本發(fā)明屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種雙抗原特異性T細(xì)胞及其產(chǎn)生方法及包含雙抗原特異性T細(xì)胞的靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑。
背景技術(shù)：
：T淋巴細(xì)胞是參與腫瘤細(xì)胞免疫治療的主要效應(yīng)細(xì)胞，T細(xì)胞的激活依靠“雙信號(hào)”細(xì)致地調(diào)控。第一信號(hào)是T淋巴細(xì)胞表面的一種特異性受體TCR(Tcellrecepor)分子與腫瘤細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體(MHC)提呈的抗原肽的結(jié)合，即T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別；第二信號(hào)是協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體或配體相互作用介導(dǎo)的信號(hào)。CD28/B7是重要的正性共刺激分子，其主要作用是促進(jìn)IL-2合成。如T細(xì)胞缺乏共刺激信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能。三陰性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer，TNBC)是一種高度侵襲性的腫瘤，其細(xì)胞表面不表達(dá)雌激素受體(EstrogenReceptor，ER)，孕激素受體(ProgestroneReceptor，PR)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)。由于缺乏有效的分子靶點(diǎn)，臨床上缺乏針對(duì)TNBC的有效治療手段，因此TNBC的總體生存率低于其它類型的乳腺癌患者，且更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。間皮素(Mesothelin，簡(jiǎn)稱Meso)是一種分子量為40kDa的細(xì)胞表面糖蛋白，高表達(dá)于多種惡性實(shí)體腫瘤組織中，已有研究表明Meso在TNBC細(xì)胞表面有較高的表達(dá)水平，但同時(shí)Meso在正常胸膜、心包和腹膜的間皮細(xì)胞中也有少量表達(dá)。另外，最新研究顯示，在TNBC細(xì)胞表面還檢測(cè)到高表達(dá)的低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)。因此，如何能夠有效對(duì)TNBC進(jìn)行識(shí)別與殺傷，并避免對(duì)正常細(xì)胞誤殺是需要克服的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種雙抗原特異性T細(xì)胞及其制備方法，以解決當(dāng)前不能有效對(duì)TNBC進(jìn)行識(shí)別與殺傷，且容易造成對(duì)正常細(xì)胞誤殺的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑，以解決現(xiàn)有生物治療三陰性乳腺癌存在療效不佳，以及對(duì)正常細(xì)胞造成損傷的技術(shù)問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，作為本發(fā)明的一方面，提供了一種雙抗原特異性T細(xì)胞。所述雙抗原特異性T細(xì)胞包括間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因和在HIF-1α抗體介導(dǎo)下特異性識(shí)別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因。相應(yīng)地，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種雙抗原特異性T細(xì)胞的制備方法。所述制備方法包括如下步驟：將T細(xì)胞被第一慢病毒和第二慢病毒同時(shí)感染；所述第一慢病毒含有間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因，所述第二慢病毒含有所述HIF-1α抗原特異性T細(xì)胞受體基因。作為本發(fā)明的另一方面，提供了一種靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑。所述藥物制劑包括本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞或者由本發(fā)明制備方法制備的雙抗原特異性T細(xì)胞，還包括HIF-1α抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞由于含有間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因和在HIF-1α抗體介導(dǎo)下特異性識(shí)別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因，因此，本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞具有兩個(gè)特異性結(jié)合域，可靶向Meso和HIF-1α抗體介導(dǎo)下特異性識(shí)別HIF-1α抗原的雙特異性，保證了本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞對(duì)TNBC細(xì)胞的特異性識(shí)別與殺傷，同時(shí)避免了機(jī)體正常細(xì)胞的誤殺損傷。本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞制備方法通過(guò)含有間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因的第一慢病毒和含有抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因的第二慢病毒對(duì)T細(xì)胞感染，使得感染得到的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞具有靶向Meso和抗體Fc段的兩個(gè)特異性結(jié)合域，保證了本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞對(duì)TNBC細(xì)胞的特異性識(shí)別與殺傷，同時(shí)避免了機(jī)體正常細(xì)胞的誤殺損傷，而且本發(fā)明制備方法對(duì)T細(xì)胞感染率高。本發(fā)明靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑由于含有本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞和HIF-1α抗體，在HIF-1α抗體介導(dǎo)下，能夠同時(shí)識(shí)別到表達(dá)在同一TNBC細(xì)胞表面的Meso和HIF-1α抗原，從而激活本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)能夠有效避免對(duì)正常細(xì)胞的誤傷。