連接蛋白半通道的特異性調(diào)節(jié)劑的制作方法

本發(fā)明涉及鑒定由連接蛋白形成的半通道的特異性調(diào)節(jié)化合物(阻斷劑)的方法、在此方法學(xué)下所鑒定的化合物的新用途和包括這些化合物以用于治療與由連接蛋白形成的半通道的活性增加相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述疾病諸如炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)，疼痛治療，骨骼肌去神經(jīng)支配，肌營(yíng)養(yǎng)不良，缺血后再灌注(例如：心臟或腦梗塞)，脊髓損傷和以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特征的遺傳疾病。

背景技術(shù)：

連接蛋白(connexin)為內(nèi)在膜蛋白，其在原生質(zhì)膜中呈六邊形布置，即稱之為連接子或半通道。兩個(gè)半通道可通過(guò)它們的胞外片段結(jié)合在一起以便形成通道間隙連接或者間隙連接，這允許許多物質(zhì)在細(xì)胞間直接轉(zhuǎn)移(Sáez,Merthoud et al.2003)。在過(guò)去的十年里，已經(jīng)顯示出在生理?xiàng)l件下，半通道在代謝產(chǎn)物和營(yíng)養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用(Chandrasekhar and Bera 2012)，而且其在細(xì)胞間信號(hào)分子(諸如ATP、谷氨酸、前列腺素E2和NAD⁺)的釋放中也發(fā)揮了重要作用，提供了用于自分泌和旁分泌信號(hào)在膜中的路徑(Wang,De Bock et al.2012)。但是，在不同的病理?xiàng)l件下，由連接蛋白形成的半通道的活性被上調(diào)，且顯著促進(jìn)細(xì)胞變性的結(jié)果(Sáez,Schalper et al.2010)。

最近通過(guò)X射線晶體學(xué)的至分辨率的連接蛋白的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定(Maeda et al.2009)顯示半通道是間隙連接的保守動(dòng)機(jī)，且它們可被看作結(jié)構(gòu)單元模塊(Yeager,2009)。由連接蛋白26形成的半通道結(jié)構(gòu)顯示每個(gè)單體由4個(gè)跨膜α螺旋(TM1-TM4)、2個(gè)胞外環(huán)(E1、E2)、1個(gè)胞內(nèi)環(huán)以及一個(gè)N-端螺旋結(jié)構(gòu)域(NTH)和C-端結(jié)構(gòu)域組成。每個(gè)連接包含6個(gè)原體的布置且連接蛋白26的每個(gè)單體包含典型的四螺旋束，其中任何相鄰的螺旋對(duì)是反平行的(Maeda and Tsukihara,2011)。連接蛋白26的第二種結(jié)構(gòu)的布置如下：各自地，TM1、TM2和E1面向孔；TM3、TM4和E2分別位于半通道的周邊中，所述半通道在膜脂或胞外環(huán)境之前；TM2和TM1位于細(xì)胞質(zhì)中的一半被NTH覆蓋，且它們沒(méi)有被暴露(圖1)。

數(shù)條研究表明由連接蛋白形成的通道的特異性抑制劑的應(yīng)用能夠在癲癇，心律失常，癌癥，中風(fēng)或其它狀況中具有治療作用(Spray,Rozental et al.2002)。雖然通過(guò)電生理技術(shù)和采用重組蛋白的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)可以鑒別據(jù)說(shuō)能直接作用在半通道或者通道以調(diào)節(jié)它們的功能的藥物，但是對(duì)于大部分(若非全部)到目前為止所報(bào)道的由連接蛋白形成的半通道抑制劑，它們的活性通過(guò)何種精確機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)運(yùn)的特性仍舊未知(Juszczak and Swiergiel 2009)。此外，到目前為止所描述的所有化合物在微摩爾濃度都是有效的，這顯示它們幾乎不具有選擇性且它們中的許多還阻斷了由panexin形成的半通道(Varselis and Srinivas 2013)。因此，迫切地需要藥理學(xué)工具以進(jìn)一步明確它們的功能并驗(yàn)證它們作為藥理學(xué)靶標(biāo)，用于發(fā)展針對(duì)基于連接蛋白功能紊亂的疾病的新的治療方法(Bodendiek and Raman 2010)。

目前存在數(shù)種連接蛋白調(diào)節(jié)劑，但是它們中的大多數(shù)同時(shí)影響由連接蛋白形成的半通道和通道的活性。此外，抑制連接蛋白表達(dá)的反義RNA或者嗎啉代的使用消除了半通道和間隙連接兩者的表達(dá)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中所描述的化合物顯示出幾乎沒(méi)有功效和非特異性的作用機(jī)制或非特異性繼發(fā)于其它修飾連接蛋白活性的治療靶標(biāo)(例如激酶)的藥理學(xué)作用。

在現(xiàn)有階段中存在描述了調(diào)節(jié)由連接蛋白形成的半通道的活性的組合物和方法的例如EP1469875,US7153822,WO2003063891,US20040092429,US20070042964 y WO2006134494專利或?qū)＠暾?qǐng)。在這樣的文獻(xiàn)所提出的機(jī)制中，存在連接蛋白43的C-端片段中的酪氨酸殘基的磷酸化，通過(guò)采用肽模擬物阻斷了2個(gè)半通道的結(jié)合，所述肽模擬物與半通道或者其跨膜區(qū)之間的結(jié)合區(qū)域類似，所述跨膜區(qū)修飾半通道的形成。但是，這些化合物對(duì)通過(guò)半通道的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有選擇性，而且它們還非特異性地影響間隙連接通道，。

