專利名稱：利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法
利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭燕菌種猴王的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種微生物的鑒定方法，具體涉及利用分子 標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
猴頭菇(Z/en'c/Mm er/wac醋)肉嫩味美，營養(yǎng)豐富。很早 以前，人們把它與熊掌、海參、鯊魚翅并列為"四大名菜"，有"山珍猴頭， 海味燕窩"的美稱，在古代被作為貢品。人體必需的9種氨基酸，猴頭菇都 含有。據(jù)報(bào)道，猴頭菇所含有的營養(yǎng)成分與目前人工栽培的其它食用菌品 種相比都居第一、二位，因而顯得更加珍貴。我國食用菌資源豐富，品種比較多，但是由于部分生產(chǎn)者有意或無意 的改名，造成猴頭菇的栽培菌種存在"異種同名或同種異名"的混亂現(xiàn) 象。這種現(xiàn)象極大地?fù)p害了育種者和生產(chǎn)者的利益，不但給科學(xué)研究和學(xué) 術(shù)交流帶來障礙，而且對(duì)規(guī)范生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定帶來很大困難。優(yōu)質(zhì)菌種在猴頭菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)舉足輕重，這決定了猴頭菇菌 種在猴頭菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對(duì) 猴頭菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來越高，需要更為簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株 鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無誤。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭 菇菌種猴王的快速檢測方法。本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭燕菌種猴王的方法有2種，2種 鑒定方法都包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記 的檢測建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測； 方法一的特征在于1、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測，使用的檢測引物是猴王F1/R1，其中， 猴王Fl是5'-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3'，，猴王Rl是 5'隱TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3';2、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10XPCR buffer 2. 5 |_il， 25畫1/L MgCL2 1 (il， 2.5 m mol/L dNTP 2 |il， 5固TaqDNA Polymerase 0.3 |al， 10 y mol/L檢測引物各1 pl， lng 10ng/(il模板 DNA 1^1， ddH20 16.2 (il;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94。C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min;3、 SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴(kuò)增 出的分子量為1012bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。方法二的特征在于1、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測，使用的檢測引物是猴王F2/R2，其中， 猴王F2是5'-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT陽3'，猴王R2是 5'-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC-3,;2、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10XPCR buffer 2. 5 pl， 25mmol/L MgCL2 1 |il， 2.5 m mol/L dNTP 2 (il， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 fil， 10 u mol/L檢測引物各1 pl， lng 10ng/Vl模板 DNA l^d， ddH20 16.2 pi;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94°C lmin; 94°C 45second， 67°C 45second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán);72°C 5min;3、 SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴(kuò)增 出的分子量為371bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。本發(fā)明提供的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種的方法，具有靈敏 度高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn) 相比，具有檢測時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。具體如 下1、 檢測時(shí)間短該檢測方法所需時(shí)間只需要2 — 3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測和出菇試驗(yàn)則需要至少2個(gè)月的時(shí)間。2、 準(zhǔn)確性高、容易判斷，而且重復(fù)性好該檢測方法以基因組DNA 為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，不易受外界因素等的影響，同時(shí)它的 1012bp或371bp的顯性標(biāo)記判斷一目了然，減少人為判斷的偏差，大大提 高了準(zhǔn)確性；常規(guī)的拮抗試驗(yàn)中，拮抗表現(xiàn)形式至少有3種，甚至更多， 有時(shí)表現(xiàn)形式不明顯，還受培養(yǎng)環(huán)境的影響，拮抗表現(xiàn)不僅在種內(nèi)的不同品種之間會(huì)出現(xiàn)，同時(shí)在種間的菌株之間也會(huì)表現(xiàn)出來，給準(zhǔn)確判斷造成 困難；出菇試驗(yàn)更容易受到環(huán)境、時(shí)間等各方因素的影響，重復(fù)性差，加 大了檢測困難；形態(tài)學(xué)檢測在同一屬種內(nèi)的不同品種之間可區(qū)別的特征 少，有些甚至沒有什么差異，同時(shí)還需要判斷者具有豐富的知識(shí)與經(jīng)驗(yàn)， 方可做出準(zhǔn)確的判斷。3、此外該方法得到的顯性標(biāo)記可減少猴頭菇新品種認(rèn)定的工作量， 檢測時(shí)該方法只需要1個(gè)陽性菌株和1個(gè)陰性菌株對(duì)照便可快速比較，而 用常規(guī)形態(tài)學(xué)、拮抗試驗(yàn)、出燕試驗(yàn)方法來認(rèn)定一個(gè)新品種，需要將所有 同種內(nèi)的不同品種一起搬出來比較，才能做出正確的認(rèn)定，這就要很大的 人力和物力，當(dāng)品種多時(shí)可能使得認(rèn)定工作無法進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)猴頭菇種質(zhì)資源的利用和新品種的登記工作，提供了更為有 效的菌種鑒定體系，以及加強(qiáng)對(duì)我國猴頭燕種質(zhì)資源的保護(hù)工作都具有重 要意義。