另外，由于HIF-1α抗體能夠介導(dǎo)本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞對(duì)TNBC腫瘤細(xì)胞表面的HIF-1α抗原特異識(shí)別，因此，本發(fā)明藥物制劑可通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α抗體濃度來(lái)控制活化所含的雙特異性TCR基因修飾T細(xì)胞的治療劑量，進(jìn)一步提高了藥物制劑治療三陰性乳腺癌的安全性。附圖說(shuō)明下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：圖1為本發(fā)明實(shí)施例人工構(gòu)建的Meso/scFv--CD8-CD3ζ基因結(jié)構(gòu)圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例人工構(gòu)建的CD16-CD28-TCRζ基因結(jié)構(gòu)圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的電泳條帶圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ轉(zhuǎn)化菌落PCR產(chǎn)物的電泳條帶圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的電泳條帶圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ轉(zhuǎn)化菌落PCR產(chǎn)物的電泳條帶圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例T細(xì)胞體外殺傷三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的流式檢測(cè)圖；其中，WT-T細(xì)胞：陰性對(duì)照組T細(xì)胞；M/HBi-TCR-T細(xì)胞：?jiǎn)渭僊/HBi-TCR-T細(xì)胞；Hif1α-M/HBi-TCR-T細(xì)胞：1ug/mlHif1α抗體共孵育的M/HBi-TCR-T細(xì)胞；圖8為本發(fā)明實(shí)施例荷瘤裸鼠腋下移植瘤的生長(zhǎng)圖片；其中，圖(1)為陰性對(duì)照組；圖(2)為單純化療組；圖(3)為單純M/HBi-TCR-T細(xì)胞治療組；圖(4)為M/HBi-TCR-T細(xì)胞聯(lián)合Hif1α抗體治療組；圖9為本發(fā)明實(shí)施例M/HBi-TCR-T細(xì)胞殺傷示意圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。由于三陰性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer，TNBC)細(xì)胞表面含有有較高表達(dá)水平的間皮素(Mesothelin，簡(jiǎn)稱Meso)和低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)。因此，本發(fā)明實(shí)施例基于TNBC細(xì)胞該特性，構(gòu)建了一種能夠同時(shí)靶向Meso和HIF-1α抗原的雙抗原特異性T細(xì)胞及其制備方法和含有本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞的靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑。一方面，本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞包括間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因和在HIF-1α抗體介導(dǎo)下特異性識(shí)別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因。因此，本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞可以表示為Meso/HIF-1αBispecificTCR-T(簡(jiǎn)寫為M/HBi-TCR-T)。由于本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞由于含有間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因和抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因，這樣，M/HBi-TCR-T細(xì)胞具有兩個(gè)特異性結(jié)合域，其中第一結(jié)合域可靶向Meso抗原，激發(fā)T細(xì)胞活化的第一信號(hào)，第二結(jié)合域則靶向腫瘤特異性抗體的Fc片段，在HIF-1α抗體介導(dǎo)下靶向腫瘤HIF-1α抗原，激發(fā)T細(xì)胞活化的第二信號(hào)，單獨(dú)識(shí)別其中一種腫瘤抗原并不足以激活T細(xì)胞，只有識(shí)別到表達(dá)在同一腫瘤細(xì)胞表面的Meso和HIF-1α抗原后才能產(chǎn)生足夠強(qiáng)大的信號(hào)激活T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)避免了機(jī)體正常細(xì)胞的誤殺損傷。其中，在一實(shí)施例中，所述間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因設(shè)于Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段中。在具體實(shí)施例中，所述間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因是由含有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的病毒感染至雙抗原特異性T細(xì)胞中，其中，Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段可由下文Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段構(gòu)建方法獲得。在另一實(shí)施例中，所述抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因設(shè)于CD16–CD28-TCRζ基因片段中。在具體實(shí)施例中，所述抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因是由含有CD16–CD28-TCRζ基因片段的病毒感染至雙抗原特異性T細(xì)胞中。其中，CD16–CD28-TCRζ基因片段可由下文CD16–CD28-TCRζ基因片段構(gòu)建方法獲得。由于抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因含有CD16基因，因此，使得本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞能夠靶向腫瘤特異性抗體的Fc片段。