專利名稱：一種基因定向克隆用tc載體及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說是一種便于基因定向克隆的基因工程載體TC載體及其制備以及基因定向克隆的方法。
背景技術(shù)：
目前定向克隆技術(shù)主要有以下幾種方法(I)通過一種限制性核酸內(nèi)切酶消化載體，也用這種酶(或同尾酶)消化外源基因片段，然后將載體與外源基因片段通過T4 DNA連接酶催化連接，重組克隆包含方向不定(兩種方向)的外源基因片段。借助于限制性核酸內(nèi)切酶消化或其他方法從無定向克隆中篩選外源片段方向符合目的要求的克隆。這種方法缺點(diǎn)是載體兩個(gè)末端自我連接嚴(yán)重，后期篩選過程工作量大，并且存在較大不確定性，很可 能會(huì)得不到所需方向克??；(2)通過兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶消化載體，也用這兩種酶消化外源基因片段，然后將載體與外源基因片段通過T4 DNA連接酶催化連接，重組載體即為定向克隆。該方法缺點(diǎn)是步驟繁瑣，工作量大，有時(shí)會(huì)很難找到合適的限性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)而確定實(shí)驗(yàn)方案；(3)在(I)的基礎(chǔ)上，增加外源基因片段與載體之間連接處的特殊序列，使正反向克隆中某向克隆具有或不具有某稀有限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別、切割位點(diǎn)，因而可以借助于該稀有限制性核酸內(nèi)切酶篩選方向克隆的篩選。這種改進(jìn)只是在一定程度上減少了( I)方法后期篩選工作量，而對(duì)其他缺點(diǎn)(存在較大不確定性，很可能會(huì)得不到所需方向克隆)無任何改進(jìn)。總之，現(xiàn)有技術(shù)存在步驟繁瑣、結(jié)果不確定或者難于制定實(shí)驗(yàn)方案等缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種基因定向克隆的載體(可以為質(zhì)粒、噬菌體、病毒及其衍生載體等)及其制備和使用方法，從而大大方便外源基因片段定向克隆于目標(biāo)載體(如細(xì)菌、酵母、植物以及動(dòng)物表達(dá)載體等)，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。本發(fā)明先將目的載體制備成具有“載體的兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基”特征的TC載體，然后只要把目的基因按照本發(fā)明所提出的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，即可將該擴(kuò)增產(chǎn)物直接定向連接于TC載體。對(duì)于從通用目的載體出發(fā)進(jìn)行的重組載體的構(gòu)建工作而言，該方法由于減少了操作步驟和實(shí)驗(yàn)試劑的消耗，使效率得到提高的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)成本也大大降低。本發(fā)明所提供的基因定向克隆用的TC載體是
在該線狀載體的兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基(稱之為“TC載體”)。本發(fā)明所提供的TC載體的制備方法，它包括以下步驟
a、填充序列的引物設(shè)計(jì)
選擇一段序列已知DNA序列，該DNA片段長度范圍100 2000bp (該DNA頻段用作目標(biāo)載體改造的“填充序列”，所存在于的載體稱為供體載體)，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，該引物一方面與供體載體模板具有特異結(jié)合的序列，同時(shí)各有一個(gè)I I或各有一個(gè)EamW^1、Mbo W、Hph1.Bmr l.Hpy AV和必￠/ I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ;
b、在引物I和引物2引發(fā)下，以供體載體作DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即填充序列；
C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，形成前TC載體(TC載體的前體)。由于引物I和引物2兩端的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的簡并堿基經(jīng)過選擇，使之被克隆于目標(biāo)載體形成前TC載體后，用與a)相應(yīng)的I或者fe 1105 I,Mbo 11,Hph I,Bmr I,Hpy AV和必￠/ I中的一種酶切該前TC載體，所得到的載體片段即為符合TC載體特征的載體分子兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基?！N基因定向克隆用TC載體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟
a、填充序列的引物設(shè)計(jì)
選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度范圍100 2000bp (該DNA片段用作改造目標(biāo)載體的“填充序列”，該DNA片段序列所存在的載體稱為供體載體。);針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，該引物一方面與作為模板的供體載體具有特異結(jié)合的序列，同時(shí)各有一個(gè) Xcm I 或各有一個(gè)萬<3 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、HpyI 中的一種內(nèi)切
酶的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ；
b、在引物I和引物2引發(fā)下，以供體載體作DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即填充序列；
C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，從而形成前TC載體，即TC載體的前體分子；
