一種基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片的制作方法

本發(fā)明屬于微流控領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片。

背景技術(shù)：

微流控芯片技術(shù)是一種在微尺度空間中對(duì)流體進(jìn)行操控的科學(xué)技術(shù)，利用該技術(shù)分離細(xì)胞時(shí)，方法簡(jiǎn)單、分離成功率高，易于推廣普及，受到廣泛關(guān)注。

在現(xiàn)有的文獻(xiàn)和專利中提出的依據(jù)慣性原理分離細(xì)胞的流道結(jié)構(gòu)一般為：螺旋型和縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)。這兩種結(jié)構(gòu)具有一些缺陷。對(duì)于螺旋型結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，由于芯片所能承受的壓強(qiáng)有限，所以該結(jié)構(gòu)提供的fd(即，迪恩力)和fl(即，慣性升力)較小，限制了分離效率。對(duì)于縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，雖然其依靠縮擴(kuò)陣列能夠提供較大的fd和fl，但是不能在整個(gè)流道中一直提供fd，只有當(dāng)細(xì)胞從拓寬段流入收縮段時(shí)才能受到fd的影響。

以螺旋結(jié)構(gòu)為例，現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)【3】公開(kāi)了一種基于慣性分離原理的螺旋結(jié)構(gòu)用于從血液中分離出紅細(xì)胞。該結(jié)構(gòu)采用一個(gè)樣品入口，一個(gè)螺旋式流道和一個(gè)二叉出口。該螺旋流道由5圈阿基米德螺旋形微通道組成，通道的橫截面為矩形面，該矩形面的寬為100um，高為50um，曲線總長(zhǎng)13cm，螺旋最內(nèi)側(cè)的曲率半徑為3mm。該學(xué)者將血液以0.15m/s的速率從樣品入口注入，在二叉口的下出口處收集7.32um顆粒，在二叉口的上出口處收集1.9um顆粒。

如圖3所示，該螺旋結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離原理為：在彎形流道中細(xì)胞會(huì)受到慣性升力fl和迪恩力fd兩個(gè)力的共同作用。fl和fd之間的平衡決定了細(xì)胞在微通道的平衡位置。當(dāng)fl≥fd時(shí)，細(xì)胞往側(cè)壁s1移動(dòng)，當(dāng)fl＜fd時(shí)，細(xì)胞往側(cè)壁s2移動(dòng)；尺寸較大的細(xì)胞所受fl較大，尺寸較小的細(xì)胞所受fd較大。經(jīng)過(guò)一定長(zhǎng)度的流道，大粒子與小粒子就分離開(kāi)來(lái)。

在上述方法中，由于芯片所能承受的壓強(qiáng)有限，所以該結(jié)構(gòu)提供的fd和fl較小，限制了分離效率。再者，受其流道結(jié)構(gòu)的限制，不同細(xì)胞所處的橫向平衡位置之間的間距較小。最后為了達(dá)到預(yù)期的分離效果，所需流道總長(zhǎng)度往往較長(zhǎng)，有其他文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)用于細(xì)胞分離，該結(jié)構(gòu)所需的流道總長(zhǎng)度較短，但是在該設(shè)計(jì)中，細(xì)胞只有在從拓寬段進(jìn)入壓縮段時(shí)，才會(huì)受到fd和fl兩個(gè)力的共同作用。其余階段僅受慣性升力fl的影響。fd作用在細(xì)胞上的時(shí)間十分短暫，且不能保證在如此之短的時(shí)間內(nèi)是否所有的細(xì)胞都受到了fd的影響。

下面針對(duì)單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)分析，現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)【1】公開(kāi)了一種單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)采用一個(gè)樣品入口，一個(gè)鞘液流入口，兩個(gè)出口，六個(gè)單側(cè)拓寬腔和五個(gè)收縮段，用以分離血細(xì)胞和血漿(尺寸為2um及2um以下的細(xì)胞)；該學(xué)者以1.2ml/h的速率往樣品入口注入血液樣品，以12ml/h的速率往鞘液流入口注入磷酸鹽緩沖液，在兩個(gè)出口處分別收集到了血細(xì)胞(尺寸為2um以上的細(xì)胞)和血漿(尺寸為2um及2um以下的細(xì)胞)，但是血漿(尺寸為2um及2um以下的細(xì)胞)分離效率僅為62.2％。

