零背景克隆載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法

零背景克隆載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了制備零背景克隆載體的方法及應(yīng)用。其中，制備零背景克隆載體的方法，包括以下步驟：提供SEQ ID NO：6所示的DNA片段；以pUC19質(zhì)粒為模板，利用SEQ ID NO：7-8所示的引物進(jìn)行第一PCR擴增，以便獲得pUC19載體片段；將DNA片段與pUC19載體片段進(jìn)行同源重組，以便獲得載體骨架；將載體骨架轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并提取質(zhì)粒，以便獲得零背景克隆載體的前載體；以及采用EcoRV酶對零背景克隆載體的前載體進(jìn)行酶切，以便得到零背景克隆載體。該方法獲得的載體可直接用于平末端產(chǎn)物的連接，載體自連的背景低，克隆的陽性率高，無需藍(lán)白篩選，能在短時間內(nèi)實現(xiàn)快速有效的克隆，克隆效率高，效果好。
【專利說明】零背景克隆載體及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及零背景克隆載體及其制備方法和應(yīng) 用，更具體地，本發(fā)明涉及制備零背景克隆載體的方法、零背景克隆載體及其在制備目的基 因克隆載體中的用途，以及制備目的基因克隆載體的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)階段的遺傳工程涉及大量的基因克隆技術(shù)，將基因片段插入到克隆載體中，方 便長期保存基因以及下游的分子生物學(xué)操作。市場上常見的克隆載體比如帶胸腺嘧啶T突 出末端的載體（以下簡稱T載體）大多是應(yīng)用β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行藍(lán)-白斑篩選，劣勢 在于藍(lán)白斑比例較高，且白斑中也存在假陽性的情況，每個平板上涂上5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-半乳糖苷（以下簡稱X-Gal)及異丙基硫代-β -D-半乳糖苷（以下簡稱IPTG) 的步驟也比較繁瑣。T載體只能直接連接末端帶有腺嘌呤堿基A尾的脫氧核糖核酸（以下 簡稱DNA)片段，Taq酶等類似的聚合酶的保真度不如高保真酶，擴增出的片段存在錯配的 風(fēng)險。當(dāng)插入片段大于3千堿基時候，克隆效率非常低下。
[0003] 而除了 T載體之外，目前也有一些有關(guān)含毒性基因的零背景載體的報道，這種新 型的零背景平端克隆載體可以避免一些常見載體的缺點。但是，利用毒性基因構(gòu)建載體時， 為了擴繁質(zhì)粒載體，一般采用阻斷序列將毒性基因的閱讀框破壞使基因不能表達(dá)，從而有 可能導(dǎo)致存在微量未酶切干凈的質(zhì)粒的干擾，對載體的質(zhì)量有一定影響。
[0004] 因而，現(xiàn)階段急需一種能夠有效解決上述問題的零背景平端克隆載體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種能夠直接用于平末端產(chǎn)物的連接，降低載體自連的背景，提高克隆的陽性率， 并能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)快速有效的克隆的零背景克隆載體。
[0006] 首先，需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0007] 核糖核酸酶基因（氨基酸序列如SEQ ID NO ;1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO :2 所示），來源于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，編碼一種核糖核酸酶，可 以降解核糖核酸（以下簡稱RNA)，在沒有其抑制蛋白時對細(xì)胞來說是致死的。例如，在基因 克隆載體中常用的復(fù)制子能夠在大腸桿菌中高效的復(fù)制，每個細(xì)胞中拷貝達(dá)到200 - 300 個，但是，在乳糖啟動子（以下簡稱Lac啟動子）、乳糖和色氨酸的雜合啟動子（以下簡稱 Tac啟動子），以及突變的乳糖啟動子形式（以下簡稱Lac UV5啟動子）等啟動子驅(qū)動下， 核糖核酸酶基因可以大量表達(dá)，將殺死大腸桿菌細(xì)胞，因此，核糖核酸酶對普通的大腸桿菌 來說都是致死的。并且，利用組織特異性表達(dá)的啟動子能夠有效驅(qū)動核糖核酸酶基因在宿 主的該組織中特異表達(dá)。