由上文所述可知，本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞具有可靶向Meso和HIF-1α抗原的兩個(gè)特異性結(jié)合域，保證了本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞對(duì)TNBC細(xì)胞的特異性識(shí)別與殺傷，同時(shí)避免了機(jī)體正常細(xì)胞的誤殺損傷。另一方面，在上文所述的本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞的基礎(chǔ)上，本發(fā)明實(shí)施例還提供了本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞一種制備方法。本發(fā)明實(shí)施例制備方法包括以下步驟：將T細(xì)胞被第一慢病毒和第二慢病毒同時(shí)感染。其中，所述第一慢病毒含有上文所述的間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因。在一實(shí)施例中，所述第一慢病毒按照如下方法制備獲得：S11：將Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段與入門載體混合，以使所述Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段嵌入所述入門載體，而獲得帶有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入門載體；S12：將所述帶有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入門載體與慢病毒質(zhì)?；旌现亟M，以建立間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體表達(dá)質(zhì)粒；S13：將所述間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體表達(dá)質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒、共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得第一慢病毒。步驟S11中，Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段獲得方法包括如下步驟：S111：獲取Meso抗原免疫總cDNA；S112：將所述Meso抗原免疫總cDNA與Meso抗體重鏈可變區(qū)VH引物和輕鏈可變區(qū)VL引物進(jìn)行PCR，獲得MesoVH和MesoVL基因片段；S113：將所述MesoVH與MesoVL基因片段采用連接肽連接，獲得Meso抗體scFv基因片段；S114：將所述Meso抗體scFv基因片段與pcDNA載體連接，獲得pcDNA-Meso/scFv質(zhì)粒；S115：將人CD8分子基因片段和CD3ζ鏈胞內(nèi)段克隆進(jìn)所述pcDNA-Meso/scFv質(zhì)粒，獲得pcDNA3-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質(zhì)粒，酶切后獲得Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段。其中，步驟S112中的Meso抗體重鏈可變區(qū)VH引物和輕鏈可變區(qū)VL引物可以根據(jù)重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL序列按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，在具體實(shí)施例中，重鏈可變區(qū)VH的引物為SEQIDNO1和SEQIDNO2，輕鏈可變區(qū)VL的引物為SEQIDNO3和SEQIDNO4：SEQIDNO：1：5'-AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG-3'SEQIDNO：2：5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3'SEQIDNO：3：5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'SEQIDNO：4：5'-CCCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3'。步驟S113中的連接肽可以是采用的連接肽，針對(duì)該重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL序列特性，在本實(shí)施例中，選用連接肽(Gly4Ser)3，其堿基序列如下SEQIDNO：5：5'-GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCT-3'步驟S114中的pcDNA載體可以是pcDNA載體系列中常用的載體，在具體實(shí)施例中，pcDNA載體為pcDNA3。步驟S115中的人CD8分子基因片段為471-737bpcDNA序列。CD3ζ鏈胞內(nèi)段為228-563bpcDNA序列，且CD8分子基因片段和CD3ζ鏈胞內(nèi)段可以直接在Pubmed基因庫(kù)進(jìn)行檢索獲得。另外，在步驟S11中，作為具體實(shí)施例，入門載體可以但不僅僅為pENTR/D-TOPO。上述步驟S12中，慢病毒質(zhì)粒可以是常用的慢病毒載體，如但不僅僅選用pLenti6.3/V5-DEST。上述步驟S13中，病毒包裝質(zhì)?？梢允浅Ｓ玫牟《景b質(zhì)粒，如但不僅僅選用ViraPowerTM包裝質(zhì)粒。上文雙抗原特異性T細(xì)胞制備方法中的所述第二慢病毒含有上文所述的抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因，具體是在HIF-1α抗體介導(dǎo)下特異性識(shí)別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因。在一實(shí)施例中，所述第二慢病毒按照如下方法制備獲得：S21：將CD16–CD28-TCRζ基因片段與入門載體混合，以使所述CD16–CD28-TCRζ基因片段嵌入所述入門載體，而獲得帶有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入門載體；以及S22：將所述帶有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入門載體與慢病毒質(zhì)?；旌现亟M，以建立CD16–CD28-TCRζ慢病毒表達(dá)質(zhì)粒；S23：將所述CD16–CD28-TCRζ慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒、共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得第二慢病毒。步驟S21中，CD16–CD28-TCRζ基因片段獲得方法包括如下步驟：S211：將人CD16分子基因片段與pcDNA載體連接，獲得pcDNA-CD16質(zhì)粒；S212：將CD28分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)所述pcDNA-CD16質(zhì)粒，獲得pcDNA-CD16-CD28質(zhì)粒；S213：將CD28核苷酸336-660bp區(qū)域和TCRζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域PCR合并成基因片段后克隆進(jìn)所述pcDNA-CD16-CD28質(zhì)粒，酶切后獲得CD16-CD28-TCRζ基因片段。