專利名稱：一株銅綠假單胞菌及其獲取方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，特別涉及一株可高效分解石油類物質(zhì)的銅綠假單胞菌及其獲取方法與應(yīng)用。技術(shù)背景
隨著世界對石油及其制品需求的日益增長，在石油的開采、運輸、裝卸及利用過程中的溢油事故也日漸增多。溢油不僅造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，并且由于石油中烴類污染物的潛在毒性和生物累積效應(yīng)會導(dǎo)致環(huán)境質(zhì)量和生物種類多樣性的嚴(yán)重下降，破壞生態(tài)系統(tǒng)的功能，造成惡性的環(huán)境破壞與巨大的經(jīng)濟損失。此外，石油中的多環(huán)芳烴類化合物具有強烈的致畸、致癌和致突變效應(yīng)，可通過食物鏈進(jìn)入生物體與人體，具有生物累積效應(yīng)，對生物和人的健康造成潛在的危害。因此，研究石油污染的控制與修復(fù)問題可保持生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)，保障人民的身體健康，促進(jìn)經(jīng)濟和社會的可持續(xù)發(fā)展。
目前，石油污染土壤的修復(fù)方法主要包括物理法、化學(xué)法及生物法。比較而言，生物法具有物理法和化學(xué)法不可比擬的優(yōu)勢。首先是生物法的處理費用低，其處理成本大約只有物化方法的三分之一；其次是生物法的修復(fù)操作簡單，可實現(xiàn)原位直接修復(fù)；再次，生物法修復(fù)對環(huán)境的二次污染小。生物修復(fù)法包括動物修復(fù)、植物修復(fù)及微生物修復(fù)；這三種方法中由于微生物資源豐富、易于培養(yǎng)、對環(huán)境的耐受性較強，因此，微生物修復(fù)被認(rèn)為具有廣闊的應(yīng)用前景。
微生物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵是從環(huán)境中篩選出可高效降解石油污染物的微生物，效率高且周期短。在被石油長期污染的環(huán)境中，存在大量的石油降解菌，可從中篩選出高效的石油降解菌株。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一株銅綠假單胞菌及其獲取方法與應(yīng)用，該銅綠假單胞菌株可穩(wěn)定高效地分解多種石油類物質(zhì)，可有效地用于環(huán)境中石油污染物的生物降解與環(huán)境修復(fù)。
本發(fā)明所提供的銅綠假單胞菌SJTD-I來源于大慶油田的石油長期污染土壤中， 經(jīng)過人工富集、篩分及純化所得。SJTD-I菌落呈圓形，隆起，菌落呈黃綠色，透明，邊緣無規(guī)則擴散，產(chǎn)生熒光色素，革蘭氏染色呈陰性，直或彎的桿菌，單個，無芽孢，好氧，30°C下生長良好，有惡臭氣味。經(jīng)對該菌株的16S rDNA的鑒定與序列分析，表明該菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。該銅綠假單胞菌SJTD-1菌株已于2012年9月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號) 保藏，登記入冊編號為CGMCCNo. 6584。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
一株銅綠假單胞菌，命名為SJTD-I，其保藏編號為CGMCC No. 6584。
上述銅綠假單胞菌的16S rDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
上述銅綠假單胞菌的獲取方法，包括以下步驟
A、采集被石油長期污染土壤作為微生物源；
B、以石油為單一碳源,制備含有500mg/L石油的IOOmL BSM無機培養(yǎng)基,用鹽酸調(diào) pH 值至 7. 0-7. 2，121°C 滅菌 20min ；
C、待培養(yǎng)基溫度降低到30°C左右時，按照3%的土壤接種量在超凈臺下接種；
D、30°C、180rpm的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中進(jìn)行富集培養(yǎng)；
E、重復(fù)培養(yǎng)七次后，在固體培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至分離出單菌株，之后再將菌株接種入上述無機培養(yǎng)基內(nèi)馴化，上述操作重復(fù)多次，得到純化的銅綠假單胞菌菌株，命名為SJTD-I。
上述銅綠假單胞菌的獲取方法，其中，所述BSM無機培養(yǎng)基的無機成分及濃度如下Κ2ΗΡ04，0· 5g/L ;ΚΗ2Ρ04，3· 815g/L ； (NH4) 2HP04,0. 825g/L ；MgCl2 · 6H20，20mg/L ；FeCl3, 0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/L ；Na2S04, 200mg/L ；KN03,1. 2625g/L。
上述銅綠假單胞菌的應(yīng)用，用于環(huán)境中石油類物質(zhì)的分解與去除。
上述銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其中，所述石油類物質(zhì)包括Cltl-C3tl的烷烴和石油。
本發(fā)明的SJTD-I菌株可在濃度高達(dá)10g/L的石油及烷烴類物質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常生長，24小時內(nèi)能將初始濃度為500mg/L的C16-C2q的長鏈烷烴和石油完全分解，36小時可將高達(dá)2g/L的C16-C2tl的長鏈烷烴和500mg/L原油全部分解；七天對5g/L的原油的分解率大于85%。