[0008] 細(xì)胞致死毒性（Control of cell death，以下簡稱ccdB)基因表達(dá)一種毒性蛋白， 在缺乏抗毒素的情況下，干擾大腸桿菌DNA促旋酶的一種蛋白，從而抑制普通大腸桿菌的 生長，殺傷宿主細(xì)胞。而DB3. 1的大腸桿菌可以耐受含有ccdB基因的質(zhì)粒繁殖，方便質(zhì)粒 的提取。利用DB3. 1的大腸桿菌來繁殖載體，通過增加核糖體結(jié)合位點序列，讓ccdB基因 在DB3. 1菌株中高量表達(dá)，可以降低未酶切干凈載體轉(zhuǎn)化造成的背景。
[0009] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用雙毒基因的構(gòu)建策略構(gòu)建零背景克隆載體：采用ccdB毒性基因 作為零背景載體的間隔序列，即通過ccdB基因的序列阻斷破壞核糖核酸酶基因（內(nèi)含多克 隆位點）的閱讀框，一方面可以使核糖核酸酶基因保留在載體上但不表達(dá)，當(dāng)切去ccdB基 因即可得到目的載體，核糖核酸酶基因就可以表達(dá)，而插入外源片段后又破壞了核糖核酸 酶基因的閱讀框引起蛋白失活，從而達(dá)到零背景克隆的效果；另一方面，在載體酶切時，常 常會有極少量的比如變性超螺旋的質(zhì)粒酶切不完全，而通過引入ccdB基因，完整的未酶切 完全的質(zhì)粒將不能表達(dá)，這可以保證載體的質(zhì)量。含有核糖核酸酶基因完整閱讀框的零背 景克隆載體可以在自身環(huán)化后殺死大腸桿菌細(xì)胞，只有成功連接外源基因的載體才可以在 平板上長出菌落。這種陽性篩選策略無需藍(lán)白篩選，能夠大大加速克隆篩選進(jìn)程。
[0010]目前，尚未有使用編碼核糖核酸酶的基因來構(gòu)建零背景載體進(jìn)行平端克隆的報 道。
[0011] 因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備零背景克隆載體的方法。根 據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟：提供SEQ ID NO :6所示的DNA片段；以pUC19質(zhì) 粒為模板，利用SEQ ID NO :7-8所示的引物進(jìn)行第一 PCR擴增，以便獲得pUC19載體片段； 將所述DNA片段與所述pUC19載體片段進(jìn)行同源重組，以便獲得載體骨架；將所述載體骨架 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并提取質(zhì)粒，以便獲得零背景克隆載體的前載體；以及采用EcoRV酶對所 述零背景克隆載體的前載體進(jìn)行酶切，以便得到零背景克隆載體。
[0012] 發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，通過該方法獲得的零背景克隆載體能夠直接用于平末端產(chǎn)物 即目的基因片段的連接，載體自連的背景低，克隆的陽性率高，無需藍(lán)白篩選，即能夠在短 時間內(nèi)實現(xiàn)快速有效的克隆，克隆效率高，效果好，進(jìn)而能夠有效用于目的載體的構(gòu)建。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種零背景克隆載體。根據(jù)本發(fā)明的實 施例，該零背景克隆載體是通過前面所述的制備零背景克隆載體的方法制備獲得的。發(fā)明 人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該零背景克隆載體相對于普通的T載體性能優(yōu)越，可直接用于平末端產(chǎn)物 即目的基因片段的連接，載體自連的背景低，克隆的陽性率高，無需藍(lán)白篩選，能夠在短時 間內(nèi)實現(xiàn)快速有效的克隆，克隆效率高，效果好，進(jìn)而能夠有效用于目的載體的構(gòu)建。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，前述的零背景克隆載體在制備目的基因克隆載體中的用 途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該零背景克隆載體可以高效連接不同長度的目的基因片段，尤其 適于大片段的目的基因的連接，并且連接效率以及陽性率非常高，連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常 用的大腸桿菌菌株，因而，能夠直接用于制備目的基因克隆載體。具體地，將目的基因片段 有效連接至零背景載體上，即可獲得目的基因克隆載體，經(jīng)測序驗證后，可以直接用于序列 分析以及基因序列的保存，或者通過亞克隆的方法將該目的基因克隆載體中的目的基因轉(zhuǎn) 移到合適的表達(dá)載體上，構(gòu)建目的基因表達(dá)載體，以便用于蛋白表達(dá)或轉(zhuǎn)基因研究。