人源白細(xì)胞介素6的siRNA、重組表達(dá)CAR?T載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人源白細(xì)胞介素6(IL-6)的siRNA、重組表達(dá)CAR-T載體(尤其是一種通過敲減IL-6的用于緩解CRS的CAR-T轉(zhuǎn)基因載體)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤細(xì)胞(高度特異性的細(xì)胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫監(jiān)視”理論，認(rèn)為機(jī)體中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)的突變的腫瘤細(xì)胞可被免疫系統(tǒng)所識(shí)別而清除，為腫瘤免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)[BurnetFM.Immunologicalaspectsofmalignantdisease.Lancet,1967；1:1171-4]。隨后，各種腫瘤免疫療法包括細(xì)胞因子療法、單克隆抗體療法、過繼免疫療法、疫苗療法等相繼應(yīng)用于臨床。2013年一種更先進(jìn)的腫瘤免疫療法---CAR-T療法成功用于臨床，并表現(xiàn)了前所未有的臨床療效。CAR-T，全稱是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。CAR-T療法在臨床上最領(lǐng)先的有諾華的CLT019，采用CLT019治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者，六個(gè)月的腫瘤無進(jìn)展生存率達(dá)到67％，其中最長(zhǎng)的應(yīng)答時(shí)間達(dá)到兩年多?？偛课挥谥袊?guó)上海的上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司與醫(yī)院合作，共治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者36例，其中完全24例，緩解比例達(dá)到66.6％。這是抗癌研究的顛覆性突破。CAR-T細(xì)胞療法可能是最有可能治愈癌癥的手段之一，并被《Science》雜志評(píng)為2013年度十大科技突破之首。CAR-T療法雖然效果顯著，但是在治療過程中會(huì)出現(xiàn)一類特殊的臨床綜合癥，臨床常表現(xiàn)為發(fā)熱，低血壓，寒顫，以及出現(xiàn)與血清中一系列細(xì)胞因子水平顯著升高有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，被稱為細(xì)胞因子釋放綜合癥(CytokineReleaseSyndrome，CRS)。其發(fā)生機(jī)制是由于抗原與T細(xì)胞受體結(jié)合后，激活了T細(xì)胞，T細(xì)胞被激活后釋放了包括IL-6在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子，造成了一種系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)，IL-6信號(hào)通路如圖1所示。如果治療不及時(shí)，很可能引起肺水腫而導(dǎo)致患者死亡。目前臨床上可通過靜脈注射抗組胺類藥物(如撲爾敏)或皮質(zhì)類固醇(如氫化可的松)來抑制炎癥反應(yīng)，但是相應(yīng)的，CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用也被抑制，使得這類患者，有較高的復(fù)發(fā)率，影響CAR-T治療的療效。還有一個(gè)比較可行的方案是使用商品化的托珠單抗來控制CRS的發(fā)生程度。托珠單抗是一種人源化的IL-6受體單克隆抗體(Tocilizumab)，托珠單抗與IL-6受體發(fā)生特異性結(jié)合，阻斷IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減少急性時(shí)相反應(yīng)物、降低鐵調(diào)素產(chǎn)物、減少B細(xì)胞活化、減少骨吸收和軟骨轉(zhuǎn)化，以及抑制T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化，從而有效控制炎癥反應(yīng)。但是托珠單抗也有一些很明顯的缺點(diǎn)，首先是費(fèi)用很高。一支10kg體重劑量的托珠單抗價(jià)格約為2000元RMB，成年患者一般一次要用5支，普通家庭難以承受。其次是使用托珠單抗后，由于封閉了IL-6受體，導(dǎo)致患者后期很容易遭受感染。自從20世紀(jì)90年代以來，研究人員發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA(“dsRNA”)可以用來抑制蛋白表達(dá)。這種沉默基因的能力在治療人類疾病方面具有具有廣泛的潛力，和許多研究人員和商業(yè)實(shí)體目前投入相當(dāng)大的資源在發(fā)展中基于這種技術(shù)的治療方法。從機(jī)制的角度來看，當(dāng)dsRNA進(jìn)入植物和無脊椎動(dòng)物細(xì)胞后，被III型核酸內(nèi)切酶Dicer分解成siRNA?！維harp,RNAinterference-2001,GenesDev.2001,15:485】。III型核糖核酸酶Dicer，將dsRNA分解成帶有2堿基凸出3’粘性末端的19-23bp的siRNA?！綛ernstein,Caudy,Hammond,&Hannon,RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference,Nature2001,409:363】。siRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)整合，復(fù)合體中一個(gè)或多個(gè)解旋酶解開雙鏈siRNA，使互補(bǔ)反義鏈引導(dǎo)靶點(diǎn)識(shí)別?！綨ykanen,Haley,&Zamore,ATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferencepathway,Cell2001,107:309】。在結(jié)合相應(yīng)的目標(biāo)mRNA后，RISC復(fù)合物中的一個(gè)或多個(gè)核酸內(nèi)切酶切割目標(biāo)mRNA引起mRNA沉默?！綞lbashir，Elbashir,Lendeckel,&Tuschl,RNAinterferenceismediatedby21-and22-nucleotideRNAs,GenesDev2001,15:188】。這種干擾效應(yīng)可以持續(xù)很久，而且在細(xì)胞分裂后仍然有效。并且，RNAi具有非常好的序列特異性【Kisielow,M.etal.(2002)Isoform-specificknockdownandexpressionofadaptorproteinShcAusingsmallinterferingRNA,J.ofBiochemistry363:1-5】。因此，RNAi系統(tǒng)可以特異性敲減一種類型的轉(zhuǎn)錄本，而不影響序列相近的其它mRNA。這些特性使siRNA系統(tǒng)在抑制基因表達(dá)、基因功能研究和藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證方面表現(xiàn)出潛力和價(jià)值。此外，siRNA系統(tǒng)可以用來治療相關(guān)疾病，包括(1)基因過表達(dá)或錯(cuò)誤表達(dá)引起的疾??；(2)的基因突變引起的疾病。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種人源白細(xì)胞介素6的siRNA、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明的第一目的在于提供一種人源白細(xì)胞介素6的siRNA，所述siRNA選自下述中的a-h中的任一對(duì)：a.SEQIDNO.43和SEQIDNO.44所示的核苷酸序列；b.SEQIDNO.45和SEQIDNO.46所示的核苷酸序列；c.SEQIDNO.47和SEQIDNO.48所示的核苷酸序列；d.SEQIDNO.49和SEQIDNO.50所示的核苷酸序列；e.SEQIDNO.51和SEQIDNO.52所示的核苷酸序列；f.SEQIDNO.53和SEQIDNO.54所示的核苷酸序列；g.SEQIDNO.55和SEQIDNO.56所示的核苷酸序列；h.SEQIDNO.57和SEQIDNO.58所示的核苷酸序列。進(jìn)一步的，優(yōu)選b.SEQIDNO.45和SEQIDNO.46所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第二目的在于提供上述siRNA在制備治療緩解細(xì)胞因子釋放綜合癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三目的在于提供一種包含上述siRNA的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒表達(dá)載體或質(zhì)粒；優(yōu)選的，包含上述siRNA的慢病毒表達(dá)載體。進(jìn)一步的，所述的慢病毒表達(dá)載體包括：用于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于目的菌株大量擴(kuò)增的含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQIDNO.1所示；用于增強(qiáng)真核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子SV40Ori序列，如SEQIDNO.3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白，如SEQIDNO.11所示；用于共同轉(zhuǎn)錄表達(dá)蛋白質(zhì)的IRES核糖體結(jié)合序列，如SEQIDNO.12所示；用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn)錄的人EF1α啟動(dòng)子，如SEQIDNO.14所示；用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR或三代CAR的抗CD19嵌合抗原受體的編碼基因，如SEQIDNO.52或SEQIDNO.53所示；用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率的eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，如SEQIDNO.13所示；用于胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的人RNA聚合酶III啟動(dòng)子hU6，如SEQIDNO.14所示。進(jìn)一步的，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag順式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE順式元件、如SEQIDNO.9所示的env順式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT順式元件。進(jìn)一步的，所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag順式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE順式元件、如SEQIDNO.9所示的env順式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQIDNO.4所示的RSV啟動(dòng)子。