Aspergillus versicolor CffJ2,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2014年4月16日，保藏編號為CCTCCNO:M2014130o
[0006]本發(fā)明變色曲霉CWJ2屬于絲抱菌科(Hyohomycetaceae)曲霉屬(Aspergillus)變色曲霉(Aspergillus versicolor) ?
[0007]本發(fā)明變色曲霉CWJ2在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，質(zhì)地絲絨狀；具大量的分生孢子結(jié)構(gòu)，綠色，邊緣白色；無滲出液；有輕霉味；菌落反面呈不同程度的微黃到橘色。變色曲霉CWJ2的分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，呈球形。頂囊表面長滿輻射狀小梗。
[0008]本發(fā)明變色曲霉CWJ2可在PDA培養(yǎng)基上生長，最適生長溫度為28 °C。
[0009]本發(fā)明變色曲霉CWJ2對枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、單增李斯特菌、釀膿鏈球菌、大腸桿菌、銅綠假單孢菌和肺炎克雷伯菌具有較強的抑制作用，具有較好的開發(fā)應用價值，為新型抑菌活性物質(zhì)的篩選提供參考。
[0010]本發(fā)明變色曲霉CWJ2屬于曲霉屬(Aspergillus)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2014年4月16日，保藏編號為CCTCCNO:M2014130o
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明變色曲霉CWJ2的菌落形態(tài)照片；圖2為本發(fā)明變色曲霉CWJ2的孢子形態(tài)照片；圖3為本發(fā)明變色曲霉CWJ2和相近菌株進行同源性比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹?！揪唧w實施方式】
[0012]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0013]【具體實施方式】一:本實施方式具有抑菌活性的變色曲霉為變色曲霉(Aspergillusversicolor) CWJ2，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2014年4月16日，保藏編號為CCTCCNO:M2014130。
[0014]本實施方式變色曲霉CWJ2在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，質(zhì)地絲絨狀；具大量的分生孢子結(jié)構(gòu)，綠色，邊緣白色(如圖1);無滲出液；有輕霉味；菌落反面呈不同程度的微黃到橘色。變色曲霉CWJ2的分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，呈球形(如圖2)。頂囊表面長滿福射狀小梗。
[0015]本實施方式變色曲霉CWJ2可在PDA培養(yǎng)基上生長，最適生長溫度為28°C。
[0016]【具體實施方式】二:本實施方式變色曲霉(Aspergillus versicolor)CWJ2由中國黑龍江省帽兒山地區(qū)健康的刺五加植株中篩選得到。篩選按以下步驟進行:選取健康的刺五加根用自來水沖洗干凈后，以無菌濾紙吸干水分，切成Icm小段，按以下無菌操作程序?qū)ζ溥M行表面消毒:體積濃度75%的 酒精漂洗Imin—體積濃度10%的雙氧水漂洗15min—體積濃度75%的酒精漂洗Imin—無菌水沖洗3次。將消毒后的實驗材料置于PDA固體培養(yǎng)基中，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10~15天，待實驗材料周圍長出菌絲，挑取菌絲轉(zhuǎn)入平板(PDA固體培養(yǎng)基)多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基)中，4°C保存。為了檢查表面消毒是否徹底，取最后一次無菌水沖洗液涂布培養(yǎng)平板(PDA固體培養(yǎng)基)作對照，另將消毒后的實驗材料在培養(yǎng)平板上滾動一周作對照，于相同的條件下培養(yǎng)，結(jié)果對照平板無任何菌長出，多次重復均如此，證明所分到的菌是植物內(nèi)生菌，而不是表面的附生菌。獲得的純化后的菌株即為變色曲霉CWJ2。
[0017]PDA培養(yǎng)基(1000mL)由200g馬鈴薯、20g蔗糖和余量的蒸餾水組成。PDA固體培養(yǎng)基(1000mL)由200g馬鈴薯、20g蔗糖、16g瓊脂粉和余量的蒸餾水組成。
[0018]對分離純化得到的變色曲霉CWJ2進行分子生物學鑒定，按以下步驟進行:
[0019]提取菌株的總DNA，采用真菌通用引物NS1、NS6擴增18SrDNA片段，PCR產(chǎn)物純化后進行測序，其序列如SEQIDN0:1所示，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中應用BLAST分析進行同源性比較，然后通過應用軟件MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖3所示)，與曲霉屬菌株的同源性都達到了 99%以上，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件確定變色曲霉CWJ2屬于曲霉屬(Aspergillus)。