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種制備目的基因克隆載體的方法。根據(jù) 本發(fā)明的實施例，該方法包括：將目的基因片段與零背景克隆載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化、培 養(yǎng)、篩選陽性克隆，以便獲得目的基因克隆載體。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法可以通過 前述的零背景克隆載體高效連接任何具有平末端或粘性末端的不同長度的目的基因片段， 尤其適于大片段目的基因片段的連接，并且連接效率以及陽性率非常高，連接產(chǎn)物可直接 轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株，從而能夠有效制備獲得目的基因克隆載體。進(jìn)一步，該目的基因 克隆載體，經(jīng)測序驗證后，可以直接用于序列分析以及基因序列的保存，或者通過亞克隆的 方法將該目的基因克隆載體中的目的基因轉(zhuǎn)移到合適的表達(dá)載體上，構(gòu)建目的基因表達(dá)載 體，以便用于蛋白表達(dá)或轉(zhuǎn)基因研究。
[0016] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0018] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備零背景克隆載體的方法的流程示意圖；
[0019] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，零背景克隆載體的前載體的載體圖譜；
[0020] 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，零背景克隆載體的前載體經(jīng)EcoRV酶切后 的電泳圖；
[0021] 圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，零背景克隆載體連接700bp平末端片段后 的菌落PCR電泳檢測結(jié)果；
[0022] 圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，零背景克隆載體連接700bp粘末端片段后 的菌落PCR電泳檢測結(jié)果；
[0023] 圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，零背景克隆載體連接2000堿基平末端片段 后的菌落PCR電泳檢測結(jié)果；
[0024] 圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，零背景克隆載體連接8000堿基平末端片段 后的菌落PCR電泳檢測結(jié)果。

【具體實施方式】
[0025] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0026] 需要說明的是，術(shù)語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相 對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說 明，"多個"的含義是兩個或兩個以上。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備零背景克隆載體的方法。參考圖 1，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟：
[0028] SlOO :提供 SEQ ID NO :6 所示的 DNA 片段
[0029] 提供SEQ ID NO :6所示的DNA片段，該DNA片段包括LacUV5啟動子（SEQ ID NO : 4)驅(qū)動的核糖核酸酶基因以及ccdB基因 （SEQ ID NO :5)的間隔序列，其中，SEQ ID NO :6 序列具體如下：
[0030] TTCCCGACTG GAAAGCAATT GGCAGTGAGC GCAACGCAAT TAATGTGAGT TAGCTCACTC 60
[0031] ATTAGGCACC CCAGGCTTTA CACTTTATGC TTCCGGCTCG TATAATGTGT GGAATTGTGA 120
[0032] GCGGATAACA ATTTCACACA GGAGGTTTAA ACTTTAAAAT GGCTCAGGTT ATCAACACCT 180