進(jìn)一步的，所述eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個(gè)核苷酸的增強(qiáng)突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。進(jìn)一步的，所述抗CD19嵌合抗原受體(二代CAR)，包括依次串聯(lián)的如SEQIDNO.16所示的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、如SEQIDNO.17所示的CD19單鏈抗體輕鏈VL、如SEQIDNO.18所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.19所示的CD19單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDNO.20所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQIDNO.21所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQIDNO.22所示的CD137嵌合受體共刺激因子，以及如SEQIDNO.23所示的TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。進(jìn)一步的，所述抗CD19嵌合抗原受體(三代CAR)，包括依次串聯(lián)的如SEQIDNO.16所示的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、、如SEQIDNO.17所示的CD19單鏈抗體輕鏈VL、如SEQIDNO.18所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.19所示的CD19單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDNO.20所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQIDNO.21所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQIDNO.24所示的CD28嵌合受體共刺激因子、如SEQIDNO.22所示的CD137嵌合受體共刺激因子以及如SEQIDNO.23所示的TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。本發(fā)明的第四目的在于提供一種包含上述siRNA的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)將含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列(如SEQIDNO.1所示)、原核復(fù)制子pUCOri序列(如SEQIDNO.2所示)、病毒復(fù)制子SV40Ori序列(如SEQIDNO.3所示)、用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件、ZsGreen1綠色熒光蛋白(如SEQIDNO.11所示)、IRES核糖體結(jié)合序列(如SEQIDNO.12所示)、eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(如SEQIDNO.13所示)、人RNA聚合酶III啟動(dòng)子hU6(如SEQIDNO.14所示)存儲(chǔ)于慢病毒骨架質(zhì)粒(pLenti-3Gsilencer)上；(2)將人EF1α啟動(dòng)子(如SEQIDNO.15所示)、用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR或三代CAR的抗CD19嵌合抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設(shè)計(jì)方案，經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒中，得到二代CAR或三代CAR設(shè)計(jì)的重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-silencer；(3)將上述siRNA以及如SEQIDNO.41和SEQIDNO.42所示的negativecontrol序列，分別克隆至步驟(2)所得的重組慢病毒質(zhì)粒中，得到IL-6敲減重組慢病毒質(zhì)粒(pCAR19-1762～pCAR19-1769和negativecontrol的pCAR19-1761)；(4)將步驟(3)得到的重組慢病毒質(zhì)粒(pCAR19-1761～pCAR19-1769)分別與慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白質(zhì)粒pEnv-G共同轉(zhuǎn)染HEK293T/17細(xì)胞，在HEK293T/17細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)后，包裝成功重組慢病毒載體會(huì)釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；(5)將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的離子交換方式進(jìn)行純化，分別得到重組慢病毒載體。進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag順式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE順式元件、如SEQIDNO.9所示的env順式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT順式元件；所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag順式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE順式元件、如SEQIDNO.9所示的env順式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQIDNO.4所示的RSV啟動(dòng)子。進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR的抗CD19嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的如SEQIDNO.16所示的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、如SEQIDNO.17所示的CD19單鏈抗體輕鏈VL、如SEQIDNO.18所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.19所示的CD19單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDNO.20所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQIDNO.21所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQIDNO.22所示的CD137嵌合受體共刺激因子，以及如SEQIDNO.23所示的TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域；所述用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的三代CAR的抗CD19嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的如SEQIDNO.16所示的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、、如SEQIDNO.17所示的CD19單鏈抗體輕鏈VL、如SEQIDNO.18所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.19所示的CD19單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDNO.20所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQIDNO.21所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQIDNO.24所示的CD28嵌合受體共刺激因子、如SEQIDNO.22所示的CD137嵌合受體共刺激因子以及如SEQIDNO.23所示的TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個(gè)核苷酸的增強(qiáng)突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。進(jìn)一步的，步驟(2)中，由人EF1α啟動(dòng)子啟動(dòng)整個(gè)CAR基因表達(dá)；CD8leader嵌合受體信號(hào)肽位于CAR編碼序列的N端，用于引導(dǎo)CAR蛋白定位于細(xì)胞膜；CD19單鏈抗體輕鏈VL、OptimalLinkerC、CD19單鏈抗體重鏈VH組合成scfv區(qū)域，用于識(shí)別CD19抗原；CD8Hinge嵌合受體鉸鏈用于將scfv錨定于細(xì)胞膜外側(cè)；CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)用于將整個(gè)嵌合受體固定于細(xì)胞膜上；CD137嵌合受體共刺激因子用于刺激T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌；TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域用于激活下游信號(hào)通路的表達(dá)；當(dāng)scfv區(qū)域與CD20抗原結(jié)合時(shí)，信號(hào)通過嵌合受體傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生包括T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加、抗細(xì)胞凋亡蛋白分泌增加、細(xì)胞死亡延遲、裂解靶細(xì)胞的一系列生物學(xué)效應(yīng)。進(jìn)一步的，步驟(4)中，所述慢病毒載體有帶熒光標(biāo)簽zsGreen1的版本和不帶熒光標(biāo)簽zsGreen1版本，帶熒光標(biāo)簽的版本用于體外實(shí)驗(yàn)，不帶熒光標(biāo)簽的版本用于臨床實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步的，步驟(4)中，所述抽濾步驟控制上清體積在200ml～2000ml，真空度控制在-0.5MPA～-0.9MPA，防止由于堵孔帶來的載體損失；所述吸附步驟控制溶液的PH值在6～8，防止PH的變化導(dǎo)致載體失活；所述洗脫步驟控制洗脫液的離子強(qiáng)度在0.5M～1.0M，防止離子強(qiáng)度的變化導(dǎo)致洗脫不完全或者載體失活。本發(fā)明的第五目的在于提供包含上述siRNA的重組表達(dá)載體在制備CAR-T治療過程中由IL6釋放引起的炎癥細(xì)胞因子綜合癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第六目的在于提供一種CART細(xì)胞，所述的CAR-T細(xì)胞是由上述siRNA修飾的T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明的再一目的在于提供上述CAR-T細(xì)胞在制備B淋巴瘤、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤、骨髓瘤治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是將人RNA聚合酶III啟動(dòng)子hU6、人EF1α啟動(dòng)子、CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、CD19單鏈抗體輕鏈VL、OptimalLinkerC、CD19單鏈抗體重鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域構(gòu)建進(jìn)入重組慢病毒載體，由人EF1α啟動(dòng)子啟動(dòng)整個(gè)CAR基因表達(dá)。