專利名稱：利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法
利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種微生物的鑒定方法，具體涉及利用分子 標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
猴頭菇(f/er/"^m w/"""^)猴頭菇是著名的八大山珍之 一，與燕窩、魚(yú)翅、海參并列為四大名肴。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為猴頭菇性平、 味甘，有助消化、利五臟、潤(rùn)六肺的功能和補(bǔ)虛損的功效，能提高人體免 疫能力，對(duì)慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍等多種消化道疾病和神經(jīng)衰 弱均有較好療效。猴頭菇營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種高蛋白、低脂肪，富含人體必 需的多種氨基酸、多肽、多糖和脂肪族的酰胺物質(zhì)及多種維生素的優(yōu)良保 健食品。我國(guó)食用菌資源豐富，品種比較多，近年來(lái),由于菌種管理制度不健全, 致使猴頭菇菌種混亂,出現(xiàn)同名異物、同物異名的現(xiàn)象。大量的混淆不清的 菌種名稱不但使產(chǎn)業(yè)技術(shù)無(wú)從規(guī)范,也使我國(guó)近10年來(lái)幾乎沒(méi)有按食用菌 育種技術(shù)規(guī)范選育出的優(yōu)良品種。而大量使用的多數(shù)是十幾年前選育的未 經(jīng)系統(tǒng)篩選和測(cè)試的組織分離物。這些非品種的菌種又常被冠以新名,而其 區(qū)別性、 一致性和穩(wěn)定性無(wú)從知曉。這種混淆和混亂不僅給生產(chǎn)環(huán)節(jié)帶來(lái) 諸多不便，也對(duì)食用菌的科學(xué)研究與學(xué)術(shù)交流造成障礙。猴頭菇的人工栽培己逐漸形成較大規(guī)模,創(chuàng)造了較好的經(jīng)濟(jì)效益。優(yōu)質(zhì) 的猴頭菇菌種是獲得高單產(chǎn)和高質(zhì)量的前提與基礎(chǔ)，這就決定了猴頭菇菌 種在猴頭菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。因此為了保證每批次的用種都準(zhǔn)確無(wú)誤， 減少不必要的損失，需要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇 猴杰菌種的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括菌絲培 養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)建立和SCAR-PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)；其特征在于1、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)，使用的檢測(cè)引物是猴杰F/R，其中，猴 杰F是5'- CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG -3'，，猴杰R是5'-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA -3';2、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10XPCR buffer 2. 5 jal， 25,ol/L MgCL2 1 (il， 2.5 m mol/L dNTP 2 |il， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 jal， 10 u mol/L檢測(cè)引物各1 ^d， lng 10ng/pl模板 DNA l(xl， ddH20 16.2 jil;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán);72°C 5rain;3、 SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果在電泳檢測(cè)的DNA圖譜中顯示，擴(kuò)增 出的分子量為4〗4bp的特異DNA條帶，為猴頭菇猴杰菌種的標(biāo)志。本發(fā)明提供的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種的方法，具有靈敏度 高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比， 具有檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。具體如下1、 檢測(cè)時(shí)間短該檢測(cè)方法所需時(shí)間只需要2—3天，而常規(guī)的拮抗 試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)和出菇試驗(yàn)則需要至少 2個(gè)月的時(shí)間。2、 準(zhǔn)確性高、容易判斷，而且重復(fù)性好該檢測(cè)方法以基因組DNA 為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，不易受外界因素等的影響，同時(shí)它的 1012bp或371bp的顯性標(biāo)記判斷一目了然，減少人為判斷的偏差，大大提 高了準(zhǔn)確性；常規(guī)的拮抗試驗(yàn)中，拮抗表現(xiàn)形式至少有3種，甚至更多， 有時(shí)表現(xiàn)形式不明顯，還受培養(yǎng)環(huán)境的影響，拮抗表現(xiàn)不僅在種內(nèi)的不同 品種之間會(huì)出現(xiàn)，同時(shí)在種間的菌株之間也會(huì)表現(xiàn)出來(lái)，給準(zhǔn)確判斷造成 困難；出菇試驗(yàn)更容易受到環(huán)境、時(shí)間等各方因素的影響，重復(fù)性差，加 大了檢測(cè)困難；形態(tài)學(xué)檢測(cè)在同一屬種內(nèi)的不同品種之間可區(qū)別的特征少， 有些甚至沒(méi)有什么差異，同時(shí)還需要判斷者具有豐富的知識(shí)與經(jīng)驗(yàn)，方可 做出準(zhǔn)確的判斷。3、 此外該方法得到的顯性標(biāo)記可減少猴頭菇新品種認(rèn)定的工作量，檢 測(cè)時(shí)該方法只需要1個(gè)陽(yáng)性菌株和1個(gè)陰性菌株對(duì)照便可快速比較，而用 常規(guī)形態(tài)學(xué)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)方法來(lái)認(rèn)定一個(gè)新品種，需要將所有同 種內(nèi)的不同品種一起搬出來(lái)比較，才能做出正確的認(rèn)定，這就要很大的人 力和物力，當(dāng)品種多時(shí)可能使得認(rèn)定工作無(wú)法進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)猴頭莧種質(zhì)資源的利用和新品種的登記工作，提供了更為有 效的菌種鑒定體系，以及加強(qiáng)對(duì)我國(guó)猴頭燕種質(zhì)資源的保護(hù)工作都具有重 要意義。
