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利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法

文檔序號(hào):564773閱讀:269來源:國知局
專利名稱:利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法
利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭燕菌種猴王的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種微生物的鑒定方法,具體涉及利用分子 標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法,屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
猴頭菇(Z/en'c/Mm er/wac醋)肉嫩味美,營養(yǎng)豐富。很早 以前,人們把它與熊掌、海參、鯊魚翅并列為"四大名菜",有"山珍猴頭, 海味燕窩"的美稱,在古代被作為貢品。人體必需的9種氨基酸,猴頭菇都 含有。據(jù)報(bào)道,猴頭菇所含有的營養(yǎng)成分與目前人工栽培的其它食用菌品 種相比都居第一、二位,因而顯得更加珍貴。我國食用菌資源豐富,品種比較多,但是由于部分生產(chǎn)者有意或無意 的改名,造成猴頭菇的栽培菌種存在"異種同名或同種異名"的混亂現(xiàn) 象。這種現(xiàn)象極大地?fù)p害了育種者和生產(chǎn)者的利益,不但給科學(xué)研究和學(xué) 術(shù)交流帶來障礙,而且對(duì)規(guī)范生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定帶來很大困難。優(yōu)質(zhì)菌種在猴頭菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)舉足輕重,這決定了猴頭菇菌 種在猴頭菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn),對(duì) 猴頭菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來越高,需要更為簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株 鑒定技術(shù),以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無誤。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭 菇菌種猴王的快速檢測方法。本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭燕菌種猴王的方法有2種,2種 鑒定方法都包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記 的檢測建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測; 方法一的特征在于1、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測,使用的檢測引物是猴王F1/R1,其中, 猴王Fl是5'-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3',,猴王Rl是 5'隱TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3';2、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10XPCR buffer 2. 5 |_il, 25畫1/L MgCL2 1 (il, 2.5 m mol/L dNTP 2 |il, 5固TaqDNA Polymerase 0.3 |al, 10 y mol/L檢測引物各1 pl, lng 10ng/(il模板 DNA 1^1, ddH20 16.2 (il;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94。C lmin; 94°C 45second, 62°C 45second, 72°C lmin, 30個(gè)循環(huán);72°C 5min;3、 SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示,擴(kuò)增 出的分子量為1012bp的特異DNA條帶,為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。方法二的特征在于1、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測,使用的檢測引物是猴王F2/R2,其中, 猴王F2是5'-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT陽3',猴王R2是 5'-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC-3,;2、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10XPCR buffer 2. 5 pl, 25mmol/L MgCL2 1 |il, 2.5 m mol/L dNTP 2 (il, 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 fil, 10 u mol/L檢測引物各1 pl, lng 10ng/Vl模板 DNA l^d, ddH20 16.2 pi;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94°C lmin; 94°C 45second, 67°C 45second, 72°C lmin, 30個(gè)循環(huán);72°C 5min;3、 SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示,擴(kuò)增 出的分子量為371bp的特異DNA條帶,為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。