CAR蛋白定位于細(xì)胞膜表面，識(shí)別CD19抗原，刺激T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，激活下游信號(hào)通路的表達(dá)。當(dāng)scfv區(qū)域與CD19抗原結(jié)合時(shí)，信號(hào)通過嵌合受體傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加、抗細(xì)胞凋亡蛋白分泌增加、細(xì)胞死亡延遲、裂解靶細(xì)胞等一系列生物學(xué)效應(yīng)。由人RNA聚合酶III啟動(dòng)子hU6啟動(dòng)siRNA的表達(dá)，通過RISCcomplex的作用，降解IL-6mRNA，抑制IL-6的合成與分泌，達(dá)到抑制CRS的效果。本發(fā)明所采用的表達(dá)載體包括原核復(fù)制子(pUCori)用于質(zhì)粒復(fù)制；原核篩選標(biāo)記(AmpR)用于目的菌株大量擴(kuò)增；病毒復(fù)制子(SV40Ori)用于增強(qiáng)真核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制；慢病毒包裝順式元件(RSV、5terminalLTR、3terminalSelf-InactivatingLTR、Gag、RRE、env、cPPT)用于慢病毒包裝；人RNA聚合酶III啟動(dòng)子(hU6)用于胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA；真核熒光標(biāo)簽蛋白(ZsGreen1)用于真核細(xì)胞表達(dá)綠色熒光；共表達(dá)元件(IRES)用于共同轉(zhuǎn)錄表達(dá)蛋白質(zhì)；真核啟動(dòng)子(EF1α)用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn)錄；嵌合抗原受體(CD8leader、CD19VL、OptimalLinkerC(SEQIDNO.19)、CD19VH、CD8Hinge、CD8Transmembrane、CD137、TCR)用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代和三代CAR；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(eWPRE)用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。本發(fā)明涉及含肽的醫(yī)藥配置品，具體涉及：一、人RNA聚合酶III啟動(dòng)子hU6、含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列、原核復(fù)制子pUCOri序列,、病毒復(fù)制子SV40Ori序列、RSV啟動(dòng)子、人EF1α啟動(dòng)子、慢病毒5terminalLTR、慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、IRES核糖體結(jié)合序列、ZsGreen1綠色熒光蛋白、WPRE土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的重組慢病毒載體骨架，這種重組慢病毒載體骨架可以搭載不同的治療性基因并廣泛的用于過繼性細(xì)胞治療領(lǐng)域，搭載不同的siRNA并廣泛的用于基因過表達(dá)、錯(cuò)誤表達(dá)和基因突變引起的疾病。二、重組慢病毒載體骨架、IL6-siRNA、CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、CD19單鏈抗體輕鏈VL、單鏈抗體鉸鏈LinkerA、單鏈抗體鉸鏈LinkerB、單鏈抗體鉸鏈LinkerC、CD19單鏈抗體重鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD28嵌合受體共刺激因子、CD137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域構(gòu)建形成重組慢病毒載體，該方法得到的重組慢病毒載體可以實(shí)現(xiàn)在人T淋巴細(xì)胞上表達(dá)CD19嵌合抗原受體，引導(dǎo)并激活T淋巴細(xì)胞對(duì)CD19陽性細(xì)胞的殺傷作用，在臨床上用于治療B淋巴細(xì)胞白血病、B淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。在人T淋巴細(xì)胞內(nèi)表達(dá)白介素-6(IL-6)的siRNA，有效降低白介素-6的表達(dá)水平，臨床上可用于緩解細(xì)胞因子釋放綜合癥(CytokineReleaseSyndrome，CRS)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的siRNA序列含有21個(gè)bp的核苷酸，采用N2[CG]N8[AU]N8[AU]N2的寡核苷酸排列模式，互補(bǔ)序列之間采用stem-loop的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，通過siRNApattern、GCpercentage、TorAorGinarow、consecutiverGC、3’endntpattern、thermodynamicvalue、siRNAtarget、identity、alignment等條件的篩選，大大提高siRNA設(shè)計(jì)的干擾成功率。本發(fā)明所采用的人RNA聚合酶III啟動(dòng)子hU6轉(zhuǎn)錄siRNA，抑制IL-6表達(dá)的系統(tǒng)，在T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過QPCR檢測(cè)，能有效抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，經(jīng)過CBA檢測(cè)，能有效減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-6表達(dá)水平，將來可以在體內(nèi)抑制IL-6表達(dá)水平，減輕CRS的癥狀。本發(fā)明采用慢病毒載體方式遞送siRNA(如圖2所示)。首先，節(jié)約了成本，避免siRNA體外合成的昂貴費(fèi)用。其次，避免了siRNA的在體遞送效率低的問題。第三，使用人RNA聚合酶III啟動(dòng)子hU6表達(dá)siRNA，能夠有效利用細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄體系，大量表達(dá)出相應(yīng)的siRNA，經(jīng)過一系列的酶促作用，達(dá)到良好的基因沉默效果。本發(fā)明所采用的載體骨架為第三代慢病毒載體(如圖3A所示)，3’SINLTR去除了U3區(qū)域，消除了慢病毒載體自我復(fù)制的可能性，大大提高了安全性；增加了cPPT和WPRE元件，提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率；采用RSV啟動(dòng)子保證了慢病毒載體包裝時(shí)核心RNA的持續(xù)高效轉(zhuǎn)錄；采用人自身的EF1α啟動(dòng)子，使CAR基因能夠在人體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)。本發(fā)明所采用的siRNA敲減方案，同樣可以應(yīng)用于第三代CAR設(shè)計(jì)方案。第三代CAR設(shè)計(jì)與第二代設(shè)計(jì)相比，增加了CD28嵌合受體共刺激因子(SEQIDNO.24)。本發(fā)明所采用的慢病毒載體柱純化系統(tǒng)(如圖8所示)，系本公司開發(fā)出的慢病毒規(guī)?；a(chǎn)工藝。常用的超速離心法或者高速離心法，是利用離心沉降原理分離慢病毒顆粒，不可避免的會(huì)殘留很多沉降系數(shù)相近的雜質(zhì)，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)帶來不利影響。并且，裝管過程復(fù)雜、操作繁瑣、多次轉(zhuǎn)換容器帶來更多的污染機(jī)會(huì)。而本發(fā)明的慢病毒載體柱純化工藝為半自動(dòng)化操作，全部過程在百級(jí)實(shí)驗(yàn)區(qū)域完成，避免人工操作的繁瑣和污染幾率，所回收的慢病毒載體在內(nèi)毒素、支原體等指標(biāo)上完全達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)。后續(xù)可跟進(jìn)開發(fā)全自動(dòng)純化儀。本發(fā)明所采用CAR設(shè)計(jì)方案也可以應(yīng)用于第二代慢病毒載體結(jié)構(gòu)上。第二代和第三代慢病毒載體在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別(如圖3B所示)，主要是第三代慢病毒載體把第二代載體5’LTR的U3區(qū)域替換為RSV啟動(dòng)子，這樣就消除了U3轉(zhuǎn)錄時(shí)對(duì)Tat蛋白的依賴，既可以在慢病毒的結(jié)構(gòu)基因里去除Tat序列，也提高了慢病毒基因組轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄持續(xù)性。第二代和第三代慢病毒載體主要是基因組轉(zhuǎn)錄方式的區(qū)別，因此本發(fā)明所采用CAR設(shè)計(jì)方案可以應(yīng)用于這兩代慢病毒載體。本發(fā)明的第三代慢病毒骨架質(zhì)粒，采用enhancedWPRE元件，與賓州大學(xué)CarlH.June等人(PorterDL,LevineBL,KalosM,BaggA,JuneCH.ChimericantigenreceptormodifiedTcellsinchroniclymphoidleukemia.NEnglJMed2011；365:725-33.)所采用的WPRE元件相比，有6個(gè)核苷酸的增強(qiáng)突變(g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T)，能夠增強(qiáng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多聚腺苷化，增加細(xì)胞內(nèi)mRNA的含量，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。本發(fā)明的Lentival包裝系統(tǒng)是無輔助病毒的四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，通過四種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至HEK293T/17細(xì)胞中，產(chǎn)生重組慢病毒載體。重組后的慢病毒載體是復(fù)制缺陷型載體，能將外源片段整合入宿主基因，一次性使用，無法復(fù)制和增殖，安全性有很大提高。本發(fā)明采用的慢病毒載體有帶熒光標(biāo)簽zsGreen1的版本和不帶熒光標(biāo)簽zsGreen1版本，帶熒光標(biāo)簽的版本用于體外實(shí)驗(yàn)，不帶熒光標(biāo)簽的版本用于臨床實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明采用的scfv段的Linker設(shè)計(jì)，能夠顯著提高細(xì)胞因子的分泌、CAR-T細(xì)胞的體外殺傷作用以及臨床治療效果。