通過對(duì)引物I和引物2兩端的I或fe 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、處f AV和Ahd I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)的簡并堿基的選擇，使得前TC載體經(jīng)Zos I或feM105 I, MboU、Hph I,Bmr1、Hpy AV和處c/ I中的一種內(nèi)切酶酶切后，回收載體片段即可得到一個(gè)線性載體，其兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基，即權(quán)利要求1所述TC載體。本發(fā)明所提供的基于上述TC載體進(jìn)行的定向克隆基因的方法，它包括以下步驟
a、填充序列的引物設(shè)計(jì)
選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度范圍100 2000bp，用作改造目標(biāo)載體的“填充序列”。針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物一方面與目標(biāo)載體的DNA模板具有特異結(jié)合的構(gòu)造，同時(shí)兩條引物兩5’端各有一個(gè)Zos I或各有一個(gè)及 1105 UMo II,Hph1、Bmr1、Hpy AV和AM I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ；
b、用引物I和引物2對(duì)供體載體進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物充當(dāng)填充序列；
C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，形成前TC載體，即TC載體的前體分子；通過對(duì)引物
I和引物2 兩端的 Jc I 或萬<3 11051、Mbo II > Hph1、Bmr1、HpyI 中的一種
的識(shí)別位點(diǎn)的簡并堿基的選擇，使得前TC載體經(jīng)Zos I或fe 11051、Mbo U、Hph I,Bmr
I,Hpy AV和AM I中的一種內(nèi)切酶酶切后，再回收載體片段即可得到一個(gè)線性載體，其兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基，即權(quán)利要求1所述TC載體；
d、設(shè)計(jì)待定向克隆基因的一對(duì)特異PCR引物，該引物對(duì)中一條引物5’端為C堿基，且另一條引物5’端為G或A或T堿基(正向還是反向引物5’端加C將決定DNA序列定向克隆的方向)；
e、在d步所設(shè)計(jì)的引物引發(fā)下，用Taq酶(或其他與Taq酶具有相同末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA聚合酶)PCR擴(kuò)增待克隆基因。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中，將有一個(gè)3’端突出一個(gè)A堿基、另一個(gè)3’端突出一個(gè)G堿基的產(chǎn)物，恰與上述TC載體兩3’末端匹配。將該擴(kuò)增產(chǎn)物和TC載體連接即可得到克隆方向確定的重組DNA分子。
圖1是本發(fā)明基因定向克隆用TC載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是前TC載體結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是本發(fā)明原理圖。
圖4是本發(fā)明具體實(shí)施方式
中的原核表達(dá)載體pET17b的質(zhì)粒圖譜。圖5是本發(fā)明具體實(shí)施方式
中的細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA6/V5_His A質(zhì)粒圖譜。圖6是本發(fā)明具體實(shí)施方式
中的植物表達(dá)載體PCAMBIA1391質(zhì)粒圖譜。圖7是本發(fā)明具體實(shí)施方式
中定向克隆質(zhì)粒的鑒定圖譜。以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。一、TC載體的制備
① 填充序列的引物設(shè)計(jì)
選擇一段已知DNA序列(長度范圍100 2000bp，此處用作目標(biāo)載體改造用的“填充序列”的模板，所存在于的載體稱為供體載體)，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，該引物一方面與供體載體模板具有特異結(jié)合的序列，同時(shí)5’各有一個(gè)Zos I或各有一個(gè)及 11051、Mbo W、Hph I,Bmr I,Hpy AV和I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2。用該對(duì)引物PCR擴(kuò)增供體載體，將所得到的PCR產(chǎn)物克隆于目標(biāo)載體形成TC載體的前體(即前 TC 載體)。t^Xcm I 或者及迎11051、Mbo U、Hph !,Bmr1、Hpy kN 琳 AhdI中的一種內(nèi)切酶酶切，通過對(duì)識(shí)別堿基序列中的簡并的選擇，使酶切后得到的載體片段符合本發(fā)明所述TC載體特征的3’端突出堿基該線狀TC載體兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基。為方便克隆，可在引物5’端添加內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)及其末端酶切保護(hù)堿基，這對(duì)引物能擴(kuò)增出的DNA序列要求一般不小于lOObp、不大于2000bp。上述引物1、引物2的設(shè)計(jì)可按本領(lǐng)域通用方法進(jìn)行。引物中Zos I (或feM105UMbo 11,Hph I,Bmr I,Hpy AV和燦c/ I中的一種)識(shí)別位點(diǎn)的簡并堿基的選擇可參考下面例子(以Xos I為例)
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I為Xcm I識(shí)別切割位點(diǎn)的一般形式，2、3針對(duì)簡并堿基進(jìn)行了堿基選擇，使之酶切之后產(chǎn)生特殊的3’端突出堿基(序列中，“N”代表A、T、G、C堿基中的任意一種，“ I ”代表酶切斷磷酸二酯鍵處)，非酶切突出位置簡并堿基可選擇任意堿基。②將填充序列克隆到目標(biāo)載體