此外，專利申請(qǐng)WO2007002139要求保護(hù)一種在視網(wǎng)膜細(xì)胞中通過(guò)降低響應(yīng)于本地高血壓的連接蛋白介導(dǎo)的ATP釋放的神經(jīng)保護(hù)方法。在此申請(qǐng)中，指定半通道阻斷劑可以為甲氟喹，甲氯滅酸，視黃酸，18-α-巨青霉烯酸(18-alpha-gliciretinic acid)，氟滅酸，尼氟酸(riflumic acid)，生胃酮，肽模擬物或其組合。但是，這些化合物對(duì)由連接蛋白形成的半通道沒(méi)有選擇性，因?yàn)樗鼈冞€阻斷了間隙連接通道，藥理學(xué)作用依賴于ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)，所述ATP能夠通過(guò)另外的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到半通道。

在其它實(shí)例中，諸如申請(qǐng)WO2009148613，引入反義寡核苷酸、干擾RNA或者siRNA的應(yīng)用以抑制位于兩細(xì)胞之間的細(xì)胞間通道的表達(dá)，所述細(xì)胞間通道作為細(xì)胞表面的半通道。但是，這些寡核苷酸特異性調(diào)節(jié)連接蛋白43同工型(在人類中存在20種額外的連接蛋白)，且它們僅允許用于經(jīng)皮給藥、靜脈注射或者沉積給藥(deposit administration)形式的制劑。

在申請(qǐng)JP2011506446中，描述了抗體或者結(jié)合抗原的片段的應(yīng)用，其在慢性炎性疾病中并沒(méi)有效，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)或過(guò)敏反應(yīng)。鑒于此，對(duì)于具有調(diào)節(jié)由連接蛋白形成的半通道的形成、打開(kāi)或者活性功能的藥物的極大興趣是顯而易見(jiàn)的。

在申請(qǐng)US20110223204中，調(diào)節(jié)試劑的采用被要求保護(hù)，所述調(diào)節(jié)試劑為反義寡核苷酸、核酶、RNAi或者具有長(zhǎng)度在15-35個(gè)核苷酸之間并具有與連接蛋白43的mRNA反義序列至少70％同源性的siRNA。這些生物學(xué)衍生物可僅通過(guò)同工型連接蛋白43選擇，且其具有阻止由連接蛋白43形成的半通道和間隙連接的形成的效果。間隙連接的形成的阻斷對(duì)器官表達(dá)連接蛋白43的正常活動(dòng)是有害的副作用。此外，所述的化合物顯示了對(duì)寡核苷酸的普遍限制作用，例如它們不能口服給藥，而且它們應(yīng)當(dāng)以另一種靜脈注射的藥物形式類型進(jìn)行制劑。

文獻(xiàn)US20090143425描述了衍生自喹啉類影響間隙連接的化合物。但是，這些化合物并不是由連接蛋白形成的半通道的選擇性抑制劑。

申請(qǐng)US20090163440描述了離子通道的調(diào)節(jié)，特別是由連接蛋白43組成的通道的調(diào)節(jié)，其中所采用的用于調(diào)節(jié)它們的藥物選自已知的不同的離子通道調(diào)節(jié)劑：氨氯地平，芐普地爾，地爾硫卓，達(dá)舒平，恩卡尼，非洛地平，加洛帕米，伊拉地平，脈律定，尼卡地平，硝苯地平，尼莫地平，尼群地平，普魯卡因胺，奎尼丁，河豚毒素，戊脈安。在所述文獻(xiàn)中的以上描述的所有選擇中，僅有奎尼丁顯示出針對(duì)連接蛋白通道的非特異性和低效價(jià)的活活性。

在專利申請(qǐng)US20120135960和US20110172188中，描述了甲氟喹在眾多之中被描述為連接蛋白阻斷試劑。但是，甲氟喹是對(duì)由連接蛋白Cx26、Cx32、Cx36、Cx43和Cx50形成的間隙連接通道的非選擇性阻斷劑。此化合物沒(méi)有選擇性抑制由所述連接蛋白形成的半通道。

文獻(xiàn)US20080131528、US20060228433和US20080096854描述了恢復(fù)間隙連接功能的組合物的采用。這些組合物的目的是為了提高間隙連接的活性。但是，對(duì)于此種化合物，沒(méi)有已知的對(duì)由連接蛋白形成的半通道的抑制效果。

從已經(jīng)描述的內(nèi)容衍生出目前由可獲得的連接蛋白形成的半通道的阻斷劑還抑制間隙連接，所述間隙連接在協(xié)調(diào)許多組織中的電荷代謝反應(yīng)中起到了重要作用。因此，期望獲得特異性針對(duì)半通道的阻斷化合物，其中所述化合物對(duì)間隙連接通道沒(méi)有影響，這能夠應(yīng)用于以理性的方式對(duì)各種疾病設(shè)計(jì)治療方法，最小化所不期望的副作用。