單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離原理為：如圖4所示，在長(zhǎng)直型矩形微通道中，細(xì)胞主要受慣性升力fl的影響，從而使細(xì)胞聚焦在靠近矩形長(zhǎng)邊的上下兩個(gè)平衡位置；在彎形流道中，細(xì)胞會(huì)受到慣性升力fl和迪恩力fd兩個(gè)力的共同作用。當(dāng)液體從拓寬段進(jìn)入壓縮段時(shí)，拓寬段的液體以彎曲的路徑加速進(jìn)入壓縮段，產(chǎn)生了迪恩渦流，細(xì)胞在此迪恩渦流中會(huì)受到迪恩力fd的影響，所以細(xì)胞在從拓寬段進(jìn)入壓縮段時(shí)，將會(huì)受到fl和fd兩個(gè)力的共同作用。fl與fd的大小均與細(xì)胞在溝道的橫截面上所處的位置有關(guān)。fl和fd之間的平衡決定了細(xì)胞在微通道中的平衡位置。當(dāng)fl≥fd時(shí)，細(xì)胞往側(cè)壁s1移動(dòng)，當(dāng)fl＜fd時(shí)，細(xì)胞往側(cè)壁s2移動(dòng)；尺寸較大的細(xì)胞所受fl較大，尺寸較小的細(xì)胞所受fd較大。經(jīng)過(guò)若干個(gè)縮擴(kuò)陣列，血細(xì)胞(尺寸為2um以上的細(xì)胞)和血漿(尺寸為2um及2um以下的細(xì)胞)就分離開(kāi)來(lái)。

在上述方法中，細(xì)胞只有在從拓寬段進(jìn)入壓縮段時(shí)，才會(huì)受到fd和fl兩個(gè)力的共同作用。其余階段僅受慣性升力fl的影響。fd作用在細(xì)胞上的時(shí)間十分短暫，且不能保證在如此之短的時(shí)間內(nèi)是否所有的細(xì)胞都受到了fd的影響。

其次，由于在其他階段，細(xì)胞僅受fl的影響，fl會(huì)將移向側(cè)壁s1和s2的細(xì)胞拉向流道中心，使得已處于預(yù)期平衡位置的細(xì)胞偏離平衡位置，從而在一定程度上降低了分離效率。

參考文獻(xiàn)如下：

【1】"inertialbloodplasmaseparationinacontraction–expansionarraymicrochannel"；

【2】"enhancedbloodplasmaseparationbymodulationofinertialliftforce"；

【3】"continuousparticleseparationinspiralmicrochannelsusingdeanflowsanddifferentialmigration"；

【4】"improvedunderstandingofparticlemigrationmodesinspiralinertialmicrofluidicdevices"；

【5】"continuousinertialmicroparticleandbloodcellseparationinstraightchannelswithlocalmicrostructures"。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明的目的在于提供一種基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片，其中通過(guò)對(duì)其關(guān)鍵的流道結(jié)構(gòu)的設(shè)置方式等(尤其是對(duì)流道內(nèi)拓寬段與壓縮段的形狀及相關(guān)參數(shù))進(jìn)行改進(jìn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比能夠有效解決單一螺旋結(jié)構(gòu)、以及單一單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)兩者細(xì)胞分離效率低的問(wèn)題，并且本發(fā)明通過(guò)控制流道內(nèi)每段拓寬段與壓縮段的長(zhǎng)度、寬度、以及流道總長(zhǎng)及高度，使得該芯片尤其能以3um和6um尺寸為界限，分離細(xì)胞。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明，提供了一種基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片，其特征在于，包括基體、以及位于該基體內(nèi)的流道(3)，該芯片還包括與所述流道(3)相連的樣品入口(1)、鞘液流入口(2)、大尺寸細(xì)胞出口(4)和小尺寸細(xì)胞出口(5)；