步驟S211中的人CD16分子基因片段可以為843bpcDNA序列。CD3ζ鏈胞內(nèi)段為228-563bpcDNA序列，且人CD16分子基因可以直接在Pubmed基因庫(kù)進(jìn)行檢索獲得。另外，步驟S211中的pcDNA載體可以是pcDNA載體系列中常用的載體，在具體實(shí)施例中，pcDNA載體為pcDNA3。另外，在步驟S21中，作為具體實(shí)施例，入門載體可以但不僅僅為pENTR/D-TOPO。上述步驟S22中，慢病毒質(zhì)?？梢允浅Ｓ玫穆《据d體，如但不僅僅選用pLenti6.3/V5-DEST。上述步驟S23中，病毒包裝質(zhì)?？梢允浅Ｓ玫牟《景b質(zhì)粒，如但不僅僅選用ViraPowerTM包裝質(zhì)粒。另外，上述雙抗原特異性T細(xì)胞制備方法中的第一慢病毒和第二慢病毒同時(shí)感染T細(xì)胞可以按照正常的慢病毒感染方法進(jìn)行感染。因此，本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞制備方法通過(guò)含有間皮素抗原特異性T細(xì)胞受體基因的第一慢病毒和含有抗體Fc段特異性T細(xì)胞受體基因的第二慢病毒對(duì)T細(xì)胞感染，使得感染得到的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞具有靶向Meso和HIF-1α抗體介導(dǎo)下特異性識(shí)別HIF-1α抗原的兩個(gè)特異性結(jié)合域，保證了本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞對(duì)TNBC細(xì)胞的特異性識(shí)別與殺傷，同時(shí)避免了機(jī)體正常細(xì)胞的誤殺損傷，而且本發(fā)明制備方法對(duì)T細(xì)胞感染率高。又一方面，基于上文本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞及其制備方法，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑。所述藥物制劑包括雙抗原特異性T細(xì)胞和HIF-1α抗體，其中，所述雙抗原特異性T細(xì)胞為上文所述的本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞或由上文本發(fā)明制備方法制備的雙抗原特異性T細(xì)胞。這樣，該藥物制劑由于含有本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞和HIF-1α抗體，由于如上文所述的，本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞具有可靶向Meso和HIF-1α抗原的兩個(gè)雙特異性結(jié)合域，因此，在HIF-1α抗體介導(dǎo)下，能夠同時(shí)識(shí)別到表達(dá)在同一TNBC細(xì)胞表面的Meso和HIF-1α抗原，從而激活本發(fā)明雙抗原特異性T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)能夠有效避免對(duì)正常細(xì)胞的誤傷。另外，在本發(fā)明實(shí)施例靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑中，由于HIF-1α抗體能夠介導(dǎo)本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞對(duì)TNBC腫瘤細(xì)胞表面的HIF-1α抗原特異識(shí)別，因此，本發(fā)明實(shí)施例藥物制劑可通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α抗體濃度來(lái)控制活化所含的雙特異性TCR基因修飾T細(xì)胞的治療劑量，進(jìn)一步提高了藥物制劑治療三陰性乳腺癌的安全性，如當(dāng)停止抗體給藥可以終止本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞的功能，不必清除本發(fā)明實(shí)施例雙抗原特異性T細(xì)胞，確保了治療的有效性和減少毒副作用。如在一實(shí)施例中，所述雙抗原特異性T細(xì)胞與HIF-1α抗體含量比為(104-106個(gè)細(xì)胞)：(0.5-5μg)，優(yōu)選的為105個(gè)細(xì)胞：1μg。具體地，本發(fā)明實(shí)施例靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物制劑中雙抗原特異性T細(xì)胞與HIF-1α抗體殺傷TNBC腫瘤的原理如附圖9所示。其中，附圖9(A)中，M/HBi-TCR-T細(xì)胞識(shí)別正常細(xì)胞表面Meso抗原/MHCI復(fù)合物，由于正常細(xì)胞表面沒有HIF-1α抗原，因此，無(wú)法激活第二信號(hào)，對(duì)正常細(xì)胞不殺傷；圖9(B)中，M/HBi-TCR-T細(xì)胞在Hif1α抗體介導(dǎo)下識(shí)別正常細(xì)胞表面Hif1α抗原，由于正常細(xì)胞表面沒有間皮素，因此，無(wú)法激活第一信號(hào)，對(duì)正常細(xì)胞不殺傷；圖9(C)中，M/HBi-TCR-T細(xì)胞識(shí)別三陰性乳腺癌細(xì)胞表面的Meso抗原/MHCI復(fù)合物，但由于Hif1α抗體缺失，不能識(shí)別三陰性乳腺癌細(xì)胞表面的Hif1α抗原，對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞不殺傷；圖9(D)中，M/HBi-TCR-T細(xì)胞識(shí)別三陰性乳腺癌細(xì)胞表面的Meso抗原/MHCI復(fù)合物，在Hif1α抗體介導(dǎo)下通過(guò)CD16分子識(shí)別三陰性乳腺癌細(xì)胞表面的Hif1α抗原，從而激活并殺傷三陰性乳腺癌細(xì)胞。其次，上述藥物制劑包括的雙抗原特異性T細(xì)胞和HIF-1α抗體的含量或者給藥劑量應(yīng)該是有效劑量的，具體地，該有效劑量是指治療有效量，是指足以對(duì)個(gè)體顯示益處或臨床意義的本發(fā)明的化合物的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，給藥的實(shí)際量或劑量以及給藥時(shí)程將取決于被治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性、被治療的受試者的年齡和一般狀況以及給藥方式等。理所當(dāng)然的是，在上述藥用制劑中還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。在具體實(shí)施例中，該藥學(xué)上可接受的載體是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合于特定的給藥模式的任何輔料。下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)步驟1.