圖1為使用引物猴杰F/R檢測(cè)猴頭菇菌種擴(kuò)增的DNA圖 譜。其中M 17為泳道編號(hào)；左側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量，箭頭 所指是猴杰菌株特異性標(biāo)記。
具體實(shí)施方式
為了充分公開(kāi)本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭 菇猴杰菌種的方法，以下結(jié)合實(shí)施例加以說(shuō)明。實(shí)施例1: 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭燕猴杰菌種的方法 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括以下歩驟 一、菌絲培養(yǎng)與收集(一) 若供測(cè)試猴頭燕菌株的保藏時(shí)間小于6個(gè)月，則菌絲培養(yǎng)按如下 方法進(jìn)行1、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中；2、 放置在25。C搖床上，轉(zhuǎn)速90 130r/min培養(yǎng)7 10d;3、 用紗布過(guò)濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；4、 稱取0.5 1.3g菌絲,用濾紙包好，保存于-2(TC備用。(二) 若供測(cè)試猴頭燕菌株保藏時(shí)間不小于6個(gè)月，則菌絲培養(yǎng)采用如 下方法1、 取猴頭菇菌種豆塊大小轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25'C培養(yǎng)7 10天；2、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中；3、 放置在25。C搖床上，轉(zhuǎn)速90 130r/min培養(yǎng)7 10d;4、 用紗布過(guò)濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；5、 稱取0.5 1.3g菌絲，用濾紙包好，保存于-20。C備用。二、基因組DNA的提取，所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子 實(shí)體中提取。1、取保存?zhèn)溆玫暮镱^菇菌絲0.5 1.3g，或子實(shí)體0.5 1.3g，放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7ml的離心管；2、 加2.5mL65r預(yù)熱的抽提液，同時(shí)加入50 jil巰基乙醇，上下震蕩， 使蛋白質(zhì)變性沉淀；3、 65'C水浴lh，每隔10min振蕩l次；4、 加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質(zhì)；5、 8000 r/min， 4。C離心10min，取上清到7ml離心管；6、 力Q 1/5體積65"預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入2. 5 ml的氯仿異戊 醇混勻；7、 10000r/min， 4。C離心10min，取上清；8、 加入2.5ml 65。C預(yù)熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65。C水浴lh至沉淀可見(jiàn)或可過(guò)夜；9、 12000r/min, 4。C離心10min后，小心去除上清液；10、 用O. 5ml TE溶液或無(wú)菌水溶解沉淀10min;11、 加入0. 25ml飽和酚和0. 25m L氯仿異戊醇，混勻；12、 12000 r/min， 4。C離心10min，取上清，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú) 水乙醇，混勻；13、 放置-20。C冰箱lh或過(guò)夜；14、 12000 r/min， 4。C離心10 min，棄上清；15、 自然風(fēng)干沉淀，用30 ^ TE溶液或無(wú)菌去離子水溶解沉淀，-20°C 保存?zhèn)溆谩Ｈ?、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系10XPCR buffer 2. 5 pl， 25mmol/L MgCU 1 (il ， 2.5 m mol/L dNTP 2 jal， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 [il， 10 u mol/L 專用檢測(cè)引物猴杰F/R l|il， lng 10ng/Vl模板DNA l(il， ddH20 16. 2 (il。SCAR-PCR反應(yīng)條件:94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min。所述專用檢測(cè)引物猴杰F/R，是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)大量的篩選試驗(yàn)， 獲得了猴頭菇猴杰菌種的特異DNA片斷，以此片段的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè) 計(jì)猴杰菌種的特異檢測(cè)引物。所述專用檢測(cè)引物猴杰F/R具體內(nèi)容為猴 杰F是5'- CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG -3'，猴杰R是5'-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA -3'。