其中，

所述樣品入口(1)用于向所述流道(3)的入口輸入待分離處理的細(xì)胞溶液；

所述鞘液流入口(2)用于向所述流道(3)的入口輸入鞘液流，該鞘液流用于與所述細(xì)胞溶液混合；

所述流道(3)為螺旋形或弧形；該流道(3)具有相對(duì)設(shè)置的第一側(cè)壁(s1)和第二側(cè)壁(s2)，其中所述第一側(cè)壁(s1)位于靠近螺旋中心或弧形中心的內(nèi)側(cè)，所述第二側(cè)壁(s2)位于遠(yuǎn)離螺旋中心或弧形中心的外側(cè)；所述第一側(cè)壁(s1)上設(shè)置有沿該流道(3)間隔分布的凸槽，使得該流道(3)形成交錯(cuò)分布的拓寬段與壓縮段，所述拓寬段對(duì)應(yīng)第一側(cè)壁上分布有凸槽的區(qū)域，所述壓縮段則對(duì)應(yīng)第一側(cè)壁上沒(méi)有凸槽的區(qū)域；該流道(3)用于對(duì)混合有鞘液流的細(xì)胞溶液中的細(xì)胞按大小進(jìn)行分離；

所述大尺寸細(xì)胞出口(4)位于靠近螺旋中心或弧形中心的一側(cè)，用于從所述流道(3)的出口輸出含有大尺寸細(xì)胞的細(xì)胞分離液；

所述小尺寸細(xì)胞出口(5)位于遠(yuǎn)離螺旋中心或弧形中心的一側(cè)，用于從所述流道(3)的出口輸出含有小尺寸細(xì)胞的細(xì)胞分離液；

此外，所述流道(3)的入口和出口分別位于該流道(3)的兩端。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述流道(3)中，任意一段所述拓寬段的弧長(zhǎng)為300～700um，任意一段所述壓縮段的弧長(zhǎng)為300～1200um；優(yōu)選的，所述拓寬段的寬度為350um，所述壓縮段的寬度為50um；該流道(3)的流道高度為20～25um；優(yōu)選的，該流道(3)上第二側(cè)壁(s2)最靠近所述螺旋中心或所述弧形中心部分的曲率半徑為5mm～7mm。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述流道(3)中，任意一段所述拓寬段的弧長(zhǎng)為700um，任意一段所述壓縮段的弧長(zhǎng)為1200um；所述流道(3)的高度為25um，該流道(3)的總長(zhǎng)為23mm，所需壓縮段的個(gè)數(shù)為11個(gè)，所述拓寬段的個(gè)數(shù)為12個(gè)，該流道(3)上第二側(cè)壁(s2)最靠近所述螺旋中心或所述弧形中心部分的曲率半徑為7mm，所述大尺寸細(xì)胞的粒徑不小于6um，所述小尺寸細(xì)胞的粒徑不超過(guò)3um。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，從所述樣品入口(1)輸入的所述待分離處理的細(xì)胞溶液的流速與從所述鞘液流入口(2)輸入的所述鞘液流的流速之比為1：5。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，當(dāng)所述流道(3)為螺旋形時(shí)，該流道(3)優(yōu)選按阿基米德螺線分布。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述基體包括上下疊加的上基體和下基體，所述流道(3)設(shè)于所述上基體和所述下基體之間。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述鞘液流為磷酸鹽緩沖液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述流道(3)的截面為矩形。

本發(fā)明中基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片通過(guò)將流道設(shè)置成具有單側(cè)縮擴(kuò)陣列的螺旋/弧形結(jié)構(gòu)，能夠有效提高細(xì)胞分離效率。本發(fā)明是在靠近流道螺旋中心或弧形中心的內(nèi)側(cè)壁上設(shè)置沿該流道間隔分布的凸槽，形成具有交錯(cuò)分布的拓寬段與壓縮段結(jié)構(gòu)的流道，進(jìn)一步挖掘了縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)與螺旋流道結(jié)構(gòu)(或弧形流道結(jié)構(gòu))這兩種流道結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)，充分利用流道不同區(qū)域內(nèi)迪恩力與慣性升力的特點(diǎn)，使得縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)與螺旋流道結(jié)構(gòu)(或弧形流道結(jié)構(gòu))兩者有機(jī)結(jié)合，有效的提高了細(xì)胞分離效率。