本發(fā)明提供的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種的方法,具有靈敏 度高,所需要的DNA用量少,與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn) 相比,具有檢測時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。具體如 下1、 檢測時(shí)間短該檢測方法所需時(shí)間只需要2 — 3天,而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間,常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測和出菇試驗(yàn)則需要至少2個(gè)月的時(shí)間。2、 準(zhǔn)確性高、容易判斷,而且重復(fù)性好該檢測方法以基因組DNA 為材料,DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì),不易受外界因素等的影響,同時(shí)它的 1012bp或371bp的顯性標(biāo)記判斷一目了然,減少人為判斷的偏差,大大提 高了準(zhǔn)確性;常規(guī)的拮抗試驗(yàn)中,拮抗表現(xiàn)形式至少有3種,甚至更多, 有時(shí)表現(xiàn)形式不明顯,還受培養(yǎng)環(huán)境的影響,拮抗表現(xiàn)不僅在種內(nèi)的不同品種之間會(huì)出現(xiàn),同時(shí)在種間的菌株之間也會(huì)表現(xiàn)出來,給準(zhǔn)確判斷造成 困難;出菇試驗(yàn)更容易受到環(huán)境、時(shí)間等各方因素的影響,重復(fù)性差,加 大了檢測困難;形態(tài)學(xué)檢測在同一屬種內(nèi)的不同品種之間可區(qū)別的特征 少,有些甚至沒有什么差異,同時(shí)還需要判斷者具有豐富的知識(shí)與經(jīng)驗(yàn), 方可做出準(zhǔn)確的判斷。3、此外該方法得到的顯性標(biāo)記可減少猴頭菇新品種認(rèn)定的工作量, 檢測時(shí)該方法只需要1個(gè)陽性菌株和1個(gè)陰性菌株對(duì)照便可快速比較,而 用常規(guī)形態(tài)學(xué)、拮抗試驗(yàn)、出燕試驗(yàn)方法來認(rèn)定一個(gè)新品種,需要將所有 同種內(nèi)的不同品種一起搬出來比較,才能做出正確的認(rèn)定,這就要很大的 人力和物力,當(dāng)品種多時(shí)可能使得認(rèn)定工作無法進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)猴頭菇種質(zhì)資源的利用和新品種的登記工作,提供了更為有 效的菌種鑒定體系,以及加強(qiáng)對(duì)我國猴頭燕種質(zhì)資源的保護(hù)工作都具有重 要意義。


圖1為采用第一種方法檢測猴頭菇菌種擴(kuò)增的DNA圖 譜。其中1 M為泳道編號(hào);右側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量,箭頭 所指是猴王菌株特異性標(biāo)記。圖2為采用第二種方法檢測猴頭菇菌種擴(kuò)增的DNA圖譜。其中M 17為泳道編號(hào);左側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量,箭頭所指是猴王菌 株特異性標(biāo)記。
具體實(shí)施方式
為了充分公開本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴 頭菇菌種猴王的方法,以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例1: 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法,包括以下步驟一、菌絲培養(yǎng)與收集(一)若供測試猴頭菇菌株的保藏時(shí)間小于6個(gè)月,則菌絲培養(yǎng)按如 下方法進(jìn)行1、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)接入250 ml三角瓶, 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中;2、 放置在25。C搖床上,轉(zhuǎn)速卯 130r/min培養(yǎng)7 10d;3、 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲,蒸餾水沖洗,濾紙吸干;4、稱取0.5 1.3g菌絲,用濾紙包好,保存于-2(TC備用。 (二)若供測試猴頭菇菌株保藏時(shí)間不小于6個(gè)月,則菌絲培養(yǎng)采用 如下方法1、 取猴頭菇菌種豆塊大小轉(zhuǎn)接到PDA斜面上,25'C培養(yǎng)7 10天;2、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)接入250 ml三角瓶, 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中;3、 放置在25。C搖床上,轉(zhuǎn)速90 130r/min培養(yǎng)7 10d;4、 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲,蒸餾水沖洗,濾紙吸干;5、 稱取0.5 1.3g菌絲,用濾紙包好,保存于-2(TC備用。二、基因組DNA的提取,所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子 實(shí)休中提取。1、 取保存?zhèn)溆玫暮镱^菇菌絲0.5 1.3§,或子實(shí)體0.5 1.3g,放入研缽,加入液氮迅速研磨成粉末,轉(zhuǎn)入7ml的離心管;2、 加2.5 mL 65。C預(yù)熱的抽提液,同時(shí)加入50 pl巰基乙醇,上下震蕩,使蛋白質(zhì)變性沉淀;3、 65。C水浴lh,每隔10min振蕩l次;4、 加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻,除去蛋白質(zhì);5、 8000 r7min, 4。C離心10min,取上清到7ml離心管;6、 力卩1/5體積65。C預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻,加入2. 5 ml的氯仿異戊 醇混勻;7、 10000r/min, 4。C離心10min,取上清;8、 加入2. 5ml 65。C預(yù)熱的CTAB沉淀液,顛倒混勻,65。C水浴lh至 沉淀可見或可過夜;9、 12000r/min,4。