對(duì)于確定新藥的方法學(xué)，在現(xiàn)階段存在多種研究較大特異性的化合物的方法。例如，文獻(xiàn)US2014141099公開(kāi)了藥物開(kāi)發(fā)方法，特別是Aurora激酶抑制劑和所述促使Aurora B蛋白構(gòu)像改變的藥效團(tuán)(其兩步法結(jié)合常數(shù)為Ki*)，且它還涉及具有所述藥效團(tuán)的特性的化合物。所述選擇Aurora B抑制劑的方法包括測(cè)定Ki、測(cè)定Ki*和篩選具有預(yù)設(shè)Ki/Ki*的化合物的步驟。對(duì)于Ki*的測(cè)定，預(yù)先將所研究的化合物與激酶Aurora孵育；稀釋被測(cè)試混合物，并且持續(xù)測(cè)定Ki*一段時(shí)間。

為了尋找對(duì)特定受體具有較大親和力的化合物，專利文獻(xiàn)US8131527公開(kāi)了一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)受體調(diào)節(jié)劑化合物的鑒定方法，所述FGF受體對(duì)FGF具有比對(duì)VEGFR2更大親和力，，所述方法包括多個(gè)步驟：由給定的化學(xué)式表示的藥效團(tuán)進(jìn)行設(shè)計(jì)和/或選擇調(diào)節(jié)劑；然后根據(jù)步驟(a)對(duì)所述調(diào)節(jié)劑進(jìn)行模擬表示；FGF蛋白或者至少圍繞Asp641的形成結(jié)合位點(diǎn)的FGF蛋白的一部分發(fā)生原子協(xié)調(diào)；根據(jù)步驟(b)或者一個(gè)或多個(gè)FGF殘基調(diào)整一個(gè)或多個(gè)候選調(diào)節(jié)劑以便確定所述候選調(diào)節(jié)劑能夠與FGF反應(yīng)的可能性，其中所限定的初始化學(xué)式的NHs與Asp641的羧酸的一個(gè)或者兩個(gè)氧形成氫鍵；可選地，被研究的所述調(diào)節(jié)劑能夠基于裝配階段的結(jié)果被修飾；以及將被研究的所述調(diào)節(jié)劑與FGF和/或VEGFR2接觸以便確定所述候選調(diào)節(jié)劑對(duì)于受體之一具有優(yōu)選的接觸親和力的能力。

此外，對(duì)于專利申請(qǐng)WO20004012683，其公開(kāi)了一種鑒定用于疾病的治療化合物，所述疾病由具有SET域的蛋白的有機(jī)體引起，其包括分析被研究的化合物調(diào)節(jié)所述蛋白的至少一個(gè)“可藥”區(qū)域的活性的能力，其中所述調(diào)節(jié)能力指示出候選治療化合物。

而且，從此些文獻(xiàn)和現(xiàn)有階段中可獲得的信息，推測(cè)得知沒(méi)有背景研究揭示出有效和特異性鑒定和選擇能夠選擇性調(diào)節(jié)由連接蛋白形成的半通道的活性的化合物的方法。

附圖說(shuō)明

圖1.連接蛋白半通道的基本結(jié)構(gòu)的示意性圖示。

連接蛋白半通道的二級(jí)結(jié)構(gòu)由連接蛋白原體的六聚體排布組成。每個(gè)原體的域由名稱表示并由不同灰度編碼且由箭頭表示。膜平面由黑線表示。

圖2.半通道的合成抑制劑的生物學(xué)評(píng)估的分析方案。

其中將Cx43細(xì)胞培養(yǎng)物在96孔黑色培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)，并經(jīng)過(guò)3次溴化乙啶吸收分析，以熒光計(jì)中發(fā)射的熒光作為評(píng)估指標(biāo)。。

圖3.HeLa Cx43-EGFP中的溴化乙啶吸收。DCFS的效果。

A：培養(yǎng)中的細(xì)胞。B：HeLa Cx43-EGFP中的溴化乙啶吸收?qǐng)D表。C：胞外DCSF誘導(dǎo)Cx43中溴化乙啶的進(jìn)入；示出DCSF的效果，其被抑制分子(MX)(10nM)阻斷(P<0.05，n＝4).

圖4.用無(wú)鈣離子(或Ca²⁺)并含有EGTA的生理鹽水，清洗HeLa細(xì)胞中的由連接蛋白43形成的半通道的單元流。

圖5.隨時(shí)間變化的耦合發(fā)生率。

圖6.由溴化乙啶的轉(zhuǎn)移評(píng)估細(xì)胞耦合。

A：HeLa-Cx43細(xì)胞(轉(zhuǎn)染有連接蛋白43)中不同抑制劑的效果。B：細(xì)胞耦合指數(shù)。

圖7.由機(jī)械壓力驅(qū)動(dòng)的由panexine1(Panx1)形成的半通道的功能狀態(tài)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

當(dāng)描述本發(fā)明的化合物、組合物和步驟時(shí)，下列術(shù)語(yǔ)具有以下所示的意思，除非另有說(shuō)明。

術(shù)語(yǔ)“C_1-3烷基”指包括1-3個(gè)碳原子的烴鏈。

術(shù)語(yǔ)“C_1-3烷氧基”指包括1-3個(gè)碳原子結(jié)合到氧原子的烴鏈。

術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指當(dāng)對(duì)需要治療的患者實(shí)施治療時(shí)，實(shí)施的足夠的量。