[0033] TCGACGGTGT TGCTGACTAC CTGCAGACCT ACCACAAACT GCCGGACAAC TACATCACCA 240
[0034] AATCTGAAGC TCAGGCTCTG GGTTGGGAGC GGATAACAAT TTCACACAGG AAACAGCTAT 300
[0035] GCCCATGCTT ACGCCAAGAT TTAGGTGACA CTATAGAATA CTCAAGCTAT GCATCCAACG 360
[0036] CGTTGGGAGC TCTCCCATAT GGTCGACCTG CAGGCGGCCG CGAATTCACT AGGATATCTA 420
[0037] AGGAGATTTA CATGCAGTTC AAGGTTTACA CCTATAAAAG AGAGAGCCGC TATCGCCTGT 480
[0038] TTGTGGATGT ACAGAGTGAT ATTATTGACA CGCCCGGGCG ACGGATGGTG ATCCCCCTGG 540
[0039] CCAGTGCACG TCTGCTGTCA GATAAAGTCT CCCGTGAACT TTACCCGGTG GTGCATATCG 600
[0040] GGGATGAAAG CTGGCGCATG ATGACCACCC AGATGGTCAG TGTGCCGGTC TCCGTCATCG 660
[0041] GAGAAGAAGT GGCTGATCTC AGCCACCGCG AAAATGACAT CAAAAACGCC ATTAATCTGA 720
[0042] TGTTCTGGGG AATATAAAGC GGCCGATATC GAATTCCCGC GGCCGCCATG GCGGCCGGGA 780
[0043] GCATGCGACG TCGGGCCCAA TTCGCCCTAT AGTGAGTCGT ATTACAATTC ACTGGCCGTC 840
[0044] GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCGGCTTCT AAAGGTAACC TGGCTGACGT 900
[0045] TGCTCCGGGT AAATCTATCG GTGGTGACAT CTTCTCTAAC CGTGAAGGTA AACTGCCGGG 960
[0046] TMATCTGGT CGTACCTGGC GTGAAGCTGA CATCMCTAC ACCTCTGGTT TCCGTAACTC 1020
[0047] TGACCGTATC CTGTACTCTT CTGACTGGCT GATCTACMA ACCACCGACC ACTACCAGAC 1080
[0048] CTTCACCAAA ATCCGTTAAG GCCTCGTGAT ACGCCTATT 1119
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，通過以下步驟提供SEQ ID NO :6所示的DNA片段：
[0050] 首先，將SEQ ID NO :9-69所示的引物混合，以便獲得引物混合物，其中，各引物序 列如下表所示：
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備零背景克隆載體的方法，其特征在于，包括以下步驟： 提供SEQ ID NO :6所示的DNA片段； 以pUC19質(zhì)粒為模板，利用SEQ ID NO :7-8所示的引物進(jìn)行第一 PCR擴增，以便獲得 PUC19載體片段； 將所述DNA片段與所述pUC19載體片段進(jìn)行同源重組，以便獲得載體骨架； 將所述載體骨架轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并提取質(zhì)粒，以便獲得零背景克隆載體的前載體；以 及 采用EcoRV酶對所述零背景克隆載體的前載體進(jìn)行酶切，以便得到零背景克隆載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過以下步驟提供SEQ ID NO :6所示的 DNA片段： 將SEQ ID NO :9-69所示的引物混合，以便獲得引物混合物； 對所述引物混合物進(jìn)行第二PCR擴增，以便獲得第二PCR擴增產(chǎn)物；以及 利用SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :69所示的引物，將所述第二PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行第三 PCR擴增，以便獲得第三PCR擴增產(chǎn)物，所述第三PCR擴增產(chǎn)物即為SEQ ID NO :6所示的DNA 片段， 任選地，所述第二PCR擴增的反應(yīng)體系為：10微升50微摩爾的所述引物混合物、0. 