本發(fā)明是在靠近流道螺旋中心或弧形中心的內(nèi)側(cè)壁上設(shè)置沿該流道間隔分布的凸槽，若沿外側(cè)壁上設(shè)置沿該流道間隔分布的凸槽則不能達(dá)到分離細(xì)胞的目的。當(dāng)沿外側(cè)壁設(shè)置凸槽時(shí)，大顆粒所受的慣性升力是由側(cè)壁s1指向側(cè)壁s2，此時(shí)的慣性升力會(huì)將大粒子拽向側(cè)壁s2；與此同時(shí)，該溝道中小顆粒在拓寬段進(jìn)入壓縮段時(shí)，受的迪恩力也從側(cè)壁s1指向側(cè)壁s2，從而將小顆粒也從側(cè)壁s1拽向側(cè)壁s2，達(dá)不到預(yù)期的分離效果。

表1：3um與6um顆粒在向內(nèi)彎單側(cè)擴(kuò)縮陣列圓弧結(jié)構(gòu)與向外彎單側(cè)擴(kuò)縮陣列圓弧結(jié)構(gòu)相隔距離

注：此時(shí)的相隔距離為6um顆粒最下端與3um顆粒最上端在出口處的相隔距離，此圓弧形外側(cè)壁的曲率半徑均為7mm。表中所述6個(gè)拓寬段表示的是該溝道有6個(gè)拓寬段和5個(gè)壓縮段(壓縮段的數(shù)量一般比拓寬段的數(shù)量少一)。

本發(fā)明最靠近所述螺旋中心或所述弧形中心部分的曲率半徑為5mm～7mm。當(dāng)本發(fā)明的曲率半徑小于5mm時(shí)，會(huì)導(dǎo)致最內(nèi)側(cè)的溝道內(nèi)容納不下入口1，入口2，就結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理性而言，本發(fā)明的曲率半徑不小于5mm。當(dāng)曲率半徑大于7mm時(shí)，會(huì)降低本發(fā)明的分離效率。

表2：3um與6um顆粒在不同曲率半徑下的分離效果

本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的高度一般在20～25um。當(dāng)分離2um及2um以上的顆粒時(shí)，本結(jié)構(gòu)的高度是25um。當(dāng)分離2um以下的顆粒時(shí)，本結(jié)構(gòu)的高度是20um。為保證粒子可在慣性升力作用下聚焦形成單列粒子束，顆粒直徑ap與流道特征尺寸即流道高度h需要滿足ap/h≥0.07。由于大顆粒在溝道中主要受慣性升力的影響，要想讓大顆粒在溝道中呈一條直線從出口流出，必須滿足ap/h≥0.07。故當(dāng)分離顆粒尺寸變小時(shí)，溝道高度也應(yīng)隨之變矮。

表3：3um與6um顆粒在不同高度下的相隔距離

注：此圓弧形外側(cè)壁的曲率半徑均為7mm。

相對(duì)于單一的螺旋結(jié)構(gòu)，本發(fā)明中的單側(cè)縮擴(kuò)陣列螺旋結(jié)構(gòu)能夠在更短的流道中分離細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)至拓寬流道段時(shí)，流道的拓寬使得細(xì)胞受到的壁面誘導(dǎo)慣性升力突然減小，小尺寸細(xì)胞會(huì)向s2側(cè)壁運(yùn)動(dòng)，并穩(wěn)定在新的平衡位置，大尺寸細(xì)胞會(huì)向s1側(cè)壁運(yùn)動(dòng)，并穩(wěn)定在新的平衡位置，造成大尺寸細(xì)胞的平衡位置與小尺寸的細(xì)胞平衡位置之間的間距變大。當(dāng)液體從拓寬段進(jìn)入壓縮段時(shí)，拓寬段的液體以彎曲的路徑加速進(jìn)入壓縮段，該加速會(huì)使細(xì)胞所受的fl和fd在一定程度上加強(qiáng)，從而讓細(xì)胞能夠更快分離。

本發(fā)明中基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片，其單側(cè)縮擴(kuò)陣列螺旋形流道(或單側(cè)縮擴(kuò)陣列弧形流道)，能夠讓細(xì)胞在整個(gè)流道中都受到迪恩力的影響，相對(duì)于現(xiàn)有基于慣性原理分離細(xì)胞的縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)，能夠有效克服現(xiàn)有縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)只有當(dāng)細(xì)胞從拓寬段流入收縮段時(shí)才能受到迪恩力的影響這一缺陷。