依據(jù)本發(fā)明，由于銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株具有高效降解石油類物質(zhì)的特性，可應(yīng)用于含有石油類物質(zhì)的環(huán)境治理與土壤修復(fù)。本發(fā)明與現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的石油降解菌株相比，其降解效率顯著提高，降解周期明顯縮短。
圖I為本發(fā)明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株的平板劃線圖2為本發(fā)明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C14 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖3為本發(fā)明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C16 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖4為本發(fā)明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C18 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖5為本發(fā)明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C20 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖6為本發(fā)明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株對不同濃度 (■ 250mg/L ；· 500mg/L ；▲ lg/L ；ψ 2g/L)的十六焼的降解曲線；頁
圖7為本發(fā)明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-I菌株對5g/L原油的降解曲線。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的實施不局限于此。
一、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株的獲取與保藏
采集大慶油田的石油長期污染土壤作為微生物源，冷藏運回實驗室。制備含有 500mg/L石油的BSM無機培養(yǎng)基，按照3%的土壤接種量接種于含有IOOmL上述無機培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，(所述BSM無機培養(yǎng)基的無機成分及濃度如下=K2HPO4,0. 5g/L ; ΚΗ2Ρ04，3· 815g/L ； (NH4) 2ΗΡ04，0. 825g/L ；MgCl2 · 6H20，20mg/L ；FeCl3,0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/ L ;Na2S04，200mg/L ;KN03，1. 2625g/L。)鹽酸調(diào) pH 值為 7. 0_7. 2，高壓滅菌鍋 121 °C 滅菌 20min。待培養(yǎng)基溫度降低到30°C左右時，在超凈臺下接種。污泥接種后在30°C、180rpm的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中進(jìn)行富集培養(yǎng)。重復(fù)培養(yǎng)七次后，在固體培養(yǎng)基平板(瓊脂20. 0g/L)上反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至分離出單菌株。之后再將菌株接種入上 述無機培養(yǎng)基內(nèi)馴化，上述操作重復(fù)多次，得到純化的可降解石油類物質(zhì)的SJTD-I菌株，平板劃線圖如圖I所示。SJTD-I菌落呈圓形，隆起，菌落呈黃綠色，透明，邊緣無規(guī)則擴散，產(chǎn)生熒光色素，革蘭氏染色呈陰性， 直或彎的桿菌，單個，無芽孢，好氧，30°C下生長良好，有惡臭氣味。經(jīng)對該菌株的16S rDNA 的鑒定與序列分析，表明該菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。該銅綠假單胞菌SJTD-I菌株已于2012年9月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)保藏，登記入冊編號為CGMCC No. 6584。
二、銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa SJTD-1 菌株的鑒定
將分離出的SJTD-I菌株進(jìn)行16S rDNA序列的擴增、序列測定與數(shù)據(jù)庫比對。利用基因組提取試劑盒(TIANGEN，北京)提取SJTD-I菌株的基因組DNA，之后，利用16S rDNA 片段擴增與檢測試劑盒(Takara，大連)擴增該菌株的16S rDNA片段并測定序列。SJTD-I 菌株的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. I 所不。與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)比對,表明該SJTD-I菌株為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa,菌株為無芽孢桿菌，單個，屬革蘭氏陰性菌，嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)。
三、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株對石油類物質(zhì)(長鏈燒烴和石油)的降解能力
將Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株劃固體培養(yǎng)基平板,30°C過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，分別接種于以500mg/L-5g/L的長鏈烷烴(C14、C16、C18、Cj和石油為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，30°C，120rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。采集不同時間點的2個3ml平行樣品，一個樣品利用紫外分光光度儀(UV-2100spectrophotometer, Unic)測定600nm吸光度值用以表示微生物生長情況，(其中，以C14、C16, C18, C20為單一碳源時菌株的生長曲線如圖2至圖5所示。)另一個樣品中加入1/6體積正己烷(HPLC純)混勻，超聲5min，3000g 離心5min，取上層有機相；重復(fù)兩次，合并萃取液。加入無水Na2SO4混合，加內(nèi)標(biāo)正十五烷 (終濃度100ng/ul)后定容到3ml。采用氣相色譜(GC，Agilent 6850)測定石油烴濃度，色譜柱為DB-5MS capillary柱(0. 25mmX30mX0. 25 μ m)。不同十六燒濃度測定結(jié)果見圖6, 不同原油濃度測定結(jié)果見圖7。SJTD-I菌株可在高達(dá)10g/L的石油及烷烴類物質(zhì)為唯一碳5源的培養(yǎng)基中正常生長，24小時內(nèi)能將初始濃度為500mg/L的C16-C2tl的長鏈烷烴和石油完全分解，36小時可將高達(dá)2g/L的C14、C16, C18, C20的長鏈烷烴和500mg/L石油全部分解；七天對5g/L的原油的分解率大于85%。
序列表
〈110〉上海交通大學(xué)
〈120〉一株銅綠假單胞菌及其獲取方法與應(yīng)用
〈160〉I
<170>PatentIn version
〈210〉I
〈211>1509
<212>DNA
〈213〉銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) SJTD-116S rDNA 序列
<400>1 tgggtttgatcttggttagattgacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcgg60
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gtgactgga1509
權(quán)利要求
1.一株銅綠假單胞菌菌株，命名為SJTD-I，其保藏編號為CGMCC No. 6584。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銅綠假單胞菌，其特征在于，所述銅綠假單胞菌的16SrDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銅綠假單胞菌的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟 A、采集被石油長期污染的土壤作為微生物源； B、以石油為單一碳源，制備含有500mg/L石油的IOOmLBSM無機培養(yǎng)基，用鹽酸調(diào)pH值至 7. 0-7. 2，121°C 滅菌 20min ； C、待培養(yǎng)基溫度降低到30°C左右時，按照3%的土壤接種量在超凈臺下接種； D、30°C、180rpm的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中進(jìn)行富集培養(yǎng)； E、重復(fù)培養(yǎng)七次后，在固體培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至分離出單菌株，之后再將菌株接種入上述無機培養(yǎng)基內(nèi)馴化，上述操作重復(fù)多次，得到純化的銅綠假單胞菌菌株，命名為 SJTD-I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的銅綠假單胞菌的獲取方法，其特征在于所述BSM無機培養(yǎng)基的無機成分及濃度如下=K2HPO4,0. 5g/L ；KH2P04, 3. 815g/L ； (NH4) 2HP04,0 . 8 2 5g/L ；MgCl2 · 6H20, 20mg/L ；FeCl3,0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/L ；Na2S04, 200mg/L ；KN03,1. 2625g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，用于環(huán)境中石油類物質(zhì)的分解與去除。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于所述石油類物質(zhì)包括C10-C30的燒烴和石油。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株銅綠假單胞菌菌株，命名為SJTD-1，其保藏編號為CGMCCNo.6584。本發(fā)明中的銅綠假單胞菌能利用烷烴類物質(zhì)、石油作為唯一碳源生長，在石油污染土壤的修復(fù)中具有較高的應(yīng)用價值。菌株SJTD-1可在濃度高達(dá)10g/L的石油及烷烴類物質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常生長，24小時內(nèi)能將初始濃度為500mg/L的C16-C20的長鏈烷烴或石油完全分解，36小時可將高達(dá)2g/L的C16-C20的長鏈烷烴或500mg/L原油全部分解；七天對5g/L的原油的分解率大于85％。本發(fā)明銅綠假單胞菌SJTD-1能夠快速高效降解石油，對石油污染的土壤具有修復(fù)作用。
文檔編號C12N1/20GK102925391SQ20121043666
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者梁如冰, 劉建華 申請人:上海交通大學(xué)