可見，本發(fā)明所述的重組慢病毒載體在給急性B淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的CAR-T治療提供可靠轉(zhuǎn)基因保障的同時(shí)，可以極大的降低發(fā)生CRS的風(fēng)險(xiǎn)，減輕患者的痛苦。本發(fā)明所述的IL-6敲減siRNA表達(dá)框及其siRNA表達(dá)產(chǎn)物，不僅可以應(yīng)用于CAR19-T治療急性B淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中用于消除或減輕CRS的癥狀，還可應(yīng)用于緩解CAR-T治療諸如B淋巴瘤、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤、骨髓瘤等等所有類型腫瘤時(shí)引起的CRS癥狀，甚至還可以應(yīng)用于緩解其他類型的治療引起的CRS。附圖說明圖1是本發(fā)明所述的IL-6信號(hào)通路示意圖；圖2是本發(fā)明所述的慢病毒遞送siRNA方式示意圖；圖3是本發(fā)明所述的慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；其中,圖3(A)是本發(fā)明采用的第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖，圖3(B)是第二代和第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)比較；圖4是本發(fā)明所述的重組慢病毒載體的構(gòu)建流程圖；其中，(A)圖是慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3Gsilencer的結(jié)構(gòu)示意圖；(B)圖是pCAR19-silencer質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；(C)圖是pCAR19-1761～pCAR19-1769質(zhì)粒的示意圖；(D)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP的結(jié)構(gòu)示意圖；(E)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-R的結(jié)構(gòu)示意圖；(F)圖是膜蛋白pEnv-G的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5是慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3Gsilencer的酶切預(yù)測(cè)及酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，圖5A是慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3Gsilencer的酶切預(yù)測(cè)示意圖，其中，lane1是1kbDNAladderMarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pLenti-3Gsilencer的ClaI+BamHI酶切預(yù)測(cè)：條帶從上到下依次為：7381bp，23bp；圖5B是慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3Gsilencer的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，lane1是pLenti-3Gsilencer的ClaI+BamHI酶切電泳結(jié)果；lane2是1kbDNAladderMarker的電泳結(jié)果；圖6是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-silencer的酶切預(yù)測(cè)及酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，圖6A是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-silencer的酶切預(yù)測(cè)示意圖，其中，lane1是1kbDNAladderMarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pCAR19-silencer的KpnI酶切預(yù)測(cè)：條帶從上到下依次為：8335bp、1708bp；圖6B是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-silencer的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，lane1是1kbDNAladderMarker的電泳結(jié)果；lane2是pCAR19-silencer的KpnI酶切電泳結(jié)果；圖7是IL-6敲減重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-1761～pCAR19-1769的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；其中，A是pCAR19-1761的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；B是pCAR19-1762的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；C是pCAR19-1763的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；D是pCAR19-1764的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；E是pCAR19-1765的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；F是pCAR19-1766的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；G是pCAR19-1767的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；H是pCAR19-1768的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；I是pCAR19-1769的測(cè)序比對(duì)結(jié)果；圖8是離子交換色譜法純化重組慢病毒載體的流程圖；圖9是重組慢病毒載體的滴度檢測(cè)結(jié)果；圖10是重組慢病毒載體的不同純化方式的支原體檢測(cè)結(jié)果，lane1為DL2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2為陽性對(duì)照；lane3為陰性對(duì)照；lane4為PBS；lane5為水；lane6為lvCAR19-1761；lane7為lvCAR19-1762；lane8為lvCAR19-1763；lane9為lvCAR19-1764；lane10為lvCAR19-1765；lane11為lvCAR19-1766；lane12為lvCAR19-1767；lane13為lvCAR19-1768；lane14為lvCAR19-1769；圖11為mRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖；圖12為CAR蛋白表達(dá)量的WB檢測(cè)圖；其中，圖12A，lane1為PBMC空細(xì)胞，lane2為對(duì)照病毒MOCK，lane3為lvCAR19-1761，lane4為lvCAR19-1762，lane5為lvCAR19-1763，lane6為lvCAR19-1764，lane7為lvCAR19-1765，lane8為lvCAR19-1766，lane9為lvCAR19-1767，lane10為lvCAR19-1768，lane11為lvCAR19-1769；圖12B，是beta-actin內(nèi)參條帶；圖13為IL-6敲減重組慢病毒lvCAR19-1761～lvCAR19-1769與靶細(xì)胞孵育后，4h和24h上清中CBA的檢測(cè)結(jié)果；圖13A是4h的CBA檢測(cè)結(jié)果；圖13B是24h的CBA檢測(cè)結(jié)果；圖14為不同效應(yīng)細(xì)胞分別與靶細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，4h和24h上清中IL-6含量的變化情況；圖15為不同效應(yīng)細(xì)胞分別與靶細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，24hmRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況；圖16為不同效應(yīng)細(xì)胞分別與靶細(xì)胞以10:1的比例共培養(yǎng)條件下，24h后檢測(cè)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷情況，E為效應(yīng)細(xì)胞，T為靶細(xì)胞。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1構(gòu)建重組慢病毒載體一、材料1、慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3Gsilencer，慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白質(zhì)粒pEnv-G，HEK293T/17細(xì)胞、同源重組酶、OligoAnnealingBuffer由世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司提供；2、引物：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA片段和靶位點(diǎn)所需的引物，具體為：EF1α-F：5’-ATTCAAAATTTTATCGATGCTCCGGTGCCCGTCAGT-3’(SEQIDNO.25)EF1α-R：5’-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3’(SEQIDNO.26)CD8leader-F：5’-GGTGTCGTGAGGATCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC-3’(SEQIDNO.27)CD8leader-R：5’-GTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTG-3’(SEQIDNO.28)VL-F：5’-CACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATC-3’(SEQIDNO.29)VL-R：5’-TGTGATCTCCAGCTTGGTCC-3’(SEQIDNO.30)OLC-VH-F：5’-CAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCA-3’(SEQIDNO.31)VH-R：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3’(SEQIDNO.32)CD8Hinge-F：5’-AGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCC-3’(SEQIDNO.33)CD8Hinge-R：5’-GTAGATATCACAGGCGAAGTCCA-3’(SEQIDNO.34)CD8Transmembrane-F：5’-CGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGC-3’(SEQIDNO.35)CD8Transmembrane-R：5’-TCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTG-3’(SEQIDNO.36)CD137-F：5’-AAACGGGGCAGAAAGAAACTC-3’(SEQIDNO.37)CD137-R：5’-TGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3’(SEQIDNO.38)TCR-F：5’-AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCG-3’(SEQIDNO.39)TCR-R：5’-GGAGAGGGGCGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGC-3’(SEQIDNO.40)siRNA1761-F(negativecontrol)：5’-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3’(SEQIDNO.41)siRNA1761-R(negativecontrol)：5’-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-3’(SEQIDNO.42)siRNA1762-F：5’-CCGGGTGAAGCTGAGTTAATTTATGCTCGAGTAAATTAACTCAGCTTCACATTTTTTTG-3’(SEQIDNO.43)siRNA1762-R：5’-AATTCAAAAAAATGTGAAGCTGAGTTAATTTACTCGAGCATAAATTAACTCAGCTTCAC-3’(SEQIDNO.44)siRNA1763-F：5’-CCGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCTCGAGAACAACATAAGTTCTGTGCCCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.45)siRNA1763-R：5’-AATTCAAAAAAGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCGAGAGAACAACATAAGTTCTGTGC-3’(SEQIDNO.46)siRNA1764-F：5’-CCGGCTCAGATTGTTGTTGTTAATGCTCGAGTTAACAACAACAATCTGAGGTTTTTTTG-3’(SEQIDNO.47)siRNA1764-R：5’-AATTCAAAAAAACCTCAGATTGTTGTTGTTAACTCGAGCATTAACAACAACAATCTGAG-3’(SEQIDNO.48)siRNA1765-F：5’-CCGGGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCCTCGAGAGGAACTCCTTAAAGCTGCGCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.49)siRNA1765-R：5’-AATTCAAAAAAGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTCTCGAGGCAGGAACTCCTTAAAGCTGC-3’(SEQIDNO.50)siRNA1766-F：5’-CCGGGTGTAGGCTTACCTCAAATAACTCGAGATTTGAGGTAAGCCTACACTTTTTTTTG-3’(SEQIDNO.51)siRNA1766-R：5’-AATTCAAAAAAAAGTGTAGGCTTACCTCAAATCTCGAGTTATTTGAGGTAAGCCTACAC-3’(SEQIDNO.52)siRNA1767-F：5’-CCGGCTCAAATAAATGGCTAACTTACTCGAGAGTTAGCCATTTATTTGAGGTTTTTTTG-3’(SEQIDNO.53)siRNA1767-R：5’-AATTCAAAAAAACCTCAAATAAATGGCTAACTCTCGAGTAAGTTAGCCATTTATTTGAG-3’(SEQIDNO.54)siRNA1768-F：5’-CCGGGATGCTTCCAATCTGGATTCACTCGAGAATCCAGATTGGAAGCATCCATTTTTTG-3’(SEQIDNO.55)siRNA1768-R：5’-AATTCAAAAAATGGATGCTTCCAATCTGGATTCTCGAGTGAATCCAGATTGGAAGCATC-3’(SEQIDNO.56)siRNA1769-F：5’-CCGGCTTCCAATCTGGATTCAATGACTCGAGATTGAATCCAGATTGGAAGCATTTTTTG-3’(SEQIDNO.57)siRNA1769-R：5’-AATTCAAAAAATGCTTCCAATCTGGATTCAATCTCGAGTCATTGAATCCAGATTGGAAG-3’(SEQIDNO.58)WPRE-QPCR-F：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(SEQIDNO.59)WPRE-QPCR-R：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(SEQIDNO.60)Actin-QPCR-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(SEQIDNO.61)Actin-QPCR-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQIDNO.62)CAR-QPCR-F：5’-GACTTGTGGGGTCCTTCTCCT-3’(SEQIDNO.63)CAR-QPCR-R：5’-GCAGCTACAGCCATCTTCCTC-3’(SEQIDNO.64)IL6-QPCR-F：5’-GGATTCAATGAGGAGACTT-3’(SEQIDNO.65)IL6-QPCR-R：5’-ATCTGTTCTGGAGGTACT-3’(SEQIDNO.66)3、SEQIDNO.15～SEQIDNO.66所示的DNA序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者質(zhì)粒形式保存；4、工具酶BspEI、EcoRI、BamHI、KpnI、ClaI、T4DNA連接酶均購自NEB公司；5、高保真酶PrimeSTAR、RN購自Takara公司；6、0.22μm-0.8μmPES濾器購自millipore公司；7、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自MN公司；8、感受態(tài)細(xì)胞TOP10購自tiangen公司；9、NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、Trypsin、EDTA、CaCl2、NaOH、PEG6000均購自上海生工；10、Opti-MEM、FBS、DMEM、1640、Pen-Srep、Hepes、購自invitrogen公司；11、BiotinylatedproteinL購自GeneScript公司；13、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、DAB工作液均購自北京中杉金橋；13、ECL+plusTMWesternblottingsystem購自Amersham公司；14、DNeasy試劑盒購自上海捷瑞公司；15、淋巴細(xì)胞分離液購自深圳達(dá)科為公司；16、phycoerythrin(PE)-conjugatedstreptavidin、CBAkit購自BDBioscience公司；17、SA-HRP購自上海翊圣公司；18、支原體檢測(cè)試劑盒、內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒、CD19+K562細(xì)胞購自世翱(上海)公司；19、LDH檢測(cè)試劑盒購自promega公司；二、重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769的構(gòu)建方法。參見圖4，本發(fā)明所述重組慢病毒載體的構(gòu)建方法如下：1、將人EF1α啟動(dòng)子、CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、CD19單鏈抗體輕鏈VL、OptimalLinkerC、CD19單鏈抗體重鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域片段克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3Gsilencer，得到重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-silencer，再將siRNA片段分別連接到pCAR19-silencer中，得到IL-6敲減重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-1761～pCAR19-1769。(1)將慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3Gsilencer使用ClaI和BamHI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)7381bp的片段V1(圖5所示)，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；1、溶膠按200μlNTI/100mggel比例加入溶膠液，50℃水浴放置5-10分鐘。2、結(jié)合DNA11000g離心30秒，棄去濾液。3、洗膜加入700μlNT3，11000g離心30秒，棄去濾液。4、洗膜重復(fù)第三步一次5、晾干11000g離心1分鐘，換新的收集管，室溫放置1分鐘。6、洗脫DNA加入15-30μlNE，室溫放置1分鐘，11000g離心1分鐘，收集濾液。表1瓊脂糖凝膠回收步驟(2)用引物EF1α-F和EF1α-R以合成的SEQIDNO.15為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)1208bp的片段a，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；表250μlPCR反應(yīng)體系(3)用引物CD8leader-F和CD8leader-R以合成的SEQIDNO.16為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)101bp的片段b，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(4)用引物VL-F和VL-R以合成的SEQIDNO.17為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)336bp的片段c，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(5)用引物OLC-VH-F和VH-R以合成的SEQIDNO.19為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)421bp的片段d，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(6)用引物CD8Hinge-F和CD8Hinge-R以合成的SEQIDNO.20為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)147bp的片段e，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(7)用引物CD8Transmembrane-F和CD8Transmembrane-R以合成的SEQIDNO.21為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)100bp的片段f，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