專(zhuān)利名稱(chēng)：一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生細(xì)菌是產(chǎn)生活性物質(zhì)和新化學(xué)物質(zhì)的潛在資源，不但可以幫助維護(hù)人類(lèi)健康，也可以維護(hù)動(dòng)物和植物的健康。藥用植物本身就能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)研究表明，宿主與內(nèi)生細(xì)菌在相互作用的過(guò)程中，有內(nèi)生細(xì)菌能產(chǎn)生與宿主相同的活性物質(zhì)，因此從藥用植物中分離到產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生細(xì)菌已成為當(dāng)今學(xué)者的研究趨勢(shì)。內(nèi)生細(xì)菌具有多種生物學(xué)功能，能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，特別是在尋找新的抗菌物質(zhì)方面，為我們提供了一個(gè)新的資源庫(kù)，并已在各個(gè)方面顯現(xiàn)出其潛在的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，對(duì)多種致病菌具有抑制作用，為開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物提供依據(jù)。本發(fā)明具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX31，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年4月24日，保藏編號(hào)為CCTCC No M 2012138 ;本發(fā)明枯草芽孢桿菌CX31為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，細(xì)胞大小為長(zhǎng)2. 0 3. 0 ii m，寬0. 7 0. 8 ii m，有鞭毛，有菌膜；在牛肉膏蛋 白胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色。本發(fā)明枯草芽孢桿菌CX31為兼性厭氧菌，淀粉水解試驗(yàn)呈陰性，明膠液化試驗(yàn)呈陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，酯酶試驗(yàn)呈陰性，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，V. P試驗(yàn)呈陽(yáng)性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果為具有運(yùn)動(dòng)性。本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX31通過(guò)16S rDNA序列比對(duì)分析,與序列號(hào)為JQ435698. I的枯草芽孢桿菌CEl菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為98 %，通過(guò)結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定枯草芽孢桿菌CX31屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。本發(fā)明枯草芽孢桿菌CX31可在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌CX31的最適生長(zhǎng)溫度為35°C,最適合生長(zhǎng)環(huán)境的pH值為6. 8 7. 6,最適鹽濃度為2%。本發(fā)明枯草芽孢桿菌CX31具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，對(duì)多種致病菌具有較好的抑制作用，為開(kāi)發(fā)新型抗菌藥提供了依據(jù)。本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX31屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年4月24日，保藏編號(hào)為CCTCC No M 2012138。
圖I為本發(fā)明枯草芽孢桿菌CX31和相近菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(BaciIIus subtilis) CX31，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年4月24日，保藏編號(hào)為CCTCC No M 2012138。本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌CX31為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，有鞭毛，有菌膜；在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)枯草芽孢桿菌CX31進(jìn)行生理生化鑒定枯草芽孢桿菌CX31為兼性厭氧菌，淀粉水解試驗(yàn)呈陰性，明膠液化試驗(yàn)呈陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，酯酶試驗(yàn)呈陰性，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，V. P試驗(yàn)呈陽(yáng)性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果為具有運(yùn)動(dòng)性。
本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌CX31可在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(IOOOmL)由3. Og牛肉膏、10. Og蛋白胨、5. Og NaCl和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH至7.0 7.2，于121°C高壓滅菌30min。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(IOOOmL)由3. Og牛肉膏、10. Og蛋白胨、5. Og NaCl、16. Og瓊脂粉和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH至7. 0 7. 2，于121°C高壓滅菌30min。本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌CX31的最適生長(zhǎng)溫度為35°C,最適合生長(zhǎng)環(huán)境的pH值為6. 8 7. 6，最適鹽濃度為2%。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX31由中國(guó)黑龍江省帽兒山地區(qū)健康野生刺五加植株的根莖中篩選得到。篩選按以下步驟進(jìn)行選取健康刺五加的根莖，用自來(lái)水沖洗干凈后用無(wú)菌濾紙吸干水分，切成Icm小段；然后于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)將刺五加根莖小段按下述方法進(jìn)行表面消毒95%酒精浸泡lmin，10%次氯酸鈉浸泡5min，95%酒精浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3次，10%雙氧水浸泡15min，75 %酒精浸泡lmin，無(wú)菌水沖洗3次；將消毒后的實(shí)驗(yàn)材料置于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5d，待根莖小段周?chē)L(zhǎng)出菌體，挑取菌體在平板培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)上多次劃線(xiàn)分離純化，將純化后的菌株于斜面培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)，即得到枯草芽孢桿菌CX31。陰性對(duì)照為了檢查表面消毒是否徹底，取最后一次無(wú)菌水沖洗液涂布在平板培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)上作對(duì)照，另將消毒后的實(shí)驗(yàn)材料在平板培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)上滾動(dòng)一周作對(duì)照，于相同的條件下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，對(duì)照的平板培養(yǎng)基均無(wú)任何菌落長(zhǎng)出，證明刺五加植株的根莖表面消毒徹底，分離到的菌是刺五加內(nèi)生細(xì)菌-枯草芽孢桿菌CX31，而不是植株表面的附生菌。對(duì)篩選得到的枯草芽孢桿菌CX31進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行提取菌株的基因組DNA，利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆的菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序?？