表達(dá)Meso抗原特異性scFv-CD8-CD3ζ融合受體的慢病毒1.1獲取Meso抗原免疫小鼠總cDNA利用Meso抗原對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行免疫，效價(jià)符合要求(1:100000以上)時(shí)，處死小鼠，取脾臟，用Trizol法提取小鼠脾臟總RNA。采用iScriptcDNASynthesisKit合成總cDNA，反應(yīng)體系如下表1：表1試劑體積5×iScriptreactionmix4μliScriptreversetranscriptase1μlNuclease-freewater5μl總RNA10μl總體積20μl反應(yīng)條件：25℃5min→42℃30min→85℃5min→4℃hold。1.2Meso抗體重鏈可變區(qū)VH及輕鏈可變區(qū)VL基因的獲取Meso抗體重鏈可變區(qū)VH及輕鏈可變區(qū)VL引物序列如下表2所示：表2引物名稱引物序列SEQIDNOVH-F5'-AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG-3'1VH-R5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3'2VL-F5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'3VL-R5'-CCCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3'4Meso抗體重鏈可變區(qū)VH及輕鏈可變區(qū)VL的PCR反應(yīng)體系如下表3：表3試劑體積TaqDNA聚合酶0.25μl10×PCRBuffer5μldNTPs(2.5mM)4μlMeso抗原免疫小鼠總cDNA1μlVH-F(20μM)1μlVH-R(20μM)1μlddH2O補(bǔ)充至50μl該P(yáng)CR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃45s，60℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收Meso抗體重鏈可變區(qū)VH及輕鏈可變區(qū)VL基因PCR產(chǎn)物。1.3Meso抗體scFv片段及質(zhì)粒的獲取通過(guò)多基因片段重疊延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OE-PCR)將1.2中得到的MesoVH和MesoVL片段用連接肽(Gly4Ser)3(堿基序列：5'-GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCT-3')(SEQIDNO：5)連接起來(lái)，得到Meso抗體scFv片段，并引入酶切位點(diǎn)HinIII/BamHI。OE-PCR反應(yīng)條件如下：(1)步驟1：95℃預(yù)變性1min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共7個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；(2)步驟2：95℃預(yù)變性5min，94℃45s，62℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收Meso抗體scFv片段，利用T4DNA連接酶將Meso抗體scFv片段與pcDNA3載體連接，獲得pcDNA3-Meso/scFv質(zhì)粒。1.4Meso抗原特異性scFv-CD8-CD3ζ基因片段的構(gòu)建在Pubmed基因庫(kù)進(jìn)行檢索，獲取人CD8分子片段(471-737bp)和CD3ζ鏈胞內(nèi)段(228-563bp)cDNA序列，設(shè)計(jì)引物，同時(shí)添加限制性酶切位點(diǎn)。引物序列如下表4所示：表4以人T細(xì)胞總cDNA為模板，分別合成人CD8分子片段和CD3ζ鏈胞內(nèi)段，1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，分別回收基因片段。利用引物CD8-F、CD3ζ-R合成上述兩段PCR產(chǎn)物，BamHI/XhoI酶切后克隆進(jìn)pcDNA3-Meso/scFv質(zhì)粒，獲得pcDNA3-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質(zhì)粒，HinIII/XhoI酶切后獲得Meso/scFv--CD8-CD3ζ基因片段，基因結(jié)構(gòu)圖見圖1所示。1.5Meso/scFv-CD8-CD3ζ入門克隆的構(gòu)建1.5.1Meso/scFv-CD8-CD3ζ入門克隆TOPO連接反應(yīng)體系如下表5所示：TOPO克隆反應(yīng)條件：將上述反應(yīng)體系輕輕搖勻后，在室溫(21-23℃)下孵育5min。孵育結(jié)束后將反應(yīng)體系置于冰上以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并提取pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質(zhì)粒。表5Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段0.5μl鹽溶液1μlddH2O3.5μlpENTRTM/D-TOPOvector1μl總體積6μl1.5.2入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ的酶切鑒定1.5.2.1酶切體系(NotI/AscI雙酶切體系)如表6所示：表6提純的入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ3.0μlNotI0.5μlAscI0.5μl100×BSA0.2μl10×Buffer2.0μlddH2O15μl總體積21.2μl1.5.2.2酶切條件：37℃水浴鍋中酶解2h；1.5.2.3取2μl酶解產(chǎn)物，用1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。分析電泳條帶以判斷入門克隆是否正確。若入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ正確，NotI/AscI雙酶切得到兩條分別為1.6kb和2.5kb的片段。1.6pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.6.1LR反應(yīng)LR反應(yīng)是入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ和目的載體pLenti6.3/V5-DESTvector發(fā)生的重組反應(yīng)，重組之后得到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/V5/Meso/scFv--CD8-CD3ζ。LR反應(yīng)體系如下表7所示：冰上解凍LRClonaseTMIIPlusEnzymeMix，吸取2μl加至上述LR反應(yīng)體系中，輕柔混勻后，25℃放置1h。加入1μl蛋白酶K至上述反應(yīng)體系，37℃孵育10min。