術(shù)語(yǔ)“治療”，如在說(shuō)明書中所使用的，指人類患者中疾病或病理性醫(yī)療狀況的治療，包括：

(a)預(yù)防疾病或病理性醫(yī)療狀況的發(fā)生，即對(duì)患者的預(yù)防性治療；

(b)緩解疾病或病理性醫(yī)療狀況，即引起患者疾病或病理性醫(yī)療狀況的衰退；

(c)抑制疾病或病理性醫(yī)療狀況，即延遲患者的疾病或病理性醫(yī)療狀況的發(fā)展；或者

(d)緩解患者的疾病或病理性醫(yī)療狀況的癥狀。

“與連接蛋白活性相關(guān)的疾病或病理性醫(yī)療狀況”的表達(dá)包括目前知曉的或者未來(lái)被發(fā)現(xiàn)的與由連接蛋白26和/或43形成的半通道活性增加相關(guān)的疾病和/或階段的所有狀態(tài)。疾病或狀況的此些狀態(tài)包括，但不限于，炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)、纖維變性、疼痛治療、骨骼肌去神經(jīng)支配、肌營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓損傷以及以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特征的遺傳疾病。

術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的鹽”指從可用于給予患者(諸如哺乳動(dòng)物)的堿或酸制備的鹽。所述鹽能夠從無(wú)機(jī)或有機(jī)藥物可接受堿和從無(wú)機(jī)或有機(jī)藥物可接受酸獲得。

衍生自藥物可接受酸的鹽包括下述酸：乙酸，苯磺酸，苯甲酸，canfosulfonic，檸檬酸，etanosulfonic，富馬酸，葡萄糖酸，谷氨酸，溴酸(bromhidric)，氯化氫(clorhidric)，乳酸，馬來(lái)酸，蘋果酸，扁桃酸，metanosulfonic，黏酸，硝酸，泛酸，磷酸，琥珀酸，磺酸，酒石酸，對(duì)甲苯磺酸，xinafoic(1-羥基-2-萘甲酸)及其類似物。所述鹽特別優(yōu)選地為那些衍生自富馬酸，溴酸，氯化氫，乙酸，硫酸，甲磺酸，xinafoic和酒石酸。

衍生自藥物可接受的無(wú)機(jī)鹽包括鋁，氨，鈣，銅，三價(jià)鐵，亞鐵，鋰，鎂，錳，錳，鉀，鈉，鋅和類似鹽。特別優(yōu)選的為鋁、鈣、鎂、鉀和鈉鹽。

衍生自藥物可接受的有機(jī)堿的鹽包括初級(jí)、二級(jí)和三級(jí)的鹽，包括胺取代的、環(huán)胺、天然來(lái)源的胺或類似物，諸如精氨酸，甜菜堿，咖啡因，膽堿N，N'-二芐基乙二胺，二乙胺，2-二乙基氨基乙醇，2-二乙基乙醇胺(2-diethylamineetanol)，乙醇胺，乙二胺，N-乙基嗎啉，N-乙基哌啶，葡糖胺，組氨酸，異丙胺，賴氨酸，甲基葡糖胺，嗎啉，哌啶，聚胺樹(shù)脂，普魯卡因，嘌呤，可可堿，三乙胺，三甲胺，三丙胺，氨基丁三醇及類似物。

術(shù)語(yǔ)“溶劑化物”指由一個(gè)或多個(gè)溶質(zhì)分子，即本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽之一和溶劑的一個(gè)或多個(gè)分子形成的復(fù)合物或聚集物。所述溶劑化物通常是具有基本固定的摩爾比的溶質(zhì)和溶劑的結(jié)晶固體。代表性的溶劑包括，例如，水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸和類似物。當(dāng)所述溶劑為水時(shí)，形成的溶劑化物為水合物。

術(shù)語(yǔ)“或其藥物上可接受的鹽或其立體異構(gòu)體的溶劑化物中的一個(gè)”包括化學(xué)式(A-G)所示化合物的鹽、溶劑化物和立體異構(gòu)體的所有組合。

術(shù)語(yǔ)“可藥區(qū)域”是指核酸、多肽、復(fù)合物和類似物，并且其涉及形成半通道的連接蛋白的區(qū)域，其用于或可能用于結(jié)合降低或抑制半通道的活性的試劑。

對(duì)于多肽，可藥區(qū)通常指多肽的區(qū)域，區(qū)域上的數(shù)個(gè)氨基酸能夠與藥劑交互作用。對(duì)于多肽或其化合物，可藥區(qū)域的實(shí)例為口袋、結(jié)合位點(diǎn)、多肽的結(jié)構(gòu)域之間的界面、多肽的溝槽或表面復(fù)合物或輪廓或多肽表面、或者能夠與其它分子(諸如細(xì)胞膜)相互作用的復(fù)合物。特別地，連接蛋白中的可藥區(qū)域?qū)?duì)應(yīng)一個(gè)口袋，所述口袋受殘基限制，所述殘基對(duì)應(yīng)在連接蛋白中一個(gè)原體的殘基3-10(NTH)、29-40(TM1)、74-93(TM2)的片段和另一個(gè)相鄰的原體的殘基29-40(TM1)，或者對(duì)應(yīng)其它連接蛋白的等價(jià)殘基。本發(fā)明涉及鑒定特異性和有效調(diào)節(jié)由連接蛋白形成的半通道的化合物(阻斷劑)的方法，此方法所鑒定的化合物以及包括所述化合物的藥物組合物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供這些化合物使用方法，以及治療與由連接蛋白形成的半通道活性增加相關(guān)的有用藥物的制備方法，所述疾病諸如炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)，疼痛治療，骨骼肌去神經(jīng)支配，肌營(yíng)養(yǎng)不良，脊髓損傷以及以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特征的遺傳疾病。