(8)用引物CD137-F和CD137-R以合成的SEQIDNO.22為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)142bp的片段g，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(9)用引物TCR-F和TCR-R以合成的SEQIDNO.23為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)355bp的片段h，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(10)將DNA片段b、c、d各1μl作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf管內(nèi)，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，60℃10sec，72℃30sec)*6cycle，加入引物CD8leader-F/VH-R,(98℃10sec，60℃10sec，72℃40sec)*24cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)814bp的片段i，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；試劑體積(μl)H2O33.5-1*模板數(shù)5×Buffer(withMg2+)10dNTP(各2.5mM)4Primer1(+)(10μM)1Primer2(－)(10μM)1Template1*模板數(shù)PrimeSTAR0.5表350μl重疊PCR反應(yīng)體系(11)將DNA片段e、f、g、h各1μl作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf管內(nèi)，PCR循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，60℃10sec，72℃30sec)*6cycle，加入引物CD8Hinge-F/TCR-R,(98℃10sec，60℃10sec，72℃30sec)*24cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)704bp的片段j，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(12)將DNA片段V1、a、i、j以5μl總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μl，混勻后在42℃孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反應(yīng)液加入50μlTOP10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μlLB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μl的轉(zhuǎn)化菌液涂布于AmpLB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時(shí)。挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-silencer，對(duì)正確的克隆進(jìn)行酶切鑒定(見圖6)；(13)將重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-silencer使用BspEI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)10029bp的片段V2，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(14)將合成好的siRNA1761-F/R～siRNA1769-F/R分別用oligoannealingbuffer溶解成20μM，對(duì)應(yīng)的F和R各取30μl混合。然后將siRNA1761-F&R～siRNA1769-F&R混合物在水浴鍋中95℃加熱5分鐘，然后水浴鍋開蓋置室溫中自然冷卻至室溫，形成雙鏈寡核苷酸片段。取1μl用于的連接反應(yīng)(見表4)，4℃連接16h，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反應(yīng)液加入50μlTOP10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μlLB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μl的轉(zhuǎn)化菌液涂布于AmpLB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時(shí)。挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆即為IL-6敲減重組慢病毒質(zhì)粒pCAR19-1761～pCAR19-1769，對(duì)正確的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定(見圖7)。試劑體積(μl)H2O13V2310×T4DNAligaseBuffer2T4DNAligase1退火的雙鏈寡核苷酸1表420μl連接反應(yīng)體系2、重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769的包裝。(1)完全培養(yǎng)基：取出預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基，加入10％FBS+5mlPen-Srep，上下顛倒混勻即可；(2)1XPBS溶液：稱量NaCl8g，KCl0.2，Na2HPO4.12H2O3.58g，KH2PO40.24g置于1000ml燒杯中，加入900mlMilli-Qgrade超純水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高溫濕熱滅菌20min；(3)0.25％Trypsin溶液:稱量Trypsin2.5g，EDTA0.19729g置于1000ml燒杯中，加入900ml1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μM過濾除菌，長(zhǎng)期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5MCaCl2溶液：稱量36.75gCaCl2用400mlMilli-Qgrade超純水溶解；用Milli-Qgrade超純水將總體積定容至500ml，混勻；0.22μm過濾除菌，分裝保存到50ml離心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2XHBS溶液：稱量4.09gNaCl，0.269gNa2HPO4，5.96gHepes，用400mlMilli-Qgrade超純水溶解；校準(zhǔn)pH儀后，用2MNaOH溶液將HBS溶液的pH調(diào)到7.05。調(diào)整每瓶HBS的PH消耗2MNaOH為3ml左右；(6)從液氮罐中取出凍存的HEK293T/17細(xì)胞，迅速轉(zhuǎn)移到37℃水浴中，1～2min后轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉(zhuǎn)移至10cm2培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足含10％FBS的DMEM至8mL/10cm2dish，24h后顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞匯合的程度大于80％進(jìn)行傳代；(7)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、無污染的HEK293T/17細(xì)胞，每2-6個(gè)培養(yǎng)皿為一組，將細(xì)胞胰酶消化后，用電動(dòng)移液器吸取4-12ml完全培養(yǎng)基，向每個(gè)消化后的培養(yǎng)皿中加2ml，避免培養(yǎng)皿變干；使用1ml移液器將所有細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中；(8)將上述2-6個(gè)培養(yǎng)皿中的剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中，并用培養(yǎng)基再?zèng)_洗一便培養(yǎng)皿；(9)蓋緊培養(yǎng)基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細(xì)胞懸液，將細(xì)胞傳到8-24個(gè)10cm2培養(yǎng)皿中，每皿的細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)約4×106個(gè)/10ml完全培養(yǎng)基左右。如果細(xì)胞密度和預(yù)期的相差較大，則需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后按照4×106個(gè)/皿的量接種；(10)每6個(gè)培養(yǎng)皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養(yǎng)皿左右，前后晃動(dòng)數(shù)次，使細(xì)胞充分鋪開，然后放入5％CO2培養(yǎng)箱。剩余細(xì)胞做同樣處理；(11)檢查所傳代細(xì)胞，細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為70-80％，輪廓飽滿，貼壁良好，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中均勻分布；(12)為細(xì)胞換液，將培養(yǎng)基替換為新鮮完全培養(yǎng)基,每皿9ml，并將培養(yǎng)箱的CO2濃度設(shè)定值提高到8％；(13)按照N+0.5配DNA/CaCl2溶液。每皿HEK293T/17細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量按照下列比例使用：重組慢病毒質(zhì)粒(20μg),pPac-GP(15μg)，pPac-R(10μg),pEnv-G(7.5μg)。取一個(gè)新的5ml離心管，加入0.5MCaCl2：0.25ml，重組慢病毒質(zhì)粒20μg：pPac-GP15μg：pPac-R10μg：pEnv-G7.5μg，補(bǔ)充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；(14)另取一支5ml離心管，加入0.5mlDNA/CaCl2溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動(dòng)，另一只手拿一把1mL移液槍，吸取0.5mL2×HBS溶液，緩慢滴加進(jìn)入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2×HBS加入后，繼續(xù)振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中；(15)取一皿細(xì)胞，將離心管中的1mL鈣轉(zhuǎn)液滴加進(jìn)去，盡可能使鈣轉(zhuǎn)試劑分布到整個(gè)培養(yǎng)皿中；(16)鈣轉(zhuǎn)液加入后，在皿蓋上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放還到另一個(gè)5％CO2培養(yǎng)箱中。確保培養(yǎng)皿水平放置，每摞培養(yǎng)皿不要超過6個(gè)。在5％CO2培養(yǎng)箱中放置(6–8h)；(17)將第一個(gè)培養(yǎng)箱的CO2濃度設(shè)定值調(diào)回到5％；(18)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為80–85％左右，狀態(tài)良好。