現(xiàn)有基于慣性原理分離細(xì)胞的縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)中，處于壓縮段中后部位的細(xì)胞僅受慣性升力的影響，粒子在純慣性升力作用下會(huì)如圖4所示聚焦在靠近長(zhǎng)邊中心的兩個(gè)平衡位置上，故處于壓縮段中后部位的細(xì)胞會(huì)向流道中心偏移，偏離預(yù)期的聚焦平衡位置；而本發(fā)明中所采用的具有單側(cè)縮擴(kuò)陣列螺旋形結(jié)構(gòu)(或弧形結(jié)構(gòu))的流道，能夠讓細(xì)胞在整個(gè)流道中一直受到迪恩力和慣性升力的耦合作用，從而使細(xì)胞固定在預(yù)期的平衡位置上。

本發(fā)明采用單側(cè)縮擴(kuò)陣列螺旋形流道，在一定程度上提高了螺旋結(jié)構(gòu)的分離效率。對(duì)于螺旋結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，如圖5所示當(dāng)細(xì)胞處于平衡位置時(shí)，不同細(xì)胞所處的橫向平衡位置之間的間距較小，易造成部分細(xì)胞混合，導(dǎo)致分離效率降低。本發(fā)明設(shè)計(jì)的單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)螺旋形流道中特殊的單側(cè)縮擴(kuò)陣列能夠讓小尺寸細(xì)胞向s2側(cè)壁運(yùn)動(dòng)，大尺寸細(xì)胞會(huì)向s1側(cè)壁運(yùn)動(dòng)，造成大尺寸細(xì)胞的平衡位置與小尺寸的細(xì)胞平衡位置之間的間距變大，從而提高分離效率。

對(duì)于現(xiàn)有單一的螺旋結(jié)構(gòu)，為達(dá)到預(yù)期的分離效果，所需流道總長(zhǎng)度一般較長(zhǎng)。在分離效果一致的情況下，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的流道能夠在一定程度上縮短流道總長(zhǎng)度。

對(duì)于單一的螺旋結(jié)構(gòu)，由于該溝道尺寸較長(zhǎng)，芯片所能承受的壓強(qiáng)有限，在一定流速內(nèi)，該結(jié)構(gòu)提供的fd和fl較小，限制了分離效率。本發(fā)明設(shè)計(jì)的縮擴(kuò)陣列能解決這一缺陷，當(dāng)細(xì)胞從拓寬段流入壓縮段時(shí)，流道突然變小使得流體加速進(jìn)入壓縮段，且此時(shí)流體的速度呈幾倍增長(zhǎng)，流速的增快提供能夠提供一個(gè)較大的fd和fl，使得細(xì)胞能夠更快的達(dá)到平衡位置。

另外，本發(fā)明中基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片還具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)、微型化。整個(gè)芯片面積僅為幾平方厘米。所需試劑體積僅為微升級(jí)別。

(2)、提高了分離效率。應(yīng)用上述微流控芯片使得大小不同的細(xì)胞經(jīng)過(guò)若干個(gè)圓弧形壓縮拓寬陣列就能分離。

(3)、在線觀測(cè)。該微流控芯片可以直接在ccd倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，用高速攝像機(jī)進(jìn)行圖像記錄，操作方便。

(4)、價(jià)格低廉。芯片材質(zhì)可以采用pdms和有機(jī)玻璃。試劑用量少，明顯地降低了試劑成本。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明具有單側(cè)縮擴(kuò)陣列螺旋結(jié)構(gòu)的分離細(xì)胞芯片其整體結(jié)構(gòu)示意圖及局部放大示意；

圖2是本發(fā)明具有單側(cè)縮擴(kuò)陣列圓弧結(jié)構(gòu)的分離細(xì)胞芯片其整體結(jié)構(gòu)示意圖及局部放大示意；

圖3是現(xiàn)有技術(shù)中螺旋結(jié)構(gòu)的芯片實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離的原理示意圖；

圖4是現(xiàn)有技術(shù)中單種顆粒在直通道中只受慣性升力時(shí)所處位置示意圖；

圖5是現(xiàn)有技術(shù)中螺旋結(jié)構(gòu)的芯片實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離的示意圖；