表71.6.2LR反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化步驟1.6.2.1在冰上將一管E.coli感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解凍；1.6.2.2加入2-3μlLR反應(yīng)產(chǎn)物至感受態(tài)細(xì)胞懸液中，輕柔混勻(切勿用移液槍吹打)。冰上孵育30min，42℃水浴中熱擊處理30s，將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至冰上繼續(xù)孵育2min；1.6.2.3加入225μl室溫下預(yù)溫的S.O.C.培養(yǎng)基；1.6.2.4將反應(yīng)管蓋緊后置于37℃水平搖床中225rpm轉(zhuǎn)速下孵育1h；1.6.2.5取出100μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布到預(yù)熱的LB平板(含氨芐青霉素)上，37℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。1.6.3陽(yáng)性克隆的篩選與擴(kuò)增的步驟1.6.3.1用槍頭分別少量蘸取3個(gè)克隆后，將槍頭置于10μl無(wú)菌水中，反復(fù)吹打；1.6.3.2吸取1μl菌液用于PCR，其反應(yīng)體系如下表8：表8菌液1μlTCR正向引物(20μM)1μlV5反向引物(20μM)1μlBio-radsupermix6.25μlddH2O15.75μl總體積25μlPCR反應(yīng)條件如下：1.6.3.3三個(gè)克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)，若在1.6kb處得到清晰的單一條帶，則將鑒定出的陽(yáng)性克隆挑到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；1.6.3.4用質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Promega，Cat.No.A7500)從上述過(guò)夜培養(yǎng)的菌液中分離純化質(zhì)粒DNA即為慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/Meso/scFv--CD8-CD3ζ，同時(shí)保存菌種；1.7pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒的制備1.7.1Day1：取5×106個(gè)293FT細(xì)胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，離心后棄上清，用10ml37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基(D-MEM+10％FBS+2mML-谷氨酰胺+0.1mM非必須氨基酸+1mM丙酮酸鈉+1％P/S)重懸，接種于10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜；1.7.2Day2：棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入5ml含10％FBS的I培養(yǎng)液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)；1.7.32000復(fù)合物的制備：1.7.3.1將1.5ml無(wú)血清的I培養(yǎng)液加入5ml離心管中，加入9μgViraPowerTM包裝質(zhì)?；旌衔锖?μg慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/TO/V5/Meso/scFv--CD8-CD3ζ，輕柔混合；1.7.3.2將1.5ml無(wú)血清的I培養(yǎng)液加入另一個(gè)5ml離心管中，加入36μl2000，輕柔混合后在室溫下孵育5min；1.7.3.3將1.7.3.1和1.7.3.2兩步得到的溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，輕柔混合均勻；1.7.3.4室溫下孵育20min，得到2000復(fù)合物。1.7.4將得到的2000復(fù)合物逐滴緩慢加入到培養(yǎng)皿中，并輕輕地來(lái)回晃動(dòng)培養(yǎng)皿。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜；1.7.5Day3：取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，加入10mlDMEM完全培養(yǎng)基。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育48-72h；1.7.6Day5或Day6：將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，在4℃條件下2000g離心15min；1.7.7吸取上清液，收集pLenti6.3/Meso/scFv--CD8-CD3ζ慢病毒，分裝入1ml凍存管中，置于-80℃長(zhǎng)期保存。2.表達(dá)CD16-CD28–TCRζ融合受體的慢病毒2.1CD16–CD28-TCRζ基因片段的構(gòu)建在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索人CD16(FcfragmentofIgGlowaffinityIIIareceptor，序列，設(shè)計(jì)如表9所示的引物，以人PBMC細(xì)胞總cDNA為模板，PCR獲取CD16分子基因片段(843bp)。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收CD16分子基因片段，利用T4DNA連接酶將CD16分子基因片段與pcDNA3載體連接，獲得pcDNA3-CD16質(zhì)粒。表9引物名稱引物序列SEQIDNOCD16-F5'-AGAGAATTCICTTTGGTGACTTGTCCACTC-3'(EcoRI)10CD16-R5'-AGAACATGCGCTCTTATTACTCCCATGGGA-3'(NspI)11以人T細(xì)胞總cDNA為模板，以如下表10中的引物A和引物B合成CD28分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，NspI/XhoI酶切后克隆進(jìn)pcDNA3-CD16質(zhì)粒，獲得pcDNA3-CD16-CD28(IC)質(zhì)粒。以人T細(xì)胞總cDNA為模板，以如下表10中的引物C、引物D合成CD28核苷酸336–660區(qū)域，以如下表10中的引物E、引物F合成TCRζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。利用如下表10中的引物C、F合成上述兩段PCR合成片段，XhoI/BamHI酶切后克隆進(jìn)pcDNA3-CD16-CD28(IC)質(zhì)粒，獲得pcDNA3-CD16-CD28-TCRζ質(zhì)粒。CD16–CD28-TCRζ融合受體質(zhì)粒構(gòu)建所用到的引物序列如下表10所示：表10將上述獲得的pcDNA3-CD16-CD28-TCRζ質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI//BamHI酶切后獲得CD16-CD28-TCRζ基因片段，基因結(jié)構(gòu)圖見圖2所示。