四、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)具體檢測(cè)方法為，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 ^tl加上1. 5 ^ 6X溴酚藍(lán)上樣 緩沖液，混勻，在1. 0%瓊脂糖凝膠，含GoldView DNA染料進(jìn)行電泳，5V/cm 恒壓電泳50min，通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像?；蛘?，取PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物8 ^，與1.5 6X溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1%的瓊醋糖凝膠 上，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm恒壓電泳0. 5 lh，電泳結(jié)束后，用 EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果采用檢測(cè)引物猴杰F/R對(duì)猴頭菇菌株進(jìn)行 SCAR—PCR擴(kuò)增，只有猴杰菌株能擴(kuò)增出分子量為414bp的DNA條帶。本發(fā)明所使用的主要試劑如下(所有化學(xué)試劑均為分析純)1、 CTAB抽提液100 mmol/L Tris-HCl， 2. 0% CTAB， 20 mmol/L EDTA， 1. 4 mol/L NaCl， pH 8. 0;2、 CTAB沉淀液50mmol/LTris-HCl， 1.0%CTAB， 10誦ol/L EDTA， pH 8. 0;3、 CTAB/NaCl: 0.7 mol/X NaCl，10% CTAB;4、 TE緩沖液10咖ol/L Tris HC1 ， 1咖ol/L EDTA;5、 0.5XTBE: 44.5廳1/L Tris， 50 ,1/L ■:,、 1腿ol/L EDTA;6、 上樣緩沖液0.1%溴酚藍(lán),40%蔗糖；7、 EB: 10mg/ml溴化乙錠；8、 PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的主要儀器如下SW-CJ-1FB型單人水平垂直兩用凈化 工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司； 手提式滅菌鍋上海三申； HYG-A全溫?fù)u瓶柜太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)室；冷凍離心機(jī)Sigma 3K30;PCR擴(kuò)增儀Eppendorf AG22331 Hamburg;掌型離心機(jī)江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-100手掌型離心機(jī)； 凝膠成像系統(tǒng)TANON-2008。2525Untitledl. ST25 SEQUENCE LISTING<110〉禍建農(nóng)林人學(xué)< 120〉利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法<130〉<160〉 2<170〉 Patentln version 3.1〈400〉 1cgc幼cc膽a. a.caaaaacga caatg<40()〉 2cgttccaccc ct.acgtttag cctca<210〉 <2]1〉 〈212> <213〉225DNA猴頭竊范2 CA頭s麗猴
權(quán)利要求
1、一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)；其特征在于(1)SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)，使用的檢測(cè)引物是猴杰F/R，其中，猴杰F是5′-CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG-3′’，猴杰R是5′-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA-3′；(2)SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)建立，SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10×PCR buffer 2.5μl，25mmol/L MgCL2 1μl，2.5m mol/L dNTP 2μl，5U/ulTaq DNA Polymerase 0.3μl，10μmol/L檢測(cè)引物各1μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH2O 16.2μl；SCAR-PCR反應(yīng)條件為94℃ 1min；94℃ 45second，62℃ 45second，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5min；(3)SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果在電泳檢測(cè)的DNA圖譜中顯示，擴(kuò)增出的分子量為414bp的特異DNA條帶，為猴頭菇猴杰菌種的標(biāo)志。
全文摘要
一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測(cè)建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。本發(fā)明提供的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種的方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。為猴頭菇種質(zhì)資源的利用和新品種的登記工作，提供了快速有效的菌種鑒定體系，對(duì)科研和生產(chǎn)具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101402994SQ20081007213
公開(kāi)日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者劉新銳, 堅(jiān) 朱, 江玉姬, 謝寶貴, 鄧優(yōu)錦 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)