治療患者的炎性疾病的應(yīng)用包括給予患者有效治療量的化合物，所述化合物抑制由連接蛋白形成的半通道的活動(dòng)，打開(kāi)或轉(zhuǎn)運(yùn)。

在本發(fā)明中，基于治療靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)采用了一種鑒定藥物的方法以解決獲得有效且特異性調(diào)節(jié)由連接蛋白形成的半通道的化合物的技術(shù)問(wèn)題。本申請(qǐng)基于應(yīng)用于連接蛋白的結(jié)構(gòu)的藥物鑒定的策略的目的是獲得用于調(diào)節(jié)由連接蛋白形成的半通道的具有較高親和力和選擇性的新藥劑，所述藥劑通過(guò)特異性降低了對(duì)患者的副作用。

通過(guò)細(xì)胞膜的滲透試驗(yàn)和顯微數(shù)據(jù)流的測(cè)量檢測(cè)所述化合物的生物活性。

根據(jù)本發(fā)明鑒定由連接蛋白形成的半通道的特異性抑制化合物的方法，首先分析不同人類連接蛋白的治療性靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)，并由此生成其它連接蛋白的比較模型。為了制備用于分子耦接的蛋白，首先完成了由人類連接蛋白26形成的半通道的晶體結(jié)構(gòu)。

比較模型建立在化合物與受N-端螺旋(NTH)結(jié)構(gòu)域限制的口袋結(jié)合的假說(shuō)上，即是化合物對(duì)由N-端螺旋(NTH)結(jié)構(gòu)域、原體的螺旋結(jié)構(gòu)TM1和TM2的跨膜片段和相鄰原體的螺旋結(jié)構(gòu)TM1的跨膜片段的結(jié)合，阻止了會(huì)引起由連接蛋白形成的半通道的開(kāi)啟/激活的必要構(gòu)象變化。

采用程序Modeller v9.2(Sali,1995)生成了由人類連接蛋白26或者43形成的總共500個(gè)半通道模型，并且根據(jù)內(nèi)部DOPE評(píng)分篩選最好模型用于進(jìn)一步分析和優(yōu)化。通過(guò)采用在網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SAVES(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES)上可獲得的工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。

在模擬篩選程序之前，采用FILTER v2.1(OpenEye Scientific Software,Santa Fe,NM)程序，對(duì)化學(xué)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)OpenNCI進(jìn)行過(guò)濾，以便消除鹽和反離子，并且然后通過(guò)OMEGA v2.4.6(OpenEye Scientific Software,Santa Fe,NM)程序?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)橥任?，由此提供大約195000種化合物和異構(gòu)體。，在由連接蛋白26形成的半通道的修飾的修飾的晶體結(jié)構(gòu)和由連接蛋白43形成的半通道模型中，采用程序FRED v2.2.5(OpenEye Scientific Software,Santa Fe,NM)對(duì)他們執(zhí)行全面分子耦合協(xié)議。采用FRED受體程序鑒定和制備由連接蛋白26形成的半通道的結(jié)合位點(diǎn)和由連接蛋白43形成的半通道的模型。

采用由人類連接蛋白26組成的半通道結(jié)構(gòu)和由人類連接蛋白43形成的半通道模型實(shí)施模擬篩選過(guò)程以便鑒定潛在的由連接蛋白形成的半通道的調(diào)節(jié)劑，所述由人類連接蛋白43形成的模型是通過(guò)采用人類連接蛋白26的結(jié)構(gòu)作為樣式，比較建模發(fā)展而來(lái)。

采用Chemgauss3打分功能獲得、優(yōu)化在受體位點(diǎn)(100)的候選配體結(jié)合模型。使用PLP、Chemscore和Chemgauss3的評(píng)價(jià)功能，通過(guò)一致性打分獲得用于綜合分子耦合程序和優(yōu)化的結(jié)合模型的一致性結(jié)構(gòu)。最后，采用force field CHARMm22en DiscoveryStudio v2.1(Accelrys Inc.,San Diego)，對(duì)分類最好的1000種化合物的結(jié)合模型進(jìn)行最小化。

該協(xié)議使用共軛梯度算法，允許從所有耦合的配體的質(zhì)量中心將內(nèi)殘基的側(cè)鏈最小化，直到能量梯度的均方根(RMS)的收斂標(biāo)準(zhǔn)為0,001kcal/mol。

采用PLP,LigScore,PMF and LUDI評(píng)價(jià)功能，評(píng)價(jià)獲得的每個(gè)復(fù)合物的結(jié)合能量。采用Discovery Studio v2.1中可利用的一致性評(píng)分協(xié)議，對(duì)具有抑制潛力的化合物進(jìn)行最終鑒定，。從這個(gè)新的分類，對(duì)結(jié)果進(jìn)行目測(cè)觀察，發(fā)現(xiàn)100個(gè)最優(yōu)結(jié)果的化合物，且在對(duì)由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道顯示最優(yōu)親和力的組中選出40種化合物。