用經(jīng)上述設(shè)計(jì)的引物1、引物2擴(kuò)增出填充序列，之后利用通常的克隆技術(shù)克隆到目標(biāo)載體。具體涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有=PCR擴(kuò)增、限制內(nèi)切酶酶切、連接、DNA凝膠電泳產(chǎn)物回收及細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法等(可參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊進(jìn)行)。以下給出部分可參考的實(shí)驗(yàn)程序
(A)PCR反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種基因定向克隆用TC載體，其特征在于，該載體兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基。
2.一種基因定向克隆用TC載體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟 a、填充序列的引物設(shè)計(jì) 選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度范圍100 2000bp ;針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，該引物一方面與作為模板的供體載體具有特異結(jié)合的序列，同時(shí)各有一YXcm I 或各有一個(gè)1051、Mbo W、Hph !,Bmr1、Hpy AV 和必i/ I 中的一種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ； b、在引物I和引物2引發(fā)下，以供體載體作DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即填充序列； C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，從而形成前TC載體，即TC載體的前體分子； 通過對(duì)引物I和引物2兩端的Zc I或fe 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、處f AV和Ahd I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)的簡并堿基的選擇，使得前TC載體經(jīng)Zos I或feM105 !,MboU、Hph I,Bmr1、Hpy AV和處c/ I中的一種內(nèi)切酶酶切后，回收載體片段即可得到一個(gè)線性載體，其兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基，即權(quán)利要求1所述TC載體。
3.一種基于TC載體定向克隆基因的方法，其特征在于它包括以下步驟 a、填充序列的引物設(shè)計(jì) 選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度范圍100 2000bp，用作改造目標(biāo)載體的“填充序列”，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物一方面與供體載體的DNA模板具有特異結(jié)合的構(gòu)造，同時(shí)兩條引物兩5’端各有一今Xcm I或各有一個(gè)萬<3 11051、Mbo W、Hph1、Binr1、Hpy AV和必i/ I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ; b、用引物I和引物2對(duì)供體載體進(jìn)行擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物充當(dāng)填充序列； C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，形成前TC載體，即TC載體的前體分子；通過對(duì)引物I和引物 2 兩端的 Jc I 或萬<3 11051、Mbo II> Hph1、Bmr1、Hpy AV 和 JAtZ I 中的一種的識(shí)別位點(diǎn)的簡并堿基的選擇，使得前TC載體經(jīng)Zos I或fe 11051、Mbo U、Hph I,BmrI,Hpy AV和AM I中的一種內(nèi)切酶酶切后，回收載體片段即可得到一個(gè)線性載體，其兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基，即符合權(quán)利要求1特征的TC載體； d、設(shè)計(jì)待定向克隆基因的一對(duì)特異PCR引物，該引物對(duì)中一條引物5’端為C堿基，且另一條引物5’端為G或A或T喊基； e、在d步所設(shè)計(jì)的引物引發(fā)下，用Taq酶(或其他與Taq酶具有類似末端轉(zhuǎn)移酶活性的DNA聚合酶)PCR擴(kuò)增待克隆基因得到擴(kuò)增產(chǎn)物，其中一個(gè)3’端突出一個(gè)A堿基、另一個(gè)3’端突出一個(gè)G堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，恰與上述TC載體兩3’末端匹配，將該擴(kuò)增產(chǎn)物和TC載體通過T4 DNA連接酶催化連接即可得到克隆方向確定的重組DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因定向克隆用TC載體及其制備和使用方法，該載體兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基。其制備方法包括a、填充序列的引物設(shè)計(jì)，由此得到引物1和引物2；b、在引物1和引物2引發(fā)下，以供體載體作DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即填充序列；c、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，從而形成前TC載體；d、內(nèi)切酶酶切該前TC載體并回收載體片段就可得到TC載體。其使用方法包括a、制備TC載體；b、設(shè)計(jì)一對(duì)待定向克隆基因的PCR引物；c、用這對(duì)引物和Taq酶擴(kuò)增待定向克隆基因并將產(chǎn)物連接于TC載體即可獲得定向克隆重組載體。本發(fā)明提高了從通用目的載體出發(fā)進(jìn)行的重組載體的構(gòu)建的工作效率，可減低實(shí)驗(yàn)成本。
文檔編號(hào)C12N15/64GK102994535SQ201210436709
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者李繼剛, 李秀敏, 楊忠祥, 夏潔函 申請(qǐng)人:河北大學(xué)