一種研究北蟲草多糖對(duì)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法與流程

本發(fā)明涉及生物免疫領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及一種研究北蟲草多糖對(duì)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法。

背景技術(shù)：
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家蠶是世界上飼養(yǎng)最多的昆蟲，利用家蠶幼蟲栽培北蟲草有著豐富的可利用資源。再者，近幾年蠶桑業(yè)也面臨著嚴(yán)重的滑坡，如何提升蠶桑產(chǎn)業(yè)的附加值迫在眉睫，利用家蠶幼蟲栽培北蟲草不僅成本較低，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也不低于野生的冬蟲夏草，社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益顯著，就一張蠶種的產(chǎn)值來(lái)算一筆經(jīng)濟(jì)賬，一般春蠶飼養(yǎng)1張蠶種，張種產(chǎn)量100斤左右，繭價(jià)2000元/擔(dān)，一張種收入2000元，用一張五齡幼蟲蠶種栽培北蟲草，可得到干體蠶蟲草14斤左右，以每斤500元計(jì)算，一張種的產(chǎn)值7000元，是絲繭育的3.5倍，可大大的提升蠶桑產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)出值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種研究北蟲草多糖對(duì)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法。本發(fā)明具有步驟簡(jiǎn)單，使用方便，可以推測(cè)北蟲草多糖能有效提高機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，北蟲草多糖對(duì)Th1和Th2類細(xì)胞因子均有明顯的提升效果，表明機(jī)體的免疫應(yīng)答機(jī)制可能被激活，另外，北蟲草多糖可能對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的平衡上具有一定的調(diào)節(jié)作用的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)解決措施如下：

一種研究北蟲草多糖對(duì)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法，本發(fā)明包括如下步驟：(1)北蟲草多糖粗提物制備；(2)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其免疫；(3)、I gG效價(jià)的測(cè)定；(4)、IgG亞類測(cè)定；(5)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；(6)、細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)；(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出結(jié)論。

上述技術(shù)方案中，所述北蟲草多糖粗提物制備的步驟包括：將北蟲草3000g,粉碎,用石油醚脫脂3次,每次10.5L,共去掉脂質(zhì)601.5g；殘?jiān)?0％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，減壓濃縮至1.25g/ml。

上述技術(shù)方案中，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其免疫的步驟包括：將ICR小鼠35只隨機(jī)分成7組,每組5只。每只小鼠頸部皮下注射含OVA(10μg)和組分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理鹽水溶液,對(duì)照組小鼠注射含OVA的生理鹽水溶液，2周后進(jìn)行二免,二免后3周采血,制備血清。

上述技術(shù)方案中，所述I gG效價(jià)的測(cè)定的步驟包括：在96孔酶標(biāo)板每孔加入100μL包被液(含5μg OVA/mL的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液),置4℃孵育18h后,洗滌液(pH 7.4磷酸鹽緩沖液PBS)洗滌3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS 封閉液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；用稀釋液將待測(cè)血清在酶標(biāo)板上作二倍稀釋,使血清稀釋度為1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經(jīng)1:500稀釋的羊抗小鼠IgG抗體(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB(四甲基聯(lián)苯二胺)底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

上述技術(shù)方案中，所述IgG亞類測(cè)定的步驟包括：在已包被抗原OVA的96孔酶標(biāo)板上加入1:800倍稀釋的待檢血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經(jīng)1:600稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入1:4 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

上述技術(shù)方案中，所述淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的步驟包括：將小鼠脫頸椎處死，75％酒精液浸泡5-10min，無(wú)菌操作取小鼠脾臟，加入1mL Hank’s研磨，研磨均勻后將脾細(xì)胞吹懸入平皿，過200目銅網(wǎng)后轉(zhuǎn)移入10mL離心管；1500rpm離心10min；PBS洗滌2次；細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×10⁶/mL，按100μl/孔的量加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；用細(xì)胞培養(yǎng)液配制各種刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS終濃度為5μg/mL，ConA終濃度為7.5μg/mL，設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照)；37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入50μl MTT(2mg/mL)；然后將培養(yǎng)板取出，離心(1 500rpm，10min)沉淀細(xì)胞，輕輕傾去培養(yǎng)液上清，紙巾吸干；每孔加入150μl二甲基亞砜，避光充分振蕩，直至藍(lán)色顆粒完全溶解，570nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值；計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(Stimulation index，SI)：

SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。

上述技術(shù)方案中，所述細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)的步驟包括：

(a)、脾淋巴細(xì)胞體外刺激；

(b)、Total RNA提取；

(c)、反轉(zhuǎn)錄；

(d)、引物及探針設(shè)計(jì)；

(e)、Real-time PCR反應(yīng)體系及條件；

(f)、相對(duì)定量計(jì)算方法。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單，使用方便，可以推測(cè)北蟲草多糖能有效提高機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，北蟲草多糖對(duì)Th1和Th2類細(xì)胞因子均有明顯的提升效果，表明機(jī)體的免疫應(yīng)答機(jī)制可能被激活，另外，北蟲草多糖可能對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的平衡上具有一定的調(diào)節(jié)作用。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明研究技術(shù)路線示意圖；

圖2為不同劑量蟲草多糖佐劑組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清IgG抗體水平對(duì)照示意圖；

圖3為不同劑量蟲草多糖佐劑組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清IgG1和IgG2a抗體水平對(duì)照示意圖；

圖4為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果示意圖；

圖5為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)水平示意圖；

圖6為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導(dǎo)IL-12表達(dá)水平示意圖；

圖7為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平示意圖；

圖8為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導(dǎo)IL-4表達(dá)水平示意圖。

具體實(shí)施方式：

以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施方式所涉及之范圍。

實(shí)施例：一種研究北蟲草多糖對(duì)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法，本發(fā)明包括如下步驟：(1)北蟲草多糖粗提物制備；(2)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其免疫；(3)、I gG效價(jià)的測(cè)定；(4)、IgG亞類測(cè)定；(5)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；(6)、細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)；(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出結(jié)論。

所述北蟲草多糖粗提物制備的步驟包括：將北蟲草3000g,粉碎,用石油醚脫脂3次,每次10.5L,共去掉脂質(zhì)601.5g；殘?jiān)?0％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，減壓濃縮至1.25g/ml。

所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其免疫的步驟包括：將ICR小鼠35只隨機(jī)分成7組,每組5只。每只小鼠頸部皮下注射含OVA(10μg)和組分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理鹽水溶液,對(duì)照組小鼠注射含OVA的生理鹽水溶液，2周后進(jìn)行二免,二免后3周采血,制備血清。

所述I gG效價(jià)的測(cè)定的步驟包括：在96孔酶標(biāo)板每孔加入100μL包被液(含5μg OVA/mL的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液),置4℃孵育18h后,洗滌液(pH 7.4磷酸鹽緩沖液PBS)洗滌3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS封閉液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；用稀釋液將待測(cè)血清在酶標(biāo)板上作二倍稀釋,使血清稀釋度為1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經(jīng)1:500稀釋的羊抗小鼠IgG抗體(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB(四甲基聯(lián)苯二胺)底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

所述IgG亞類測(cè)定的步驟包括：在已包被抗原OVA的96孔酶標(biāo)板上加入1:800倍稀釋的待檢血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經(jīng)1:600稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入1:4 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

所述淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的步驟包括：將小鼠脫頸椎處死，75％酒精液浸泡5-10min，無(wú)菌操作取小鼠脾臟，加入1mL Hank’s研磨，研磨均勻后將脾細(xì)胞吹懸入平皿，過200目銅網(wǎng)后轉(zhuǎn)移入10mL離心管；1500rpm離心10min；PBS洗滌2次；細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×10⁶/mL，按100μl/孔的量加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；用細(xì)胞培養(yǎng)液配制各種刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS終濃度為5μg/mL，ConA終濃度為7.5μg/mL，設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照)；37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入50μl MTT(2mg/mL)；然后將培養(yǎng)板取出，離心(1 500rpm，10min)沉淀細(xì)胞，輕輕傾去培養(yǎng)液上清，紙巾吸干；每孔加入150μl二甲基亞砜，避光充分振蕩，直至藍(lán)色顆粒完全溶解，570nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值；計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(Stimulation index，SI)：

SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。

所述細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)的步驟包括：(a)、脾淋巴細(xì)胞體外刺激：將述分離到的脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁷cell/ml，鋪板培養(yǎng)于24孔板，每孔2ml。向培養(yǎng)板內(nèi)加入刺激物(H1N1流感抗原)，至HA終濃度為2μg/ml，將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5％CO₂的環(huán)境中，抗原刺激15h后離心收集細(xì)胞，加入RNA提取試劑溶解后保存細(xì)胞裂解液于-80℃；(b)、Total RNA提?。禾崛〖?xì)胞總RNA，RNA提取效果電泳鑒定：使用1.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析；(c)、反轉(zhuǎn)錄：采用iScript cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，獲得的cDNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆茫?d)、引物及探針設(shè)計(jì)：采用實(shí)時(shí)熒光定量雙重PCR方法檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以小鼠β-acting為內(nèi)參基因，使用ABI 7300熒光定量PCR儀；目的基因探針5’端以FAM標(biāo)記，β-actin探針5’端HEX標(biāo)記，目的基因和內(nèi)參基因3’端均采用BHQ-1標(biāo)記。引物和探針序列設(shè)計(jì)采用軟件Primer Express 3.0；基因產(chǎn)物均經(jīng)過DNA測(cè)序鑒定；(e)、Real-time PCR反應(yīng)體系及條件：采用總體積為25μl的反應(yīng)體系,依次加入1×Taq-Man通用反應(yīng)預(yù)混液、目的基因引物和探針、β-actin引物和探針、cDNA模板(2μl)。PCR反應(yīng)程序采用標(biāo)準(zhǔn)TaqMan條件：95℃(15sec)，60℃(30sec)，45個(gè)PCR循環(huán)；(f)、相對(duì)定量計(jì)算方法：設(shè)定熒光閾值(處于基因擴(kuò)增信號(hào)的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(logarithmic phase)內(nèi)的某個(gè)閥值(thresholds)被指定為Ct值)，根據(jù)不同管內(nèi)擴(kuò)增曲線中對(duì)應(yīng)熒光閾值確定樣品Ct值，采用相關(guān)方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

所述統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出結(jié)論：

由圖2可知北蟲草多糖佐劑組均高于抗原單獨(dú)免疫組，而中劑量蟲草多糖佐劑組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清IgG抗體水平要顯著高于抗原單獨(dú)免疫組；

由圖3可知，北蟲草多糖低劑量組小鼠血清中IgG1和IgG2a水均顯著抗原單獨(dú)免疫組小鼠，其它劑量多糖組在兩種抗體亞類水平上均略高于抗原單獨(dú)免疫組小鼠，鋁膠僅能誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，而抗體亞類檢測(cè)結(jié)果也反應(yīng)出鋁佐劑組小鼠僅有IgG1水平顯著升高；

圖4可知北蟲草多糖佐劑組小鼠T/B淋巴細(xì)胞均被激活，尤其是中劑量組，對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)顯著高于抗原單獨(dú)免疫組。本結(jié)果提示，北蟲草多糖能有效激活機(jī)體免疫細(xì)胞，對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)有促進(jìn)作用；

圖5、圖6、圖7及圖8可知：北蟲草多糖粗提物佐劑組能有效誘導(dǎo)IFN-γ、IL-12、IL-4，尤其是中劑量多糖佐劑組，所誘導(dǎo)的各種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平要顯著高于抗原單獨(dú)免疫組。鋁佐劑僅能誘導(dǎo)Th2類細(xì)胞因子IL-4和IL-10mRNA的表達(dá)。

研究結(jié)論：

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，北蟲草多糖作為蛋白類抗原的佐劑，能有效提高小鼠免疫應(yīng)答能力，血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果可知，北蟲草多糖能有效提高OVA免疫小鼠血清中特異性血清抗體及抗體亞類水平，一定劑量的多糖對(duì)IgG1和IgG2a均有促進(jìn)分泌的作用。

由淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平檢測(cè)結(jié)果可知，北蟲草多糖能有效激活機(jī)體T/B淋巴細(xì)胞，進(jìn)而為提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。

細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明，北蟲草多糖能有效促進(jìn)IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，尤其是中劑量多糖佐劑組，對(duì)兩類細(xì)胞因子表達(dá)水平均有顯著激活效應(yīng)，

本實(shí)驗(yàn)以ICR小鼠為模型，經(jīng)模式抗原OVA免疫后，提取北蟲草多糖粗多糖、分別從小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面進(jìn)行分析，檢測(cè)了ICR小鼠48只，隨機(jī)分成6組，分別為生理鹽水組、10μg抗原組、10μg抗原混合不同劑量(低、中、高)北蟲草粗多糖粗提物以及10μg抗原加上200μg鋁佐劑作為陽(yáng)性對(duì)照組，小鼠間隔2周皮下免疫2次，二免后2周采血測(cè)定血清特異性IgG、IgG亞類、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平檢測(cè)、細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，中劑量組能顯著提高血清特異性IgG抗體及亞類水平、特異性T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平、增強(qiáng)小鼠機(jī)體Th1/Th2混合型細(xì)胞免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)將北蟲草多糖與抗原物質(zhì)聯(lián)合使用，能有效提高機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為進(jìn)一步開發(fā)利用北蟲草多糖提供科學(xué)依據(jù)；

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)北蟲草多糖能有效提高機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，北蟲草多糖對(duì)Th1和Th2類細(xì)胞因子均有明顯的提升左右，表明機(jī)體的免疫應(yīng)答機(jī)制可能被激活，另外，北蟲草多糖可能對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的平衡上具有一定的調(diào)節(jié)作用。