莶菅挎邨U菌CX31的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1533bp，其序列如SEQ ID NO 1所示，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后用軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(如圖I所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與序列號(hào)為JQ435698. I的枯草芽孢桿菌CEl菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為98%，通過(guò)結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定枯草芽孢桿菌CX31屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。PCR引物購(gòu)買(mǎi)自上海生工生物技術(shù)有限公司，其他試劑購(gòu)自于大連寶生物工程有限公司。對(duì)本實(shí)施方式枯草芽孢桿菌CX31的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，具體步驟如下I、枯草芽孢桿菌CX31的活化在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用接種環(huán)挑取枯草芽孢桿菌CX31，在平板培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)上用接種環(huán)劃線(xiàn)，在37°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2d。2、供試菌株的活化用接種環(huán)挑取供試真菌一白假絲酵母菌，于無(wú)菌環(huán)境下，在 斜面培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基)上進(jìn)行劃線(xiàn)，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。PDA固體培養(yǎng)基(IOOOmL)由200g馬鈴薯、20g蔗糖、16g瓊脂粉和余量的蒸餾水組成。用接種環(huán)分別挑取11株供試細(xì)菌(枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、單增李斯特菌、釀膿鏈球菌、大腸桿菌、銅綠假單孢菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯氏菌)，于無(wú)菌環(huán)境下，在斜面培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)上進(jìn)行劃線(xiàn)，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。3、枯草芽孢桿菌CX31發(fā)酵樣品的制備將分離得到的枯草芽孢桿菌CX31接種于50mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，作3個(gè)重復(fù)，置于120r/min 37°C空氣浴搖床中，培養(yǎng)3天取出，作為種子液；將種子液按照20%的接種量接種到裝有50mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的三角瓶中，置于120r/min 37°C空氣浴搖床中培養(yǎng)5天，得發(fā)酵液。將發(fā)酵液以2000r/min離心lOmin，取上層液體，加入等量的水飽和正丁醇超聲lh。超聲后取正丁醇層，于45°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，向獲得的殘?jiān)屑覫mL甲醇溶解后作為枯草芽孢桿菌CX31發(fā)酵樣品。4、含菌平板的制備將按照上述步驟2活化2-3次的11株供試細(xì)菌，接種于斜面培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)上，在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)l-2d，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，在11株供試細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基試管中分別加入5mL生理鹽水,充分振蕩搖勻,取一滴滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后稀釋到菌體濃度為lX107CFU/mL，得到11株供試細(xì)菌的菌懸液；將每個(gè)菌株的菌懸液按每IOOmL培養(yǎng)基中加入ImL菌懸液的比例加入到50°C左右牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后，迅速分裝到滅菌后的空平板中，冷卻，制成11株供試細(xì)菌的含菌平板。同法，取活化2-3次供試真菌一白假絲酵母菌，接種于斜面培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基)上，在28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)l-2d，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，在供試真菌的斜面培養(yǎng)基試管中分別加入5mL生理鹽水，充分振蕩搖勻，取一滴滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后稀釋到菌體濃度為I X 107CFU/mL,得到供試真菌的菌懸液；將菌懸液按每IOOmL培養(yǎng)基中加入ImL菌懸液的比例加入到50°C左右的PDA固體培養(yǎng)基中，混勻后，迅速分裝到滅菌后的空平板中，冷卻，制成供試真菌的含菌平板。5、采用濾紙片法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，每個(gè)含菌平板內(nèi)放置3組雙層濾紙片=0. 6cm)。每組濾紙片上加10 ii L枯草芽孢桿菌CX31發(fā)酵樣品,每株供試菌株的含菌平板作3個(gè)平行樣。以鏈霉素溶液(lOOmg/mL)和制霉素溶液(100mg/mL)做陽(yáng)性對(duì)照，將未接菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基按同樣的方法處理做陰性對(duì)照，然后將含菌平板置于37°C恒溫培養(yǎng)24h后觀察，測(cè)其抑菌圈直徑沙)，測(cè)定結(jié)果如表I所示。表I
表I中A為枯草芽孢桿菌；B為短小芽孢桿菌；C為金黃色葡萄球菌；D為糞腸球菌；E為屎腸球菌；F為單增李斯特菌；G為釀膿鏈球菌；H為大腸桿菌；1為銅綠假單孢菌J為鮑曼不動(dòng)桿囷；K為肺炎克雷伯氏囷；L為白假絲酵母；Str為鏈霉素；Nys為制霉素。所述枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、類(lèi)腸球菌(Enterococcus facalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、釀胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單抱菌(Pseudomonasaeruginosa)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baummanii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和白假絲酵母(Candida albicans)均購(gòu)買(mǎi)自黑龍江省科學(xué)院微生物研究所。表I中-表示無(wú)活性；+表示活性較弱，抑菌圈直徑< Ilmm ;++表示活性中等，抑菌圈直徑11 15mm;+++表示活性較強(qiáng)，抑菌圈直徑> 15mm。試驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽孢桿菌CX31具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，對(duì)多種致病菌具有較好的抑制作用，為開(kāi)發(fā)新型抗菌藥提供了依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌，其特征在于具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX31，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年4月24日，保藏編號(hào)為CCTCC No :M 2012138。
全文摘要
一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌，涉及一株枯草芽孢桿菌。本發(fā)明提供了一株枯草芽孢桿菌，對(duì)多種致病菌具有抑制作用，為開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物提供依據(jù)。本發(fā)明具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌CX31，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2012年4月24日，保藏編號(hào)為CCTCC NoM 2012138。本發(fā)明枯草芽孢桿菌CX31具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，對(duì)多種致病菌具有較好的抑制作用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102703365SQ20121022906
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者盧玢宇, 徐翠, 鄭春英 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)