圖6a是6um的顆粒在沿外側(cè)壁分布凸槽的圓弧形結(jié)構(gòu)中的分布仿真圖，圖6b是圖6a的局部放大圖；

圖7a是3um的顆粒在沿外側(cè)壁分布凸槽的圓弧形結(jié)構(gòu)中的分布仿真圖，圖7b是圖7a的局部放大圖。

圖中各附圖標(biāo)記的含義如下：1為樣品入口，2為鞘液流入口，3為細(xì)胞分離單元(即，流道)，4為大尺寸細(xì)胞出口，5為小尺寸細(xì)胞出口，s1為內(nèi)側(cè)壁(即，第一側(cè)壁)，s2為外側(cè)壁(即，第二側(cè)壁)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于慣性原理分離細(xì)胞的微流控芯片，該微流控芯片自上而下包括上基體、下基體，所述上基體可以通過(guò)鍵合的方法和下基體固聯(lián)為一體；流道凸槽位于上基板中(該流道凸槽在芯片平面上的投影如圖1所示；下基體在與上基體接觸的表面上可以不設(shè)置任何凸槽，同時(shí)下基體在與上基體接觸的表面平行于芯片平面)，如圖1所示，所述流道層是一條單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)螺旋形流道，包括一個(gè)樣品入口1、一個(gè)鞘液流入口2、大尺寸細(xì)胞出口4以及小尺寸細(xì)胞出口5。細(xì)胞在流道中會(huì)受到迪恩力fd和慣性升力fl的耦合作用，流經(jīng)一定長(zhǎng)度的流道之后，不同尺寸的細(xì)胞聚焦于不同的橫向平衡位置，最終分離出不同尺寸的細(xì)胞。本芯片能夠在流速較高的情況下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離，且所需流道結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，通量極高，并在一定程度上提高了細(xì)胞分離效率。

本發(fā)明中基于慣性原理分離細(xì)胞的芯片，是種具有新型流道結(jié)構(gòu)的細(xì)胞分離芯片，能夠高效、簡(jiǎn)便、快速的分離細(xì)胞，該芯片的制備及使用方法可以采用如下步驟進(jìn)行：

1、設(shè)計(jì)流道結(jié)構(gòu)。該流道為一段具有單側(cè)縮擴(kuò)陣列結(jié)構(gòu)的螺旋流道，流道一端為一y字型的樣品和鞘液流入口，1為樣品入口，2為鞘液流入口，另一端為一y字型的大小細(xì)胞出口，3為大尺寸細(xì)胞的出口，4為小尺寸細(xì)胞的出口。所述的微通道截面為矩形。

2、設(shè)計(jì)流道尺寸。該流道縮擴(kuò)陣列中，拓寬段弧長(zhǎng)為300～700um，寬度為350um，壓縮段弧長(zhǎng)為300～1200um，寬度為50um，流道高度為20～25um。

3、制作芯片。該芯片包括上基體和下基體，上基體的材質(zhì)可以為聚二甲基硅氧烷(pdms)，下基體材質(zhì)可以為玻璃。兩個(gè)基體通過(guò)鍵合的方式結(jié)合在一起。流道凸槽設(shè)于上基體中。

4、處理細(xì)胞溶液。在該方案中一定程度稀釋的細(xì)胞樣品會(huì)大大減少流道堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。

5、在該技術(shù)方案中，微流控芯片進(jìn)樣需要?jiǎng)恿ο到y(tǒng)。使用動(dòng)力系統(tǒng)將細(xì)胞樣品和鞘液流以合適的速度同時(shí)從進(jìn)樣口1和進(jìn)樣口2注入。

6、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

以下為具體實(shí)施例：

實(shí)施例1

結(jié)合圖2所示，該細(xì)胞分離芯片包括基體、以及基體上的微通道，該通道包括細(xì)胞樣品進(jìn)樣口1、鞘液流進(jìn)樣口2、細(xì)胞分離單元3、大尺寸細(xì)胞出口4以及小尺寸細(xì)胞出口5。在該技術(shù)方案中，微流控芯片進(jìn)樣需要?jiǎng)恿ο到y(tǒng)，動(dòng)力系統(tǒng)用于將細(xì)胞溶液和鞘液流分別從進(jìn)樣口1和進(jìn)樣口2連續(xù)注入到芯片中，本實(shí)例中的動(dòng)力系統(tǒng)為注射器泵。鞘液流用于在入口之后的第一個(gè)拓寬段將細(xì)胞聚焦成一束并貼近s1側(cè)壁進(jìn)入壓縮段。