2.2CD16-CD28-TCRζ入門克隆的構(gòu)建2.2.1CD16-CD28-TCRζ入門克隆TOPO連接反應(yīng)體系如表11下：表11CD16-CD28-TCRζ基因片段0.5μl鹽溶液1μlddH2O3.5μlpENTRTM/D-TOPOvector1μl總體積6μlTOPO克隆反應(yīng)條件：將上述反應(yīng)體系輕輕搖勻后，在室溫(21-23℃)下孵育5min。孵育結(jié)束后將反應(yīng)體系置于冰上以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并提取pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ質(zhì)粒；2.2.2入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ的酶切鑒定2.2.2.1酶切體系(NotI/AscI雙酶切體系)如表12所示：表12提純的入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ3.0μlNotI0.5μlAscI0.5μl100×BSA0.2μl10×Buffer2.0μlddH2O15μl總體積21.2μl2.2.2.2酶切條件：37℃水浴鍋中酶解2h；2.2.2.3取2μl酶解產(chǎn)物，用1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。分析電泳條帶以判斷入門克隆是否正確。若入門克隆pENTRTM/D-TOPOMeso/-CD16-CD28-TCRζ正確，NotI/AscI雙酶切得到兩條分別為1.4kb和2.5kb的片段。2.3pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建具體實(shí)驗(yàn)步驟參考步驟1.6，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌進(jìn)行PCR，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)，若在1.4kb處得到清晰的單一條帶，則將鑒定出的陽(yáng)性克隆挑到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Promega，Cat.No.A7500)從上述過(guò)夜培養(yǎng)的菌液中分離純化質(zhì)粒DNA即為慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ，同時(shí)保存菌種。2.3pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒的制備：具體實(shí)驗(yàn)步驟參考步驟1.7。3.Meso/HIF-1α雙特異性TCR-T(M/HBi-TCR-T)細(xì)胞的制備及擴(kuò)增3.1分離基因分型HLA-A2+健康志愿者PBMC細(xì)胞3.1.1抽取HLA-A2+的健康志愿者外周血25ml，肝素抗凝，室溫離心(700g，20min)；吸取上層血漿，置于水浴鍋中56℃，30min；然后4℃靜置15min后，離心(900g，30min)，取自體血漿4℃保存?zhèn)溆茫?.1.2取上述700g，20min離心后下部細(xì)胞成分，加D-PBS至50ml，混勻，緩慢加到裝有20ml人淋巴細(xì)胞分離液的50ml離心管中，室溫離心(800g，15min)；3.1.3吸取白膜層細(xì)胞，加入到裝有5mlRPMI1640的50ml離心管中；3.1.4RPMI1640洗滌兩次(600g，10min離心)，收集細(xì)胞即為PBMC細(xì)胞；3.2M/HBi-TCR-T細(xì)胞的制備3.2.1用含50ng/mlCD3單抗、1000U/mlIL-2和0.5％自體血漿的Alys-505培養(yǎng)液調(diào)整PBMC細(xì)胞密度為1×106/ml，轉(zhuǎn)入六孔板中，2ml/孔，同時(shí)每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于飽和濕度、37℃、5.0％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3.2.2每3天調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，添加含1000U/mlIL-2和0.5％自體血漿的Alys-505培養(yǎng)液；3.2.3第7天，將T細(xì)胞分成兩組，一組用于轉(zhuǎn)染Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因和CD16-CD28-TCRζ基因(M/HBi-TCR-T組)，另一組按正常T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)步驟進(jìn)行培養(yǎng)(WT-T組)，兩組細(xì)胞均按105/孔的密度轉(zhuǎn)移至24孔板中，100μl/孔；3.2.4各解凍一管pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒和pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒溶液，各吸取20μl慢病毒溶液加至60μlAlys-505完全培養(yǎng)基中，用移液管將稀釋后的慢病毒溶液加至M/HBi-TCR-T組的24孔板中，輕輕吹打混勻。WT-T組加入100μlAlys-505完全培養(yǎng)基；3.2.5兩組分別加入終濃度為6μg/ml的Polybrene，來(lái)回輕輕晃動(dòng)混合均勻后，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h；3.2.6第8天，兩組細(xì)胞分別取出離心，棄掉含慢病毒的上清液，分別用200μlAlys-505培養(yǎng)液重懸，加入24孔板中。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行補(bǔ)液；3.2.7第14天，收獲成熟的M/HBi-TCR-T組細(xì)胞和對(duì)照組WT-T細(xì)胞用于后續(xù)分析。4.M/HBi-TCR-T細(xì)胞體外抗腫瘤活性檢測(cè)4.1以M/HBi-TCR-T細(xì)胞、1ug/mlHif1α抗體共孵育的M/HBi-TCR-T細(xì)胞(Hif1α-M/HBi-TCR-T細(xì)胞)、WT-T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，其中T細(xì)胞密度均為105/ml，CFSE標(biāo)記的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按照20:1的效靶比混合效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，輕輕混勻，置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育；4.224h后，加入1μg/mlPI染液，混勻，室溫避光孵育15min后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE+PI+細(xì)胞(死亡的MDA-MB-231細(xì)胞)的百分率。