基于在半通道表達(dá)有缺陷并轉(zhuǎn)染了不同連接蛋白的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，以便評(píng)估和/或確認(rèn)它們的通過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)能力。評(píng)價(jià)滲透示蹤分子的運(yùn)輸，并與已知的由連接蛋白形成的通道的抑制劑(諸如β甘草次酸(BGA)和生胃酮(CBX))相比較。

在沒(méi)有二價(jià)陽(yáng)離子的胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以便增加由連接蛋白形成的半通道的開(kāi)啟概率。此外，用panexine 1轉(zhuǎn)染不表達(dá)半通道的親本細(xì)胞，且機(jī)械刺激以誘導(dǎo)由panexine 1形成的半通道的開(kāi)啟，作為陰性對(duì)照。

通過(guò)其在由panexine 1形成的半通道上的作用，評(píng)估抑制由連接蛋白形成的半通道的分子被。利用對(duì)染料的耦合技術(shù)和通過(guò)雙電壓固定的電生理學(xué)，將在納摩爾范圍內(nèi)抑制由連接蛋白形成的半通道的分子作為細(xì)胞內(nèi)結(jié)合通道可能的抑制劑進(jìn)行研究。

分子應(yīng)該在毫摩爾范圍內(nèi)不抑制由連接蛋白形成的細(xì)胞間通道，并且不影響由panexine 1形成的半通道，其抑制采用全細(xì)胞模型中電壓固定方法的由連接蛋白形成的半通道的電流的作用。本發(fā)明提供了新的抑制由連接蛋白26和/或43形成的半通道的化合物。

本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)由連接蛋白形成的半通道具有抑制潛力的化合物的鑒定方法，其中針對(duì)對(duì)應(yīng)于由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道的晶體結(jié)構(gòu)或者比較模型，采用了配體模擬篩選方法。所述方法特征在于評(píng)價(jià)化合物對(duì)應(yīng)于連接蛋白26中的殘基3-10(NTH)、29-40(TM1)、74-93(TM2)和鄰近原體中的殘基29-40(TM1)的片段或者其它連接蛋白中的等同殘基的片段的殘基，在結(jié)合位點(diǎn)處的相互作用能。

本發(fā)明的方法可以檢測(cè)被鑒定為能抑制由缺乏二價(jià)陽(yáng)離子的胞外培養(yǎng)基或向細(xì)胞膜施加正電壓所誘導(dǎo)的由連接蛋白形成的半通道的開(kāi)啟/激活的化合物，由此避免半通道的開(kāi)啟的機(jī)制的依賴。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為了提供一種藥物組合物，其包有效治療量的根據(jù)本發(fā)明鑒定的的由連接蛋白形成的半通道的一個(gè)或多個(gè)特異性抑制劑的化合物，所述化合物會(huì)進(jìn)入待治療細(xì)胞的作用位點(diǎn)。所述藥物組合物包括至少本發(fā)明的一種化合物，優(yōu)選包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是由連接蛋白形成的半通道的一種或多種調(diào)節(jié)劑在制備用于治療或者預(yù)防與由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道的過(guò)度激活相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述由連接蛋白形成的半通道的調(diào)節(jié)劑會(huì)到達(dá)所述細(xì)胞中的所述作用位點(diǎn)。

本發(fā)明下所獲得的化合物能夠被用于制備用于預(yù)防和/或治療炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)，疼痛治療，骨骼肌去神經(jīng)支配，肌營(yíng)養(yǎng)不良，脊髓損傷和以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特征的遺傳疾病，其中所述組合物包括治療有效量的一種或多種試劑，所述試劑在待處理細(xì)胞中抑制由連接蛋白形成的半通道的開(kāi)啟/激活。

通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的化合物僅阻斷半通道，而不阻斷由連接蛋白形成的細(xì)胞內(nèi)通道或者由panexine 1形成的半通道。抑制由連接蛋白形成的半通道的所述新化合物直接結(jié)合至半通道，并相較于現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述的化合物具有更好的親和性和強(qiáng)度。

簡(jiǎn)言之，獲得根據(jù)本發(fā)明的特異性抑制連接蛋白半通道的化合物的方法包括下述步驟：

·生成并驗(yàn)證討論中的由連接蛋白形成的半通道的比較模型；

·分析結(jié)構(gòu)并定義連接蛋白的相互作用位點(diǎn)作為參考；

·以三維形式產(chǎn)生化學(xué)化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括每個(gè)化合物的部分載荷和最佳幾何形狀，消除鹽和反離子；

·進(jìn)行模擬篩選以便鑒定由連接蛋白形成的半通道的抑制劑；

·基于能量功能篩選由連接蛋白形成的半通道的阻斷化合物，所述能量功能可以評(píng)估各化合物對(duì)連接蛋白的相對(duì)親和力作為參考；評(píng)估所述化合物對(duì)半通道表達(dá)缺陷并被不同連接蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)能力作為參考；確定所鑒定的化合物會(huì)抑制受胞外二價(jià)陽(yáng)離子缺乏誘導(dǎo)的或者通過(guò)向細(xì)胞膜施加正電壓誘導(dǎo)的由連接蛋白形成的半通道的開(kāi)啟/激活；以及