將培養(yǎng)基吸走，更換10ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基；(19)48小時(shí)后，觀察轉(zhuǎn)染效率。絕大多數(shù)細(xì)胞仍然是貼壁的?？梢钥吹匠^95％細(xì)胞都會(huì)帶有綠色熒光。將同一個(gè)病毒包裝上清液收集到一起，并向培養(yǎng)皿中繼續(xù)添加10mL新鮮培養(yǎng)基；(20)72小時(shí)后，再次將同一個(gè)病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在一起，丟棄培養(yǎng)皿；此時(shí)收集的上清里包含了重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769。實(shí)施例2重組慢病毒載體的濃縮及檢測(cè)一、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體(如圖8所示)；(1)將收集的上清液使用Thermo真空泵，經(jīng)0.22μm-0.8μm的PES濾器抽濾，除去雜質(zhì)；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5MNaCl250mMTris-HCl(pH6-8)；(3)將2個(gè)離子交換柱串聯(lián)放置，用4ml1MNaOH、4ml1MNaCl、5ml0.15MNaCl25mMTris-HCl(pH6-8)溶液依次過柱；(4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動(dòng)泵以1-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；(5)全部上清液過柱后，使用10ml0.15MNaCl25mMTris-HCl(pH6-8)溶液清洗一遍；(6)根據(jù)上樣量使用1-5ml1.5MNaCl25mMTris-HCl(pH6-8)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(7)將洗脫液分成25到50μl一管，凍存到-80℃冰箱，進(jìn)行長(zhǎng)期保存；二、滴度測(cè)定；(1)取24孔板接種293T細(xì)胞。每孔細(xì)胞為5×104個(gè)，所加培養(yǎng)基體積為500ul,不同種類的細(xì)胞生長(zhǎng)速度有所差異，進(jìn)行病毒感染時(shí)的細(xì)胞融合率為40％-60％；(2)準(zhǔn)備3個(gè)無菌EP管，在每個(gè)管中加入90ul的新鮮完全培養(yǎng)基(高糖DMEM+10％FBS)接種細(xì)胞24小時(shí)后，取兩個(gè)孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定感染時(shí)細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目，記為N；(3)取待測(cè)定的病毒原液10ul加入到第一個(gè)管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二個(gè)管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養(yǎng)基(高糖DMEM+10％FBS),終體積為500ul；(4)感染開始后20小時(shí)，除去培養(yǎng)上清，更換為500μl完全培養(yǎng)基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；(5)72小時(shí)后，觀察熒光表達(dá)情況，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少,并拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整個(gè)細(xì)胞面，離心收集細(xì)胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個(gè)樣品管中加入200μl洗脫液洗下DNA并定量；(7)準(zhǔn)備目的DNA檢測(cè)qPCRmix總管Ⅰ(QPCR引物序列為SEQIDNO.59---SEQIDNO.60)：n＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlH2O混和。震蕩后放在冰上；(8)準(zhǔn)備內(nèi)參DNA檢測(cè)qPCRmix管Ⅱ(QPCR引物序列為SEQIDNO.61---SEQIDNO.62)：n＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix，100μl10×RNasePprimer/probemix和700μlH2O混和。震蕩后放在冰上；(9)在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，從總管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。(10)分別取5μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無模板對(duì)照(no-templatecontrol)。(11)分別取5μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無模板對(duì)照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量PCR儀為ABIPRISM7500定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測(cè)得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integrationunitsperml，IUml-1)的計(jì)算公式如下：IUml-1＝(C×N×D×1000)/V其中：C＝平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)N＝感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目(約為1×105)D＝病毒載體的稀釋倍數(shù)v＝加入的稀釋病毒的體積數(shù)(13)重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769的滴度結(jié)果(如圖9所示)；三、內(nèi)毒素測(cè)定；(1)、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為15EU/支；(2)、鱟試劑靈敏度λ＝0.25EU/ml，0.5ml/管(3)、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一支，分別用BET水按比例稀釋成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min；稀釋時(shí)每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s；(4)、加樣：取鱟試劑若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分裝至若干支無內(nèi)毒素試管中，每管0.1ml。其中2支為陰性對(duì)照管，加入BET水0.1ml；2支為陽性對(duì)照管，加入2λ濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性對(duì)照管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液(稀釋20倍的待測(cè)樣品1ml+4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1ml＝2ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋40倍樣品)。樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表5，37±1℃水浴(或培養(yǎng)箱)保溫60±1min；表5內(nèi)毒素稀釋比例及對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素含量(5)、重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果(如表6所示)，內(nèi)毒素含量在0～2.5EU/ml之間，符合要求；稀釋倍數(shù)原液510204080160對(duì)應(yīng)EU/ml0.251.252.55102040lvCAR19-1761(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)lnCAR19-1762(+)(+)(+)(-)(-)(-)(-)lvCAR19-1763(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)lvCAR19-1764(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)lvCAR19-1765(-)(-)(-)(-)(-)(-)(-)lvCAR19-1766(+)(-)(-)(-)(-)(-)(-)lvCAR19-1767(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)lvCAR19-1768(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)lvCARl9-1769(+)(+)(+)(-)(-)(-)(-)表6內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果四、支原體測(cè)定及比較；(1)在實(shí)驗(yàn)前三日，細(xì)胞樣品用無抗生素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(2)收集1ml細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞數(shù)大于1*105)，置于1.5ml離心管中；(3)13000×g離心1min，收集沉淀，棄去培養(yǎng)基；(4)加入500ulPBS用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000×g離心5min；(5)步驟4重復(fù)一次；(6)加入50μlCellLysisBuffer，用槍頭吹吸，充分混勻后,在55℃水浴中孵育20min；(7)將樣品置于95℃中加熱5min；(8)13000×g離心5min后，取5μl上清作為模板，25μlPCR反應(yīng)體系為：ddH206.5μl、MycoMix1μl、2xTaqPlusMixMaster(DyePlus)12.5μl、模板5μl；PCR循環(huán)條件為：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。(9)支原體檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖10和表7所示)，重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769均不含支原體。表7支原體檢測(cè)結(jié)果實(shí)施例3重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769的功能檢測(cè)。