5.M/HBi-TCR-T細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，將含1×107個(gè)癌細(xì)胞的懸液0.1ml于裸鼠腋下注射。實(shí)驗(yàn)分組及治療情況見表13所示，每日觀察各組荷瘤裸鼠的飲食、活動(dòng)等方面的變化，隔日測(cè)量裸鼠體重，觀察體重變化情況；隔2天測(cè)量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b)，觀察腫瘤生長(zhǎng)的情況，按照公式計(jì)算：瘤體積＝1/2×a×b2。第(4)組治療結(jié)束后第13天計(jì)算各組裸鼠的抑瘤率，抑瘤率＝(1-治療組腫瘤平均體積/陰性對(duì)照組腫瘤平均體積)×100％。表13實(shí)驗(yàn)分組及治療情況*FAC化療方案：氟尿嘧啶500mg/M2；阿霉素50mg/M2；環(huán)磷酰胺500mg/M2，第一天給藥，21天一個(gè)療程。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果6.1入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ的酶切鑒定入門克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質(zhì)粒經(jīng)過(guò)NotI/AscI雙酶切后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別在大約1.6kb和2.5kb處有清晰條帶如圖3，與預(yù)期片段數(shù)和片段大小一致。證明Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因正確插入到載體中。6.3重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ轉(zhuǎn)化菌落PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果隨機(jī)挑取LB平板上的三個(gè)克隆，用設(shè)計(jì)的TCR正向引物和V5反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，在1.6kb處出現(xiàn)清晰的條帶，如圖4所示，說(shuō)明Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因成功插入到pLenti6.3/TO/V5-DEST表達(dá)載體中。6.4入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ的酶切鑒定入門克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ質(zhì)粒經(jīng)過(guò)NotI/AscI雙酶切后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別在大約1.4kb和2.5kb處有清晰條帶，如圖5所示，與預(yù)期片段數(shù)和片段大小一致。證明CD16-CD28-TCRζ基因正確插入到載體中。6.5重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ轉(zhuǎn)化菌落PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果隨機(jī)挑取LB平板上的三個(gè)克隆，用設(shè)計(jì)的TCR正向引物和V5反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，在1.4kb處出現(xiàn)清晰的條帶，如圖6所示，說(shuō)明CD16-CD28-TCRζ基因成功插入到pLenti6.3/TO/V5-DEST表達(dá)載體中。6.6T細(xì)胞體外殺傷三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果M/HBi-TCR-T細(xì)胞、Hif1α-M/HBi-TCR-T細(xì)胞和WT-T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，CFSE標(biāo)記的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞作為靶細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，WT-T細(xì)胞對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷率約為22.15％，單純M/HBi-TCR-T細(xì)胞對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷率約為25.71％，而Hif1α-M/HBi-TCR-T細(xì)胞對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷率高達(dá)70.83％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組WT-T細(xì)胞和單純M/HBi-TCR-T細(xì)胞的殺傷率。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例提供的M/HBi-TCR-T細(xì)胞可在Hif1α抗體的控制下實(shí)現(xiàn)對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的高特異性、高效的殺傷作用。6.7M/HBi-TCR-T細(xì)胞體內(nèi)抑制三陰性乳腺癌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果治療結(jié)束時(shí)120只動(dòng)物全部存活。觀察發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組裸鼠活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，體重隨著腫瘤的生長(zhǎng)略有下降；單純化療組動(dòng)物用藥后雖腫瘤生長(zhǎng)得到較好控制但消瘦嚴(yán)重，進(jìn)食和活動(dòng)明顯減少；單純M/HBi-TCR-T細(xì)胞治療組腫瘤控制不及單純化療組理想，但裸鼠生活狀態(tài)良好，體重未見明顯下降；M/HBi-TCR-T細(xì)胞聯(lián)合Hif1α抗體治療組裸鼠覓食、飲水、活動(dòng)等狀況良好，體重也未見明顯下降，且腫瘤生長(zhǎng)得到較好控制，抑瘤率達(dá)到67.2％。體重情況和腫瘤抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表14。表14各組裸鼠體重、腫瘤體積及抑瘤率的比較治療結(jié)束后第13天，各組裸鼠腋下移植瘤的生長(zhǎng)情況見圖8，荷瘤裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：本發(fā)明實(shí)施例提供的M/HBi-TCR-T細(xì)胞與Hif1α抗體聯(lián)用可降低毒副作用，同時(shí)有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 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