MERS?CoV特異性多肽及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及MERS-CoV特異性多肽及其應(yīng)用，屬于免疫檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

2012年6月沙特阿拉伯發(fā)現(xiàn)第一例MERS病例，隨后，更多的病例在阿拉伯半島被報道，并傳至亞洲，非洲，歐洲和北美洲等地，死亡率高達(dá)35.7％，2015年7月，我國也出現(xiàn)了一例輸入性感染病例。開發(fā)安全有效的疫苗是控制MERS-CoV傳播的重要手段之一。T細(xì)胞在病毒清除中發(fā)揮著非常重要的作用，在MERS-CoV疫苗免疫效果的評估中，T細(xì)胞免疫應(yīng)答的評估尤為重要。MERS-CoV易感小鼠模型的建立為其疫苗的研發(fā)提供了很好的動物模型。開發(fā)高效、快速、敏感的檢測MERS-CoV感染后患者和動物模型T細(xì)胞狀態(tài)的檢測手段尤為重要。

MHC-四聚體技術(shù)是將MHC單體分子四聚體化，提高其與T細(xì)胞上的TCR的親和力，進(jìn)而提高檢測的靈敏度的技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于檢測抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)、T細(xì)胞的直接分離與克隆、分離特異性TCR、原位染色等，為研究與細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)的一系列工作提供了高效、快速、敏感的檢測手段。然而目前還沒有用四聚體技術(shù)評價MERS-CoV感染或疫苗接種后小鼠模型T細(xì)胞的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供MERS-CoV特異性多肽，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述特異性多肽的衍生物，是在所述多肽的氨基酸序列上取代、或缺失，或添加一個或幾個氨基酸，且具有與所述多肽相同抗原性的多肽衍生物。

本發(fā)明的第三個目的是提供對MERS-CoV感染或疫苗接種后小鼠模型的T細(xì)胞高度特異性和高度靈敏性的多肽-MHC四聚體，所述多肽-MHC四聚體由生物素化的MHC-I與所述特異性多肽結(jié)合。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述多肽-MHC四聚體的制備方法，包括如下步驟：(1)用大腸桿菌表達(dá)MHC輕鏈和MHC重鏈；(2)稀釋復(fù)性，制備多肽/MHC復(fù)合物；(3)制備生物素化的多肽/MHC復(fù)合物；(4)與帶標(biāo)記的鏈親和素反應(yīng)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述MHC重鏈C端連接生物素。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(3)是在BirA酶的催化下與D-biotin結(jié)合。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(4)是按照摩爾比5：1的比例與帶標(biāo)記的鏈親和素反應(yīng)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體是：利用大腸桿菌表達(dá)MHC輕鏈及C端連接生物素的MHC重鏈，利用稀釋復(fù)性的方法制備多肽/MHC復(fù)合物，用superdex200純化，然后再BirA酶的催化下與D-biotin結(jié)合，形成生物素化的多肽/MHC復(fù)合物，再與帶標(biāo)記的鏈親和素按照摩爾比5：1的比例反應(yīng)，得到多肽/MHC復(fù)合物。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種多肽疫苗，其活性成分含有所述的多肽和/或多肽衍生物。

本發(fā)明的第六個目的是提供MERS-CoV特異性細(xì)胞免疫檢測試劑盒，所述試劑盒含有所述的多肽和/或多肽衍生物。

本發(fā)明還提供所述多肽-MHC四聚體的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用包括：制備疫苗；作為T細(xì)胞免疫學(xué)評價的有效工具，對MERS-CoV感染或疫苗接種后小鼠模型的T細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行評估；對MERS-CoV感染或疫苗接種后小鼠相應(yīng)組織切片的原位染色、特異性T細(xì)胞的分離與克隆、結(jié)合單細(xì)胞測序技術(shù)分離特異性TCR、作為T細(xì)胞激活試劑。