圖1為采用第一種方法檢測猴頭菇菌種擴(kuò)增的DNA圖 譜。其中1 M為泳道編號(hào)；右側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量，箭頭 所指是猴王菌株特異性標(biāo)記。圖2為采用第二種方法檢測猴頭菇菌種擴(kuò)增的DNA圖譜。其中M 17為泳道編號(hào)；左側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量，箭頭所指是猴王菌 株特異性標(biāo)記。
具體實(shí)施方式
為了充分公開本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴 頭菇菌種猴王的方法，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例1: 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法，包括以下步驟一、菌絲培養(yǎng)與收集(一)若供測試猴頭菇菌株的保藏時(shí)間小于6個(gè)月，則菌絲培養(yǎng)按如 下方法進(jìn)行1、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接入250 ml三角瓶， 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中；2、 放置在25。C搖床上，轉(zhuǎn)速卯 130r/min培養(yǎng)7 10d;3、 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；4、稱取0.5 1.3g菌絲，用濾紙包好，保存于-2(TC備用。 (二)若供測試猴頭菇菌株保藏時(shí)間不小于6個(gè)月，則菌絲培養(yǎng)采用 如下方法1、 取猴頭菇菌種豆塊大小轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25'C培養(yǎng)7 10天；2、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接入250 ml三角瓶， 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中；3、 放置在25。C搖床上，轉(zhuǎn)速90 130r/min培養(yǎng)7 10d;4、 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；5、 稱取0.5 1.3g菌絲,用濾紙包好，保存于-2(TC備用。二、基因組DNA的提取，所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子 實(shí)休中提取。1、 取保存?zhèn)溆玫暮镱^菇菌絲0.5 1.3§，或子實(shí)體0.5 1.3g，放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7ml的離心管；2、 加2.5 mL 65。C預(yù)熱的抽提液，同時(shí)加入50 pl巰基乙醇，上下震蕩,使蛋白質(zhì)變性沉淀；3、 65。C水浴lh，每隔10min振蕩l次；4、 加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質(zhì)；5、 8000 r7min， 4。C離心10min，取上清到7ml離心管；6、 力卩1/5體積65。C預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入2. 5 ml的氯仿異戊 醇混勻；7、 10000r/min， 4。C離心10min，取上清；8、 加入2. 5ml 65。C預(yù)熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65。C水浴lh至 沉淀可見或可過夜；9、 12000r/min，4。C離心10min后，小心去除上清液；10、 用0. 5ml TE溶液或無菌水溶解沉淀10min;11、 加入0. 25ml飽和酚和0. 25m L氯仿異戊醇，混勻；12、 12000 r/min， 4。C離心10min，取上清，加入2倍體積預(yù)冷的無 水乙醇，混勻；13、 放置-2(TC冰箱lh或過夜；14、 12000 r/min， 4。C離心10 min，棄上清；15、自然風(fēng)干沉淀，用30 plTE溶液或無菌去離子水溶解沉淀，_2(TC 保存?zhèn)溆?。三?SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立 SCAR-PCR擴(kuò)增體系10XPCR buffer 2. 5 |il， 25mmol/L MgCL21pl， 2.5 m mol/L dNTP 2 [d， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 jxl， 10 p mol/L 專用檢測引物猴王Fl/Rl 1^1， lng 10ng/Vl模板DNA 1^1， ddH20 16. 2 pl。 SCAR隱PCR反應(yīng)條件94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min。所述專用檢測引物猴王Fl/Rl，是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試 驗(yàn)，獲得了猴頭恭菌種猴王的特異DNA片斷，以此片段的DNA序列為基礎(chǔ)， 設(shè)計(jì)猴王菌種的特異檢測引物。所述專用檢測引物猴王Fl/Rl具體內(nèi)容為 猴王Fl是5'-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3'，猴王Rl是 5'-TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3'。四、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測具體檢測方法為，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 |il加上1.5 |il 6X溴酚藍(lán)上樣 緩沖液，混勻，在1. 0%瓊脂糖凝膠，含GoldviewTMDNA染料進(jìn)行電泳，5V/cm 恒壓電泳50min，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像?；蛘?，取PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物8 ^，與1. 5 ^ 6X溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1%的瓊醋糖凝膠 上，于0. 5 X TBE緩沖液屮，5V/cm恒壓電泳0.5 lh，電泳結(jié)束后，用 EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果，如圖1所示，采用檢測引物猴王F1/R1對(duì)猴 頭菇菌株進(jìn)行SCAR—PCR擴(kuò)增，只有猴王菌株能擴(kuò)增出分子量為1012bp 的DNA條帶。實(shí)施例2: —種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法，包括以下步驟 --、菌絲培養(yǎng)與收集，具體方法與實(shí)施例l的步驟一相同；二、 基因組DNA的提取，所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子 實(shí)體中提取；具體方法與實(shí)施例1的步驟二相同；三、 SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立，其中，SCAR-PCR擴(kuò)增體系與 實(shí)施例l步驟三的擴(kuò)增體系相同；SCAR-PCR反應(yīng)條件為94°C lmin;94°C 45second， 67°C 45second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min。 所述專用檢測引物猴王F2/R2，是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試驗(yàn)， 獲得了猴頭菇菌種猴王的特異DNA片斷，以此片段的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè) 計(jì)猴王菌種的特異檢測引物。所述專用檢測引物猴王F2/R2具體內(nèi)容為 猴王F2是5'-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT隱3'，猴王R2是 5'-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC-3'。