[0020]NSl:GTAGTCATATGCTTGTCTC
[0021]NS6: GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
[0022]以下對本實施方式變色曲霉CWJ2及其發(fā)酵液進行抑菌活性測定，具體步驟如下:
[0023]1、發(fā)酵液的制備:將變色曲霉CWJ2接種于50mLPDA培養(yǎng)基中，作3個重復，置于280C 120r/min空氣浴搖床中，培養(yǎng)10天取出，在無菌條件下依次用8層無菌紗布和無菌濾紙過濾，收集過濾液作為發(fā)酵液，備用；取PDA培養(yǎng)基同法制成陰性對照樣品。
[0024]2、含供試細菌平板的制備:將11株供試細菌活化2~3次后，接種于斜面培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I~2天，用血球計數(shù)板計數(shù)法，在每種供試細菌的斜面試管中加入5mL生理鹽水中，充分振蕩搖勻后，滴一滴放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)，然后稀釋到菌體濃度為IX 107CFU/mL，得到11株供試細菌的菌懸液；再按每IOOmL培養(yǎng)基中加入ImL菌懸液的比例向50°C左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中加入菌懸液，混勻后，迅速的分裝到滅菌后的空平板中，冷卻，制成含菌平板，備用。
[0025]同法，取活化2-3次供試真菌一白假絲酵母菌，接種于斜面培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基)上，在28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)l-2d，用血細胞計數(shù)板計數(shù)法，在供試真菌的斜面培養(yǎng)基試管中分別加入5mL生理鹽水，充分振蕩搖勻，取一滴滴于血細胞計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)，然后稀釋到菌體濃度為I X 107CFU/mL,得到供試真菌的菌懸液；將菌懸液按每IOOmL培養(yǎng)基中加入ImL菌懸液的比例加入到50°C左右的PDA固體培養(yǎng)基中，混勻后，迅速的分裝到滅菌后的空平板中，冷卻，制成含菌平板，備用。
[0026]所述11株供試細菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、酉良胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、幾腸球菌(Enterococcusfacalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baummanii)和銅綠假單抱菌(Pseudomonas aeruginosa),供試真菌為白假絲酵母(Candida albicans),均購買自黑龍江省科學院微生物研究所。
[0027]3、采用菌餅法檢測變色曲霉CWJ2的抑菌活性
[0028]用直徑0.8cm的打孔器在培養(yǎng)10天的變色曲霉CWJ2菌落上制備菌餅，并將菌餅置于含菌平板上，每株供試菌作3個重復，用PDA培養(yǎng)基作陰性對照，用含lmg/mL鏈霉素和2mg/mL氟康唑瓊脂培養(yǎng)基作陽性對照，將制備好的平板分別置于37°C及28°C恒溫培養(yǎng)24h后觀察，測其抑菌圈直徑(Φ)。檢測結(jié)果如表1所示。
[0029]4、采用濾紙片法對變色曲霉CWJ2的發(fā)酵液進行抑菌試驗
[0030]將無菌濾紙片(Φ = 0.8cm)浸于變色曲霉CWJ2的發(fā)酵液中30min，取出，平放于含菌平板上，每個平板上放2個濾紙片，每株供試菌作3個重復，用PDA液體培養(yǎng)基作陰性對照，用lmg/mL鏈霉素和2mg/mL氟康唑溶液作陽性對照,將制備好的平板置于37°C恒溫培養(yǎng)24h后觀察，測其抑菌圈直徑(Φ)。檢測結(jié)果如表2所示。
[0031 ] 表1變色曲霉CWJ2對12種供試菌的抑菌活性篩選結(jié)果
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一株具有抑菌活性的變色曲霉，其特征在于該菌株為變色曲霉(Aspergillusversicolor) CffJ2,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址是武漢市武漢大學,保藏日期為2014年4月16日，保 藏編號為CCTCCNO:M2014130。
【文檔編號】C12R1/66GK104004662SQ201410219071
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】鄭春英, 郭曉璐, 崔宇, 徐慧超 申請人:黑龍江大學