一、CAR基因的細(xì)胞水平表達(dá)檢測(cè)：(1)重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769和對(duì)照病毒MOCK感染PBMC細(xì)胞后，收集細(xì)胞采用RT-PCR進(jìn)行CARmRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，驗(yàn)證CAR基因的表達(dá)，如果CARmRNA轉(zhuǎn)錄水平增高，則說明CAR基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)成功；(2)重組慢病毒載體lvCAR19-1761～lvCAR19-1769和對(duì)照病毒MOCK感染PBMC細(xì)胞后，收集細(xì)胞采用westernblot進(jìn)行CAR蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，驗(yàn)證CAR基因的表達(dá)，如果CAR蛋白表達(dá)水平增高，則說明CAR基因的翻譯水平表達(dá)成功；(3)分別將MOI＝15的lvCAR19-1761～lvCAR19-1769和對(duì)照病毒MOCK感染細(xì)胞，48h后提取6孔板中細(xì)胞的總RNA和總蛋白分別進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)。具體步驟：包被6孔板的四個(gè)孔，每個(gè)孔加入相應(yīng)的PBS和RN，4℃過夜。12小時(shí)后按MOI＝15包被病毒，37℃培養(yǎng)箱放置5h；取出的6孔板，棄掉病毒上清，用PBS洗兩遍，按1*106/孔，包被PBMC(用淋巴細(xì)胞分離液從人血中分離)，加入500ul培養(yǎng)基(含10％血清、20U/mlIL-2、Polybrene8ug/ml)。靜置20min，1000g20℃離心30min，37℃培養(yǎng)48h。(4)Trizol法提取6孔板中PBMC細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA,用QPCR引物(序列為SEQIDNO.63---SEQIDNO.64)進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系見表8，以內(nèi)參Actin為對(duì)照組，驗(yàn)證其mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。試劑體積(μl)SYBRpremixextaq:10μlROXReverseDye(50x)0.4μl上游引物(2.5μM)：0.5μl下游引物(2.5μM)：0.5μlcDNA1.0μlddH2O7.6μl表820μlqPCR反應(yīng)體系(5)蛋白免疫印跡(WesternBlot)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將從PBMC中提取的總蛋白質(zhì)按相對(duì)分子質(zhì)量分離。采用濕轉(zhuǎn)(4℃，400mA，120min)，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液(含5％脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1h，封閉液1:1000稀釋BiotinylatedproteinL，然后與封閉好的PVDF膜室溫孵育4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10min。封閉液1:500稀釋相應(yīng)的SA-HRP，室溫下孵育PVDF膜2h，TBST洗膜3次，每次10min。采用Amersham公司ECL+plusTMWesternblottingsystem試劑盒進(jìn)行顯色。X光顯影獲得顯示條帶的膠片。(6)RT-QPCR檢測(cè)顯示，重組慢病毒載體感染PBMC后的CAR基因的轉(zhuǎn)錄水平比對(duì)照病毒MOCK和空細(xì)胞有明顯升高(如圖11和表9所示)，說明CAR基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)成功。表9(7)蛋白免疫印跡(WesternBlot)的結(jié)果表明，重組慢病毒載體感染PBMC后CAR蛋白的表達(dá)水平比對(duì)照病毒MOCK和空細(xì)胞有明顯升高(如圖12所示)，說明CAR基因的翻譯水平表達(dá)成功。二、IL-6敲減效果評(píng)估(mRNA轉(zhuǎn)錄水平和上清中IL-6的表達(dá)水平)。(1)分別培養(yǎng)CD19+K562細(xì)胞和PBMC細(xì)胞；(2)實(shí)驗(yàn)開始前4天，MOI＝15的lvCAR19-1761～lvCAR19-1769的病毒感染PBMC細(xì)胞，培養(yǎng)72-96h后可安排開始實(shí)驗(yàn)；(3)收集靶細(xì)胞(CD19+K562)4x105cells和效應(yīng)細(xì)胞(lvCAR19-1761-PBMC～lvCAR19-1769-PBMC細(xì)胞)2.8x106cells，800g，6min離心，棄上清；(4)用1ml1xPBS溶液分別重懸靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，800g，6min離心，棄上清；(5)重復(fù)步驟4一次；(6)用700ul培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+10％FBS)重懸效應(yīng)細(xì)胞，用2ml培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+10％FBS)重懸靶細(xì)胞；(7)設(shè)置效靶比為10:1的實(shí)驗(yàn)孔，并設(shè)置對(duì)照組；(8)250xg，5min平板離心；(9)37℃5％CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4小時(shí)，收集100ul共培養(yǎng)上清，做CBA檢測(cè)IL-6含量；(10)繼續(xù)37℃5％CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)至24小時(shí)，1000xg，2min平板離心，收集100ul共培養(yǎng)上清做CBA檢測(cè)IL-6含量，收集細(xì)胞檢測(cè)IL-6mRNA轉(zhuǎn)錄水平；(11)CBA檢測(cè)IL-6含量的步驟為，IL-6標(biāo)準(zhǔn)品管、樣品管、陰性對(duì)照管中各加入50ulIL-6捕獲微球懸液，加樣前混勻微球；各管分別加入50ulPE信號(hào)抗體；IL-6標(biāo)準(zhǔn)品管加入IL-6標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；樣品管、陰性對(duì)照管中分別加入稀釋后樣品和陰性對(duì)照液；室溫避光孵育3h；各管加入1ml洗液，200xg離心5min；棄上清；各管加入300ul洗液，重新懸浮微球；使用NxT流式細(xì)胞儀分析樣本，當(dāng)日上機(jī)，上機(jī)前充分混勻3-5s；(12)Trizol法提取上述混合細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA,用QPCR引物(序列為SEQIDNO.65---SEQIDNO.66)進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系見表6，以內(nèi)參Actin為對(duì)照組，驗(yàn)證其mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。(13)4h和24h的CBA檢測(cè)結(jié)果(如圖13所示)，IL-6敲減重組慢病毒載體感染PBMC并與靶細(xì)胞孵育后，IL-6基因的上清含量比對(duì)照病毒lvCAR19-1761和空細(xì)胞有明顯降低(如圖14所示)，說明IL-6基因的表達(dá)水平明顯降低。(14)RT-QPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-6敲減重組慢病毒載體感染PBMC并與靶細(xì)胞孵育后，IL-6基因的mRNA比對(duì)照病毒lvCAR19-1761和空細(xì)胞有明顯降低(如圖15所示)，說明IL-6基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低。三、細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)效果評(píng)估。(1)分別培養(yǎng)CD19+K562細(xì)胞和PBMC細(xì)胞；(2)實(shí)驗(yàn)開始前4天，MOI＝15的lvCAR19-1761～lvCAR19-1769的病毒感染PBMC細(xì)胞，培養(yǎng)72-96h后可安排開始實(shí)驗(yàn)；(3)收集靶細(xì)胞(CD19+K562)4x105cells和效應(yīng)細(xì)胞(CART細(xì)胞)2.8x106cells，800g，6min離心，棄上清；(4)用1ml1xPBS溶液分別重懸靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，800g，6min離心，棄上清；(5)重復(fù)步驟3一次；(6)用700ul培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+10％FBS)重懸效應(yīng)細(xì)胞，用2ml培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+10％FBS)重懸靶細(xì)胞；(7)設(shè)置效靶比為1:1、5:1、10:1的實(shí)驗(yàn)孔，并設(shè)置對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔；(8)250xg，5min平板離心；(9)37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；(10)250xg，5min平板離心；(11)取每個(gè)孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(12)避光孵育25分鐘；(13)每孔加入50ul終止液；(14)酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm吸光度；(15)將3個(gè)復(fù)孔取平均值；將所有實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞孔的吸光值減去培養(yǎng)基背景吸光值的均值；將靶細(xì)胞最大值的吸光值減去體積校正對(duì)照吸光值的均值。(16)將步驟15中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計(jì)算每個(gè)效靶比所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性百分比。結(jié)果如圖16所示，，IL-6敲減重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細(xì)胞在10:1效靶比條件下殺傷效率明顯高于PBMC空細(xì)胞，低于對(duì)照病毒lvCAR19-1761轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細(xì)胞；其中l(wèi)vCAR19-1763-PBMC殺傷效率略低于對(duì)照病毒lvCAR19-1761-PBMC，但是IL-6的表達(dá)水平下降超過70％，將來可以在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，釋放較少的IL-6，有效緩解CRS。殺傷效率＝(實(shí)驗(yàn)孔-效應(yīng)細(xì)胞孔-靶細(xì)胞孔)/(靶細(xì)胞最大孔-靶細(xì)胞孔)X100％以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3