C離心10min后,小心去除上清液;10、 用0. 5ml TE溶液或無菌水溶解沉淀10min;11、 加入0. 25ml飽和酚和0. 25m L氯仿異戊醇,混勻;12、 12000 r/min, 4。C離心10min,取上清,加入2倍體積預(yù)冷的無 水乙醇,混勻;13、 放置-2(TC冰箱lh或過夜;14、 12000 r/min, 4。C離心10 min,棄上清;15、自然風(fēng)干沉淀,用30 plTE溶液或無菌去離子水溶解沉淀,_2(TC 保存?zhèn)溆?。三?SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立 SCAR-PCR擴(kuò)增體系10XPCR buffer 2. 5 |il, 25mmol/L MgCL21pl, 2.5 m mol/L dNTP 2 [d, 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 jxl, 10 p mol/L 專用檢測引物猴王Fl/Rl 1^1, lng 10ng/Vl模板DNA 1^1, ddH20 16. 2 pl。 SCAR隱PCR反應(yīng)條件94°C lmin; 94°C 45second, 62°C 45second, 72°C lmin, 30個(gè)循環(huán);72°C 5min。所述專用檢測引物猴王Fl/Rl,是采用PCR技術(shù),經(jīng)過大量的篩選試 驗(yàn),獲得了猴頭恭菌種猴王的特異DNA片斷,以此片段的DNA序列為基礎(chǔ), 設(shè)計(jì)猴王菌種的特異檢測引物。所述專用檢測引物猴王Fl/Rl具體內(nèi)容為 猴王Fl是5'-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3',猴王Rl是 5'-TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3'。四、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測具體檢測方法為,取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 |il加上1.5 |il 6X溴酚藍(lán)上樣 緩沖液,混勻,在1. 0%瓊脂糖凝膠,含GoldviewTMDNA染料進(jìn)行電泳,5V/cm 恒壓電泳50min,通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像?;蛘?,取PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物8 ^,與1. 5 ^ 6X溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻,點(diǎn)樣于1%的瓊醋糖凝膠 上,于0. 5 X TBE緩沖液屮,5V/cm恒壓電泳0.5 lh,電泳結(jié)束后,用 EB染色,然后在凝膠成像儀上照相。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果,如圖1所示,采用檢測引物猴王F1/R1對(duì)猴 頭菇菌株進(jìn)行SCAR—PCR擴(kuò)增,只有猴王菌株能擴(kuò)增出分子量為1012bp 的DNA條帶。實(shí)施例2: —種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法,包括以下步驟 --、菌絲培養(yǎng)與收集,具體方法與實(shí)施例l的步驟一相同;二、 基因組DNA的提取,所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子 實(shí)體中提取;具體方法與實(shí)施例1的步驟二相同;三、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立,其中,SCAR-PCR擴(kuò)增體系與 實(shí)施例l步驟三的擴(kuò)增體系相同;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94°C lmin;94°C 45second, 67°C 45second, 72°C lmin, 30個(gè)循環(huán);72°C 5min。 所述專用檢測引物猴王F2/R2,是采用PCR技術(shù),經(jīng)過大量的篩選試驗(yàn), 獲得了猴頭菇菌種猴王的特異DNA片斷,以此片段的DNA序列為基礎(chǔ),設(shè) 計(jì)猴王菌種的特異檢測引物。所述專用檢測引物猴王F2/R2具體內(nèi)容為 猴王F2是5'-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT隱3',猴王R2是 5'-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC-3'。四、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測,具體方法與實(shí)施例l步驟四的具體檢測方法 相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果,如圖2所示,采用檢測引物猴王F2/R2對(duì) 猴頭菇菌株進(jìn)行SCAR—PCR擴(kuò)增,只有猴王菌株能擴(kuò)增出分子量為371bp 的DNA條帶。本發(fā)明所使用的主要試劑如下(所有化學(xué)試劑均為分析純)1、 CTAB抽提液100腿ol/L Tris-HC1, 2. 0% CTAB, 20腿ol/L EDTA, 1.4 mol/L NaCl, pH 8.0;2、 CTAB沉淀液50咖ol/LTris-HC1, 1.0%CTAB, 10 ramol/L EDTA, pH 8.0;3、 CTAB/NaCl: 0.7 mol/L NaCl,腦CTAB;4、 TE緩沖液10腿ol/L Tris HC1 , 1 mmol/L EDTA;5、 0.5XTBE: 44. 5畫1/L Tris, 50 ,1/L鵬3、 1畫1/L EDTA;6、 上樣緩沖液0.1%溴酚藍(lán),40%蔗糖;7、 EB: 10mg/ml溴化乙錠;8、 PCR擴(kuò)增試劑購自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的主要儀器如下SW-CJ-1FB型單人水平垂直兩用凈 化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司; 手提式滅菌鍋上海三申; HYG-A全溫?fù)u瓶柜太倉市實(shí)驗(yàn)室; 冷凍離心機(jī)Sigma 3K30; PCR擴(kuò)增儀Eppendorf AG22331 Hamburg;掌型離心機(jī)江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-100手掌型離心機(jī);凝膠成像系統(tǒng)TANON-2008。