5微 升高保真DNA聚合酶、10微升5X第二PCR反應(yīng)混合液，雙蒸水補足至50微升， 任選地，所述第二PCR擴增的反應(yīng)程序為：95°C 3分鐘；94°C 30秒，55°C退火30秒，68°C 1分鐘，循環(huán)25次；68°C 5分鐘；冷卻至室溫， 任選地，所述第三PCR擴增的反應(yīng)體系為：0. 5微升50微摩爾SEQ ID NO:9所示的引 物，0.5微升50微摩爾SEQ ID NO :69所示的引物，0.5微升高保真DNA聚合酶、10微升5X 第三PCR反應(yīng)混合液，1微升所述第二PCR擴增產(chǎn)物，雙蒸水補足至50微升， 任選地，所述第三PCR擴增的反應(yīng)程序為：95°C 3分鐘；94°C 30秒，55°C退火30秒，68°C 2分鐘，循環(huán)30次；68°C 5分鐘；冷卻至室溫。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一 PCR擴增的反應(yīng)體系為：0. 5微 升10微摩爾SEQ ID NO: 7所示的引物，0.5微升10微摩爾SEQ ID NO :8所示的引物，10納 克PUC19質(zhì)粒，0. 5微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第一 PCR反應(yīng)混合液，雙蒸水補足至 50微升， 任選地，所述第一PCR擴增的反應(yīng)程序為：95°C 3分鐘；94 °C 30秒，55 °C退火30秒，68 °C 2分鐘，循環(huán)30次；68 °C 5分鐘；冷卻至室溫。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用基因克隆試劑盒進(jìn)行所述同源重組， 任選地，所述同源重組的反應(yīng)體系為：10微升2X基因克隆反應(yīng)混合液，5微升所述DNA 片段、2微升所述pUC19載體片段，雙蒸水補足至50微升， 任選地，于室溫下進(jìn)行所述同源重組30分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DB3. 1， 任選地，于37°C下進(jìn)行所述酶切2-4小時， 任選地，所述酶切的反應(yīng)體系為：10微升10X酶切緩沖液，1-10微克所述零背景克隆載 體的前載體、1-10微升10U/微升EcoRV酶，雙蒸水補足至100微升。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括： 將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收純化約3000堿基的大片段，所述大片段即為 所述零背景克隆載體。
7. -種零背景克隆載體，其是通過權(quán)利要求1-6任一項所述的方法制備獲得的。
8. 權(quán)利要求7所述的零背景克隆載體在制備目的基因克隆載體中的用途。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，將目的基因片段與所述零背景克隆載體 進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、篩選陽性克隆，以便獲得目的基因克隆載體， 任選地，利用快速連接緩沖液和T4DNA連接酶進(jìn)行所述連接， 任選地，所述快速連接緩沖液包含： 20?200毫摩爾的三羥甲基氨基甲烷； 5?50毫摩爾的氯化鎂； 0. 5?50毫摩爾的二硫蘇糖醇； 0. 1?1毫摩爾的脫氧核糖核苷三磷酸； 0. 3?3毫摩爾的三磷酸腺苷； 0. 5?10毫摩爾的鹽酸亞精胺；以及 50?1000毫克/毫升的小牛血清白蛋白。
10. -種制備目的基因克隆載體的方法，其特征在于，包括： 將目的基因片段與所述零背景克隆載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、篩選陽性克隆，以 便獲得目的基因克隆載體， 任選地，利用快速連接緩沖液和T4DNA連接酶進(jìn)行所述連接， 任選地，所述快速連接緩沖液包含： 20?200毫摩爾的三羥甲基氨基甲烷； 5?50毫摩爾的氯化鎂； 0. 5?50毫摩爾的二硫蘇糖醇； 0. 1?1毫摩爾的脫氧核糖核苷三磷酸； 0. 3?3毫摩爾的三磷酸腺苷； 0. 5?10毫摩爾的鹽酸亞精胺；以及 50?1000毫克/毫升的小牛血清白蛋白， 任選地，于室溫下進(jìn)行所述連接5-30分鐘。
【文檔編號】C12N15/63GK104313044SQ201410520443
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】鄒愛蘭, 俞萍, 李曉晨, 孫克非 申請人:天根生化科技（北京）有限公司