有益效果：本發(fā)明用自主篩選的3條多肽制備的四聚體有高度的特異性和敏感性，可以作為T細(xì)胞評價的有效工具。通過流式分析表明，用本發(fā)明的方法制備的多肽-MHC四聚體檢測用自主篩選的三條MERS-CoV特異性多肽免疫過的小鼠的T細(xì)胞，陽性率分別為3.89％、2.12％、2.57％，明顯高于陰性對照組0.088％～0.122％。細(xì)胞用相應(yīng)多肽體外刺激后培養(yǎng)9天，免疫組T細(xì)胞陽性率分別為69.5％、27.9％、20.1％，明顯高于陰性對照組0.238％～6.0％。該技術(shù)還可以用于對MERS-CoV感染或疫苗接種后小鼠相應(yīng)組織切片的原位染色、特異性T細(xì)胞的分離與克隆、結(jié)合單細(xì)胞測序技術(shù)分離特異性TCR、作為T細(xì)胞激活試劑等。

附圖說明

圖1為:H-2K^d與表位多肽superdex200分子篩柱形圖；

圖2為:H-2K^d與表位多肽形成的MHC復(fù)合物生物素化后superdex200分子篩柱形圖；

圖3為:生物素化效率檢測；M，Marker；A，鏈親和素；B，MHC和鏈親和素；C，MHC；

圖4為:用多肽37-1免疫小鼠后的流式分析結(jié)果代表圖；

圖5為:用多肽142免疫小鼠后的流式分析結(jié)果代表圖；

圖6為：用多肽122免疫小鼠后的流式分析結(jié)果代表圖；

圖7為:用表位多肽免疫小鼠后T細(xì)胞并用多肽37-1體外刺激細(xì)胞后培養(yǎng)9天流式分析的結(jié)果圖；

圖8為:用表位多肽免疫小鼠后T細(xì)胞并用多肽142體外刺激細(xì)胞后培養(yǎng)9天流式分析的結(jié)果圖；

圖9為:用表位多肽免疫小鼠后T細(xì)胞并用多肽122體外刺激細(xì)胞后培養(yǎng)9天流式分析的結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1 MERS-CoV特異性多肽的篩選

用多肽預(yù)測軟件對MERS-CoV的S蛋白進(jìn)行預(yù)測，然后合成多肽，用載有MERS-CoV病毒的S蛋白的腺病毒免疫品系為H-2d(BALB/c)的小鼠，免疫完成后收獲脾細(xì)胞，把合成的多肽編號后按照8×8的矩陣排列，橫8組，豎8組，橫組和豎組有交叉，有交叉的多肽混合在一起。通過Elispot技術(shù)檢測混合多肽產(chǎn)生IFN-γ的情況，從產(chǎn)生IFN-γ的橫組和豎組交叉的混合多肽中篩選獲得3條功能肽(如表1所示)，具有較強(qiáng)的特異性，能夠用作T細(xì)胞免疫學(xué)評價的有效工具，對MERS-CoV感染或疫苗接種后小鼠模型的T細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行評估。

表1篩選獲得的功能肽及其序列

實施例2多肽-MHC四聚體的制備

(1)多肽/MHC復(fù)合物的制備：

1)在H-2K^d(Genbank登陸號XP_017174460.1)基因C端添加能夠連接生物素的氨基酸序列GGGLNDIFEAQKIEWHE，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-H-2K^d-Bio，將B2m基因(Genbank登錄號為AAA39668.1)與載體連接，構(gòu)建重組載體pET28a-B2m，并將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；

2)將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在37℃條件下培養(yǎng)并加入1mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，收集菌體，將菌體超聲破碎，高速離心后將沉淀溶解在溶解buffer(6mol/L鹽酸胍,10％甘油，50mmol/LTris pH8.0，100mmol/LNaCl，10mmol/L EDTA)中；

3)將序列如SEQ ID NO.1所示的多肽(命名為多肽37-1)和重鏈、輕鏈用稀釋復(fù)性的方法在復(fù)性Buffer(100mmol/LTris pH 8.0，400mmol/L精氨酸，2mmol/L EDTA)中同時復(fù)性，使其形成MHC復(fù)合物；采用上述相同方法分別用SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的多肽(命名為多肽142和多肽122)和重鏈、輕鏈制備MHC復(fù)合物；

4)多肽/MHC復(fù)合物純化：使用超濾杯使復(fù)性后樣品通過10kDa濾膜濃縮樣品，并通過濃縮換液為Exchange Buffer(20mmol/L Tris-HCl，50mmol/LNaCl,pH8.0)；將樣品取出后4℃離心12000rpm 10min,將上清轉(zhuǎn)移到超濾管中濃縮到約0.5-1ml，過superdex200分子篩進(jìn)行多肽/MHC復(fù)合物純化，結(jié)果如圖1所示。