細(xì)胞分離單元3為圓弧形通道，該通道自細(xì)胞進(jìn)樣口1向內(nèi)彎。外側(cè)壁s2向內(nèi)彎的曲率半徑為7mm，該通道的尺寸為流道的任一拓寬段弧長(zhǎng)為700um，寬度為350um，任一壓縮段弧長(zhǎng)為1200um，寬度為50um，整個(gè)流道高度為25um，細(xì)胞分離單元3的長(zhǎng)度23mm(還包括了入口部分和出口部分的長(zhǎng)度)。細(xì)胞進(jìn)樣口1、鞘液流進(jìn)樣口2、大尺寸粒子出口4的直徑可優(yōu)選為400um，以及小尺寸細(xì)胞出口5的直徑可優(yōu)選為400um。

結(jié)合圖2所示，應(yīng)用該流道分離不同尺寸的細(xì)胞原理為：在連續(xù)彎曲的微通道中，細(xì)胞主要受升力fl和迪恩力fd兩種力。fl和fd之間的平衡決定了細(xì)胞在微通道的平衡位置。當(dāng)fl≥fd時(shí)，細(xì)胞往側(cè)壁s1移動(dòng)，當(dāng)fl＜fd時(shí)，細(xì)胞往側(cè)壁s2移動(dòng)；尺寸較大的細(xì)胞所受fl較大，尺寸較小的細(xì)胞所受fd較大。當(dāng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)至拓寬流道段時(shí)，流道的拓寬使得細(xì)胞受到的壁面誘導(dǎo)慣性升力突然減小，小尺寸細(xì)胞會(huì)向s2側(cè)壁運(yùn)動(dòng)，并穩(wěn)定在新的平衡位置，大尺寸細(xì)胞會(huì)向s1側(cè)壁運(yùn)動(dòng)，并穩(wěn)定在新的平衡位置，造成大尺寸細(xì)胞的平衡位置與小尺寸的細(xì)胞平衡位置之間的間距變大。當(dāng)液體從拓寬段進(jìn)入壓縮段時(shí)，拓寬段的液體以彎曲的路徑加速進(jìn)入壓縮段，該加速會(huì)使細(xì)胞所受的fl和fd在一定程度上加強(qiáng)，從而讓細(xì)胞能夠更快分離。

該技術(shù)方案中兩個(gè)樣品的流速會(huì)影響細(xì)胞分離效果，不同的流速比所產(chǎn)生的分離效率也不同。本實(shí)例中細(xì)胞樣品與鞘液流的速度比為1:5。使用兩個(gè)注射器泵將細(xì)胞樣品(稀釋的血液)和鞘液流(磷酸鹽緩沖液)分別以0.012m/s、0.06m/s的速度同時(shí)從進(jìn)樣口1和進(jìn)樣口2注入。(此時(shí)對(duì)應(yīng)溝道中最大速度為0.8m/s)

檢測(cè)時(shí)，采用ccd倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，用高速攝像機(jī)進(jìn)行視頻記錄。通過(guò)觀察，可以看見(jiàn)血細(xì)胞(尺寸為6um以上的細(xì)胞)逐漸往側(cè)壁s1移動(dòng)，血漿(尺寸為3um及3um以下的細(xì)胞)逐漸往側(cè)壁s2移動(dòng)。

微流控芯片工作流程包括：

1、準(zhǔn)備好兩臺(tái)注射器泵，將注射器分別抽取已稀釋的血液細(xì)胞和磷酸鹽緩沖液，放在注射器泵上通過(guò)特氟龍管與芯片連接好。

2、將芯片放在ccd倒置顯微鏡下合適位置，調(diào)節(jié)焦距，進(jìn)行清晰觀察。

3、打開(kāi)注射器泵，調(diào)節(jié)流速，實(shí)現(xiàn)觀測(cè)不同尺寸的細(xì)胞分離。

表4：不同速度下，3um與6um顆粒在直溝道與單側(cè)擴(kuò)縮陣列圓弧結(jié)構(gòu)分離的距離

注：此時(shí)的相隔距離為6um顆粒最下端與3um顆粒最上端在出口處的相隔距離。此圓弧形結(jié)構(gòu)的曲率半徑均為7mm。表中所述6個(gè)拓寬段表示的是該溝道有6個(gè)拓寬段和5個(gè)壓縮段。表中所述12個(gè)拓寬段表示的是該溝道有12個(gè)拓寬段和11個(gè)壓縮段。