·根據(jù)它們對(duì)半通道的作用，對(duì)抑制由連接蛋白形成的半通道的分子進(jìn)行分類。

藥物組合物

藥物制劑可以以單位劑量的形式方便地提供，而且它們可以通過(guò)藥物領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行制備。所有方法包括將有效成分或成分與載體接觸。一般地，所述制劑被制備為將有效成分與以統(tǒng)一方式完好分開(kāi)的液體載體或固體載體接觸，且然后，如果需要，根據(jù)需要的配方形成產(chǎn)品。

本發(fā)明的用于口服給藥的適當(dāng)制劑可以表示為膠囊或者片劑(其中它們中的每一個(gè)包含預(yù)定量的活性成分)；粉末或者顆粒；溶液或水液體的懸浮液或者非水液體的懸浮液；或者水包油液體乳液或油包水液體乳液。所述活性成分同樣可以注射劑，混有蜂蜜的藥用粉末、糖漿或者厚藥膏的形式提供。

糖漿制劑一般將存在于以液體為載體的化合物或其鹽的懸浮液或溶液中。典型的皮膚和經(jīng)皮給藥的制劑包括常規(guī)水性或非水性載體，例如乳霜、軟膏、洗液或者厚軟膏，或者它們是藥膏、貼劑或膜的形式。

實(shí)施例

實(shí)施例1：

阻斷由連接蛋白(26或43)形成的半通道的開(kāi)啟/激活的體外測(cè)試.

利用連接蛋白26或42轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞進(jìn)行體外測(cè)試，測(cè)試不同示蹤分子的能力，以評(píng)估化合物降低這些分子運(yùn)輸作用的能力。

表1：對(duì)5μM濃度的滲透示蹤物的抑制率

體外最有效抑制劑為例4，其具有20nM的IC₅₀和100％有效性，緊接著為例5，其具有50nM的IC₅₀和100％有效性.

作為參照，采用生胃酮或甘草次酸(CBX，ABG)作為對(duì)照，其是廣泛應(yīng)用的連接蛋白阻斷劑，顯示出100nM的IC₅₀和100％有效性。

因此，本發(fā)明的抑制劑在體外顯示出適當(dāng)?shù)倪B接蛋白26和43的半通道的開(kāi)啟/激活的阻斷活性。

實(shí)施例2：由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道的活性的阻斷化合物的應(yīng)用。

所述方法包括把由連接蛋白26或43形成的半通道選擇性或特異性地與至少兩種以下化合物的治療有效量(在納摩爾范圍中)接觸：

A：(R)-2-(4-氯苯芬基)-2-氧代-1-糠基乙基喹啉-2-羧酸乙酯，

B：(4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)丙烷，

C：乙酸2,2-雙([1,1'-聯(lián)苯]-4-基)酸，

D：(2R，5S，8R，9S，10S，13S，14S，17S)-2-氟-10,13-二甲基-3-氧代十六氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]芴(fenantren)-17-苯甲酸乙酯，

E：(3S，5S，8R，9S，10S，13S，14S，17S)-3-乙酰氧基-10,13-二甲基十六氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]芴(fenantren)-17-環(huán)己烷羧酸酯，F(xiàn)：(3S，8R，9S，10R，13S，14S，17R)-17-乙炔基-17-羥基-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13，14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)庚三烯并[a]芴(fenantren)-3-基3-環(huán)己基丙酸酯(ciclohexilpropanoate)

G：雙(4-甲基-2-嗎啉喹啉-6-基)甲烷

A和D的結(jié)果最優(yōu)，因?yàn)樗鼈兂蔀橛蛇B接蛋白形成的半通道的強(qiáng)有力抑制劑，而且它們不影響間隙連接通道或者由panexin形成的半通道。

實(shí)施例3：生物評(píng)價(jià)

采用用連接蛋白26或43轉(zhuǎn)染的小鼠HeLa細(xì)胞。為了評(píng)價(jià)針對(duì)連接蛋白半通道的每個(gè)化合物的活性，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)前24h，將10³個(gè)用連接蛋白轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞接種在多孔(90)板的孔中。然后，用含有正常水平的二價(jià)陽(yáng)離子(Ca²⁺and Mg²⁺)的洛克(locke)溶液或者不含二價(jià)陽(yáng)離子的洛克(locke)溶液中清洗細(xì)胞，所述locke溶液還含有5μm溴化乙錠。同時(shí)，采用不同濃度的每種候選化合物處理細(xì)胞并孵育5分鐘。

如圖表2所示，將用連接蛋白43(Cx43)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞接種在多孔(96)板中，并在24h后，在存在或者不存在討論的化合物的情況下，評(píng)價(jià)無(wú)陽(yáng)離子溶液(DCFS)中的乙啶攝取。通過(guò)熒光計(jì)測(cè)量激發(fā)的熒光來(lái)評(píng)價(jià)乙啶攝取。如果抑制劑存在的情況下，熒光值等于或者接近用含有二價(jià)陽(yáng)離子溶液孵育的細(xì)胞中所測(cè)量的熒光值，則所述化合物對(duì)應(yīng)于由連接蛋白形成的半通道的抑制劑。相反，如果由暴露于DCFS中的可能的抑制劑的細(xì)胞發(fā)出的熒光值，等于僅由DCFS(沒(méi)有討論中的化合物)孵育的細(xì)胞的熒光值，則所述化合物不是由連接蛋白形成的半通道的抑制劑。采用不同濃度的每種化合物進(jìn)行相同的試驗(yàn)以便確定最小的有效濃度(EC₅₀)。