(2)多肽/MHC分子的生物素化

1)將經(jīng)過分子篩純化后的多肽/MHC復(fù)合物蛋白樣品收集于超濾濃縮管中，濃縮至約300μL，在BirA酶的催化下與D-biotin反應(yīng)，4℃孵育過夜。

2)將生物素化后的蛋白樣品離心后過superdex200分子篩進(jìn)行生物素化后的復(fù)合物純化，以去除多余的生物素，結(jié)果如圖2所示。

3)將純化的多肽/MHC復(fù)合物濃縮到約500μL，取樣進(jìn)行Gel shift試驗驗證生物素化效果。

樣品制備：

A.2μL鏈親和素Streptavidin+8μL分子篩Buffer。

B.8μL生物素化后多肽/MHC樣品+2μL 20mg/mL鏈親和素Streptavidin；

C.8μL生物素化后多肽/MHC樣品+2μL分子篩buffer；

將上述三支樣品置冰上孵育30min-2h后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3所示。

生物素化后的MHC能夠與Streptavidin結(jié)合成為大分子，從而使得其在SDS-PAGE中的條帶滯后，通過比較(C-B)/C的MHC含量的比值可以判斷生物素化的效果，既有多少比例的MHC得到較好的生物素化，圖3結(jié)果顯示，本發(fā)明的技術(shù)方案生物素化效應(yīng)約為90％。

(3)生物素化的MHC分子四聚化：

將生物素化后的MHC分子濃縮，按照鏈親和素與多肽/MHC復(fù)合物的摩爾比1:5將生物素化后的MHC分子四聚化,鏈親和素為帶熒光標(biāo)記的鏈親和素，置4℃孵育過夜，制備獲得37-1-H-2K^d四聚體。

按上述相同步驟制備142-H-2K^d四聚體，122-H-2K^d四聚體。

實施例3多肽/MHC四聚體在T細(xì)胞分析中的應(yīng)用

利用MERS-CoV特異性多肽/MHC四聚體的高親和力和高特異性的特點(diǎn)對MERS-CoV相關(guān)疫苗免疫后小鼠T細(xì)胞進(jìn)行檢測，評估疫苗對小鼠細(xì)胞免疫的影響、T細(xì)胞的分離與克隆、對MERS-CoV感染小鼠相應(yīng)組織切片進(jìn)行原位染色等，采用下述步驟評價用載有MERS-CoV的S蛋白的腺病毒載體免疫的BABL/c小鼠T細(xì)胞水平：

1)將篩選獲得的多肽37-1與不完全弗氏佐劑和GP96佐劑按照20μg多肽，50μL不完全弗氏佐劑，50μL GP96的比例制備成乳化劑，分三次免疫小鼠，每次間隔兩周；以未經(jīng)免疫的小鼠作為陰性對照；

2)獲取免疫后的小鼠脾細(xì)胞，用FACS buffer/staining buffer(PBS+0.5％BSA)洗2遍；

3)染色。加抗體(如FITC-CD8，APC-CD4，PerCp-CD3，PE-Tetramer)。4℃冰上孵育30min；

4)洗滌。加200μL FACS buffer離心，洗2遍；

按上述相同步驟分別將多肽142，多肽122用于小鼠免疫，再分別用實施例3制備的37-1-H-2K^d四聚體142-H-2K^d四聚體，122-H-2K^d四聚體評價用載有MERS-CoV的S蛋白的腺病毒載體免疫的BABL/c小鼠T細(xì)胞水平。

用細(xì)胞流式儀進(jìn)行流式分析，結(jié)果如圖4-6所示，多肽免疫過的小鼠的T細(xì)胞，陽性率分別為3.89％、2.12％、2.57％，明顯高于陰性對照組0.096％、0.122％、0.088％。

將細(xì)胞用相應(yīng)多肽體外刺激后培養(yǎng)9天，再按上述步驟流式染色，結(jié)果如圖7-9所示，免疫組T細(xì)胞陽性率分別為69.5％、27.9％、20.1％，明顯高于陰性對照組僅為0.238％、1.92％、6.0％。

實施例4多肽、多肽衍生物制備疫苗

將上述制備獲得的多肽或多肽衍生物溶于水相或油相佐劑，稀釋為合適濃度，過濾除菌?？蛇x擇地，進(jìn)行乳化，制備獲得疫苗。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。