表5：2um與7um顆粒在單側(cè)擴(kuò)縮圓弧形結(jié)構(gòu)與螺旋形結(jié)構(gòu)中分離的距離

注：此時(shí)的相隔距離為7um顆粒最下端與2um顆粒最上端在出口處的相隔距離，此圓弧形結(jié)構(gòu)的曲率半徑均為7mm。該螺旋形結(jié)構(gòu)為continuousparticleseparationinspiralmicrochannelsusingdeanflowsanddifferentialmigration即文獻(xiàn)【3】中的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)模型高為50um，寬為100um，最內(nèi)側(cè)曲率半徑為3mm，總長(zhǎng)為13cm.，該表中的速度為對(duì)應(yīng)模型分離效率最佳時(shí)的速度。

表6：3um與7um顆粒在三種不同模型中分離的距離

注：此時(shí)的相隔距離為6um顆粒最下端與3um顆粒最上端在出口處的相隔距離。兩個(gè)圓弧形結(jié)構(gòu)的曲率半徑均為7mm。圓弧結(jié)構(gòu)的尺寸為：寬50um，弧長(zhǎng)21.6mm。此時(shí)這兩種圓弧形的弧長(zhǎng)與直通道的長(zhǎng)相等。

由上表可知，當(dāng)次三種模型尺寸一致，速度一致時(shí)，本發(fā)明3um與7um顆粒相隔距離為141.6mm,大于另兩種結(jié)構(gòu)分離距離之和。

本發(fā)明中，入口(包括樣品入口1、鞘液流入口2)與出口(包括大尺寸細(xì)胞出口4、小尺寸細(xì)胞出口5)的位置可以互換，此時(shí)，流道拓寬段對(duì)應(yīng)的凸槽仍位于內(nèi)側(cè)壁s1上，大尺寸細(xì)胞出口4仍位于內(nèi)側(cè)壁s1的同一側(cè)上，小尺寸細(xì)胞出口5仍位于外側(cè)壁s2的同一側(cè)上。

本發(fā)明中的流道既可以是螺旋形，也可以是弧形，可根據(jù)具體待分離的細(xì)胞顆粒大小而定，例如，由表4可以看到，當(dāng)單側(cè)擴(kuò)縮螺旋形結(jié)構(gòu)越長(zhǎng)，粒子分離所需的最優(yōu)速度就越小，如6個(gè)拓寬段單側(cè)擴(kuò)縮陣列圓弧結(jié)構(gòu)分離3um與6um顆粒所需最優(yōu)速度為1.3m/s，而12個(gè)拓寬段單側(cè)擴(kuò)縮陣列圓弧結(jié)構(gòu)分離3um與6um顆粒所需最優(yōu)速度為0.8m/s。由于芯片尺寸較小，且是由鍵和的方式將上下基體結(jié)合在一起，故芯所承受的壓強(qiáng)有限，當(dāng)最優(yōu)速度降低時(shí)，能夠有效降低由于溝道內(nèi)部水壓過(guò)大，導(dǎo)致液體從入口處滲出的概率。在實(shí)際使用時(shí)，若對(duì)速度要求不那么高時(shí)，可以采用較長(zhǎng)的溝道，用以降低由于芯片內(nèi)壓強(qiáng)過(guò)大，而導(dǎo)致破裂和滲水的概率。

本發(fā)明中的流道的弧形可以為橢圓弧或正圓??；當(dāng)弧形為圓弧形時(shí)，弧形中心即圓弧圓心。另外，本發(fā)明中的流道高度也根據(jù)待分離粒子的直徑靈活調(diào)整，例如，分離10um到2um的粒子可使用高度為25um，分離1.7um到0.5um的粒子可使用高度為20um。

本發(fā)明中流道的曲率半徑均是以流道第二側(cè)壁s2的曲率半徑為基準(zhǔn)；當(dāng)流道為圓弧形，則流道各處的曲率半徑保持不變；當(dāng)流道為螺旋形時(shí)，第二側(cè)壁s2最靠近螺旋中心部分的曲率半徑為5mm～7mm(即對(duì)應(yīng)流道靠近螺旋中心的一端)。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。