四、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測，具體方法與實(shí)施例l步驟四的具體檢測方法 相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果，如圖2所示，采用檢測引物猴王F2/R2對(duì) 猴頭菇菌株進(jìn)行SCAR—PCR擴(kuò)增，只有猴王菌株能擴(kuò)增出分子量為371bp 的DNA條帶。本發(fā)明所使用的主要試劑如下(所有化學(xué)試劑均為分析純)1、 CTAB抽提液100腿ol/L Tris-HC1， 2. 0% CTAB， 20腿ol/L EDTA， 1.4 mol/L NaCl， pH 8.0;2、 CTAB沉淀液50咖ol/LTris-HC1， 1.0%CTAB， 10 ramol/L EDTA， pH 8.0;3、 CTAB/NaCl: 0.7 mol/L NaCl，腦CTAB;4、 TE緩沖液10腿ol/L Tris HC1 ， 1 mmol/L EDTA;5、 0.5XTBE: 44. 5畫1/L Tris， 50 ,1/L鵬3、 1畫1/L EDTA;6、 上樣緩沖液0.1%溴酚藍(lán),40%蔗糖；7、 EB: 10mg/ml溴化乙錠；8、 PCR擴(kuò)增試劑購自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的主要儀器如下SW-CJ-1FB型單人水平垂直兩用凈 化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司； 手提式滅菌鍋上海三申； HYG-A全溫?fù)u瓶柜太倉市實(shí)驗(yàn)室； 冷凍離心機(jī)Sigma 3K30; PCR擴(kuò)增儀Eppendorf AG22331 Hamburg;掌型離心機(jī)江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-100手掌型離心機(jī)；凝膠成像系統(tǒng)TANON-2008。序列表SEQUENCE LISTING<110〉福建農(nóng)林大學(xué)<120〉利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法<130〉<160>4<170>Patentln version 3. 1<210>1〈211〉25<212>DNA<213〉猴頭菇<400〉1ctcctccctt cacaataaat agcca<210〉2〈211〉25<212>DNA<213>猴頭菇<400>2tccctgaact tctttgtctt cccgt<210〉3<211〉25<212>DNA<213>猴頭菇<400>3ccctccacaa ccaccacaag ataat<210>4<211〉25〈212〉DNA<213>猴頭菇〈400〉 4ctcctcgccg tctgcataag aactc
權(quán)利要求
1、一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法，包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測；其特征在于(1)SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測，使用的檢測引物是猴王F1/R1，其中，猴王F1是5′-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3′’，猴王R1是5′-TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3′；(2)SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10×PCRbuffer 2.5μl，25mmol/L MgCL2 1μl，2.5m mol/L dNTP 2μl，5U/ul TaqDNA Polymerase 0.3μl，10μmol/L檢測引物各1μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH2O 16.2μl；SCAR-PCR反應(yīng)條件為94℃ 1min；94℃ 45second，62℃ 45second，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5min；(3)SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴(kuò)增出的分子量為1012bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。
2、 一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法，包括菌絲培 養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立和SCAR-PCR 產(chǎn)物的檢測；其特征在于(1) SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測，使用的檢測引物是猴王F2/R2，其 中，猴王F2是5'-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT-3'，猴王R2是 5'-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC國3';(2) SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立SCAR-PCR擴(kuò)增體系為10X PCR buffer 2. 5 (il， 25畫1/L MgCL2 1 pl， 2.5 m mol/L dNTP 2 pl， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 |il， 10 u mol/L檢測引物各1 jal， lng 10ng/(il 模板DNA l|_d， ddH20 16.2 pi;SCAR-PCR反應(yīng)條件為94°C lmin; 94°C 45second， 67°C 45second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min;(3) SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示， 擴(kuò)增出的分子量為371bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。
全文摘要
利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定猴頭菇菌種猴王的方法包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測建立和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明使用2對(duì)不同的引物猴王F1/R1和猴王F2/R2，對(duì)供測試的菌株進(jìn)行SCAR-PCR分子標(biāo)記的檢測和SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測；當(dāng)使用猴王F1/R1檢測引物時(shí)，SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在DNA圖譜中顯示的分子量為1012bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志；當(dāng)使用猴王F2/R2檢測引物時(shí)，SCAR-PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果在DNA圖譜中顯示的分子量為371bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標(biāo)志。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101402995SQ20081007213
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者劉新銳, 江玉姬, 溫志強(qiáng), 謝寶貴, 鄧優(yōu)錦 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)