在至少40個(gè)細(xì)胞中浸泡在對(duì)照培養(yǎng)基中，接著是DCFS，施用10nM抑制分子(R)-2-(4-氯苯腈)-2-氧代-1-糠基噻吩并喹啉-2-羧酸酯(化合物4或抑制分子)，用DCFS洗滌，然后新應(yīng)用10nM抑制分子(MX)。

在圖3中，左上面板(A)對(duì)應(yīng)于顯微圖像，其中可以注意到HeLa細(xì)胞所表達(dá)的結(jié)合有綠色熒光蛋白(EGFP)的連接蛋白43出現(xiàn)在顯微視野中。在右側(cè)，所示熒光顯示視野中所有細(xì)胞均表達(dá)連接蛋白43。底部左側(cè)面板顯示基線條件(胞外培養(yǎng)基中存在Ca²⁺)處的乙啶攝取，且底部右側(cè)面板示出了用一種沒(méi)有二價(jià)陽(yáng)離子的溶液(DCFS)替換胞外溶液，5分鐘以后的乙啶攝取，所述DCFS能增加半通道的活性。圖表(B)用任意單位(AU)的“上染率”表示半通道的活性，、在至少40個(gè)孵育在DCFS的對(duì)照培養(yǎng)基的細(xì)胞中，應(yīng)用10nM抑制分子(R)-2-(4-氯苯芬基(4-chlorofenil))-2-氧代-1-糠基乙基喹啉(fenilethlyquinoline)-2-羧酸乙酯(化合物4或抑制分子)，用DCFS清洗，接著應(yīng)用10nM新的抑制分子(MX)。很明顯，采用上染率評(píng)價(jià)所述抑制分子的抑制半通道的活性。面板(C)示出乙啶每分鐘的攝取速度或速率被抑制分子完全抑制，且其效果被DCFS清洗部分逆轉(zhuǎn)。

在用不含鈣離子(或Ca²⁺)的堿性溶液孵育HeLa細(xì)胞中，由連接蛋白43形成的半通道的單位電流非常頻繁(參見(jiàn)圖4，兩個(gè)上部示蹤圖)。但是，10nM化合物4(抑制分子)的應(yīng)用強(qiáng)烈地抑制了由連接分子43形成的半通道的活性(兩個(gè)底部示蹤圖1和3)。

圖5描繪了用連接蛋白26轉(zhuǎn)染的細(xì)胞很好的耦合于間隙連接通道。采用熒光黃微注射評(píng)價(jià)的細(xì)胞的耦接發(fā)生率接近100％(黑色框)。其還顯示了添加1nM化合物4沒(méi)有顯著降低耦合率(白色框)，表明由連接蛋白26形成的間隙連接通道的功能狀態(tài)沒(méi)有被影響。

圖6表明應(yīng)用1nM化合物4(抑制分子)沒(méi)有抑制間隙連接通道介導(dǎo)的細(xì)胞耦合，而其它被評(píng)價(jià)的化合物完全或者部分抑制由連接蛋白43形成的間隙連接通道。

被機(jī)械應(yīng)力激活的由panexine 1(Panx1，圖7)形成的半通道的功能狀態(tài)沒(méi)有被100nM化合物4的應(yīng)用所抑制，但是其被5μm生胃酮完全阻斷。結(jié)果表明納摩爾范圍濃度的化合物4抑制由連接蛋白形成的半通道，且不抑制由panexine 1形成的那些半通道，且還表明所述化合物沒(méi)有抑制由連接蛋白形成的間隙連接通道。因此，所述化合物是由高度特異性連接蛋白形成的半通道的抑制劑。

參考文獻(xiàn)

Bodendiek,S.B.and G.Raman(2010)."Connexin modulators and their potential targets under the magnifying glass."Curr Med Chem 17(34):4191-4230.

Chandrasekhar,A.and A.K.Bera(2012)."Hemichannels:permeants and their effect on development,physiology and death."Cell Biochemistry and Function 30(2):89-100.

Juszczak,G.R.and A.H.Swiergiel(2009)."Properties of gap junction blockers and their behavioural,cognitive and electrophysiological effects:animal and human studies."Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 33(2):181-198.

Saez,J.C.,V.M.Berthoud,M.C.Branes,A.D.Martinez and E.C.Beyer(2003)."Plasma membrane channels formed by connexins:their regulation and functions."Physiol Rev 83(4):1359-1400.

Saez,J.C.,K.A.Schalper,M.A.Retamal,J.A.Orellana,K.F.Shoji and M.V.Bennett(2010)."Cell membrane permeabilization via connexin hemichannels in living and dying cells."Exp Cell Res 316(15):2377-2389.

Spray,D.C.,R.Rozental and M.Srinivas(2002)."Prospects for rational development of pharmacological gap junction channel blockers."Curr DrugTargets 3(6):455-464.

Verselis,V.K.and M.Srinivas(2013)."Connexin channel modulators and their mechanisms of action."Neuropharmacology 75(0):517-524.

Wang,N.,M.De Bock,E.Decrock,M.Bol,A.Gadicherla,M.Vinken,V.Rogiers,F.F.Bukauskas,G.Bultynck and L.Leybaert(2012)."Paracrine signaling through plasma membrane hemichannels."Biochim Biophys Acta.