序列表SEQUENCE LISTING<110〉福建農(nóng)林大學(xué)<120〉利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法<130〉<160>4<170>Patentln version 3. 1<210>1〈211〉25<212>DNA<213〉猴頭菇<400〉1ctcctccctt cacaataaat agcca<210〉2〈211〉25<212>DNA<213>猴頭菇<400>2tccctgaact tctttgtctt cccgt<210〉3<211〉25<212>DNA<213>猴頭菇<400>3ccctccacaa ccaccacaag ataat<210>4<211〉25〈212〉DNA<213>猴頭菇〈400〉 4ctcctcgccg tctgcataag aactc
權(quán)利要求
1、一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法,包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測;其特征在于(1)SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測,使用的檢測引物是猴王F1/R1,其中,猴王F1是5′-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3′’,猴王R1是5′-TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3′;(2)SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10×PCRbuffer 2.5μl,25mmol/L MgCL2 1μl,2.5m mol/L dNTP 2μl,5U/ul TaqDNA Polymerase 0.3μl,10μmol/L檢測引物各1μl,1ng~10ng/μl模板DNA 1μl,ddH2O 16.2μl;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94℃ 1min;94℃ 45second,62℃ 45second,72℃ 1min,30個(gè)循環(huán);72℃ 5min;(3)SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示,擴(kuò)增出的分子量為1012bp的特異DNA條帶,為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。
2、 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法,包括菌絲培 養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立和SCAR-PCR 產(chǎn)物的檢測;其特征在于(1) SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測,使用的檢測引物是猴王F2/R2,其 中,猴王F2是5'-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT-3',猴王R2是 5'-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC國3';(2) SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10X PCR buffer 2. 5 (il, 25畫1/L MgCL2 1 pl, 2.5 m mol/L dNTP 2 pl, 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 |il, 10 u mol/L檢測引物各1 jal, lng 10ng/(il 模板DNA l|_d, ddH20 16.2 pi;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94°C lmin; 94°C 45second, 67°C 45second, 72°C lmin, 30個(gè)循環(huán);72°C 5min;(3) SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示, 擴(kuò)增出的分子量為371bp的特異DNA條帶,為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。
全文摘要
利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明使用2對(duì)不同的引物猴王F1/R1和猴王F2/R2,對(duì)供測試的菌株進(jìn)行SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測;當(dāng)使用猴王F1/R1檢測引物時(shí),SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在DNA圖譜中顯示的分子量為1012bp的特異DNA條帶,為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志;當(dāng)使用猴王F2/R2檢測引物時(shí),SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在DNA圖譜中顯示的分子量為371bp的特異DNA條帶,為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101402995SQ20081007213
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者劉新銳, 江玉姬, 溫志強(qiáng), 謝寶貴, 鄧優(yōu)錦 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)
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