两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

帶有DARPin的雙特異性嵌合蛋白的制作方法

文檔序號:3495696閱讀:1677來源:國知局
帶有DARPin的雙特異性嵌合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雙特異性嵌合蛋白,其包括經(jīng)設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin),以及與所述DARPin相連的IgG抗體,scFv-Fc抗體片段,或其組合;用其治療或預(yù)防癌癥的方法,以及相關(guān)的方法和組合物。KCLRF-BP-002202009.10.06
【專利說明】帶有DARPin的雙特異性嵌合蛋白
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本文涉及含有經(jīng)設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)的雙特異性嵌合蛋白,以及相 關(guān)的方法和組合物。
[0004] 2.相關(guān)技術(shù)的描述
[0005] 在活細胞中,各種蛋白彼此相互作用,參與各種致病機制。如果有至少兩種這樣的 致病蛋白被同時抑制,相比于僅有單一蛋白被抑制的情況而言,就有更大的可能性來治療 和預(yù)防疾病。為此,研發(fā)了多種能抑制至少兩種蛋白的抗體。
[0006] 盡管研發(fā)出數(shù)種雙特異性抗體,其中大多數(shù)不能在商業(yè)上用作抗體藥物,因為它 們的療效未經(jīng)臨床驗證或者觀察到了多種副作用。此外,所研發(fā)的雙特異性抗體在穩(wěn)定性 和產(chǎn)量方面有不足,這對于商業(yè)應(yīng)用而言也是障礙。早期研發(fā)的具有IgG形式的雙特異性 抗體難以分離和純化,因為在生產(chǎn)過程中輕鏈和重鏈隨機組合,導(dǎo)致大規(guī)模生產(chǎn)中的諸多 問題。而且,在非IgG的雙特異性抗體的情形中,與蛋白折疊、藥效學(xué)等無關(guān)的作為藥物的 穩(wěn)定性也沒有得到驗證。
[0007] 因此,需要研發(fā)在活體內(nèi)穩(wěn)定性增強、且作為藥物有改進特性的雙特異性抗體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本申請?zhí)峁┝穗p特異性嵌合蛋白(雙特異性抗體偶聯(lián)物),其包括抗體(例如IgG 抗體)和/或抗體片段(例如ScFv-Fc抗體片段)、以及與其相連的經(jīng)設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋 白(DARPin),本發(fā)明還提供了包含所述抗體和可藥用載體的藥物組合物。所述的雙特異性 嵌合蛋白或雙特異性抗體偶聯(lián)物可以用作雙特異性抗體。
[0009] 本申請還提供了制備所述雙特異性嵌合蛋白的方法,其通過將DARPin與抗體(例 如IgG抗體)和/或抗體片段(例如ScFv-Fc抗體片段)相連來實現(xiàn),或通過在細胞中表 達編碼所述雙特異性嵌合蛋白的核酸來實現(xiàn)。
[0010] 本申請還提供了用于治療或預(yù)防癌癥的所述雙特異性嵌合蛋白,或者所述雙特異 性嵌合蛋白在治療或預(yù)防癌癥方面的用途。
[0011] 此外,本申請還提供了用于增強雙特異性嵌合蛋白的抗癌效力的DARPin,或者 DARPin用于增強雙特異性嵌合蛋白的抗癌效力的用途,是與未連接DARPin的抗體或抗體 片段相比。
[0012] 本申請還提供了相關(guān)的組合物和方法,可以從下文的詳述中更清楚地了解。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1圖示了根據(jù)一個實施方案用抗EGFRDARPin制備多種雙特異性抗體偶聯(lián)物的 過程。
[0014] 圖2圖示了根據(jù)一個實施方案用抗EGFRDARPin制備多種雙特異性抗體偶聯(lián)物的 過程。
[0015] 圖3圖示了根據(jù)一個實施方案制備抗c-Met/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0016] 圖4圖示了根據(jù)一個實施方案的抗C-Met/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白在溶液中展 示的穩(wěn)定性特性。
[0017] 圖5圖示了根據(jù)一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白與EGF在 競爭性ELISA試驗中的競爭。
[0018] 圖6圖示了根據(jù)一個實施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白在A431 細胞中抑制EGFR磷酸化的程度。
[0019] 圖7圖示了根據(jù)一個實施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對SNU5 細胞增殖的抑制程度。
[0020] 圖8圖示了根據(jù)一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對MKN45 細胞增殖的抑制程度。
[0021] 圖9圖示了根據(jù)一個實施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對H1993 細胞增殖的抑制程度。
[0022] 圖10圖示了根據(jù)一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對A431 細胞增殖的抑制程度。
[0023] 圖11的熒光圖像顯示了根據(jù)一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合 蛋白對c-Met和EGFR的內(nèi)在化。
[0024] 圖12圖示了根據(jù)一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的 c-Met(上圖)和EGFR(下圖)表達量。
[0025] 圖13圖示了根據(jù)一個實施方案制備抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0026] 圖14圖示了根據(jù)一個實施方案的抗HER2/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白展示的穩(wěn)定 性特性。
[0027] 圖15圖示了根據(jù)一個實施方案的抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對MKN45 細胞增殖的抑制程度。
[0028] 圖16的熒光圖像顯示了根據(jù)一個實施方案的抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋 白對HER2和EGFR的內(nèi)在化。
[0029] 圖17圖示了根據(jù)一個實施方案制備抗HER3/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0030] 圖18圖示了根據(jù)一個實施方案的抗HER3/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白展示的穩(wěn)定 性特性
[0031] 圖19圖示了根據(jù)一個實施方案制備抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin雙特異 性嵌合蛋白的過程。
[0032] 圖20圖示了根據(jù)一個實施方案的抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin雙特異性 嵌合蛋白展示的穩(wěn)定性特性。
[0033] 圖2IA至2IG展示了各種DARPin的核苷酸序列。

【具體實施方式】
[0034] 已研發(fā)出多種類型和形式的雙特異性抗體,且由于這些抗體結(jié)合至少兩種抗原的 能力,可預(yù)期其與早已存在的單克隆抗體相比具有出色的治療效果。本文通過將DARPin與 IgG抗體或其片段結(jié)合提供了雙特異性嵌合蛋白。
[0035] DARPin(經(jīng)設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白;見第5章"DesignedAnkyrinRepeat Proteins(DARPins):FromResearchtoTherapy",MethodsinEnzymology,vol503:101~ 134(2012)^"EfficientSelectionofDARPinswithSub-nanomolarAffinitiesusing SRPPhageDisplay",J.Mol.Biol. (2008) 382, 1211-1227,其全部公開內(nèi)容引入本文作為 參考)是指具有對靶蛋白的高特異性和高結(jié)合親和力的抗體模擬蛋白,其通過基因工程制 備。DARPin起源于天然的錨蛋白,且具有包含至少2個錨蛋白重復(fù)基元(例如,包含至少 3、4或5個錨蛋白重復(fù)基元)的結(jié)構(gòu)。根據(jù)重復(fù)基元的數(shù)量,DARPin可具有任何適宜的分 子量。例如,包含3、4、或5個錨蛋白重復(fù)基元的DARPin可分別具有約10kDa、約14kDa、或 約18kDa的分子量。
[0036] DARPin包括提供結(jié)構(gòu)的核心部分和位于該核心外且結(jié)合靶標的靶結(jié)合部分。該結(jié) 構(gòu)性核心包括保守的氨基酸序列而該靶結(jié)合部分包括根據(jù)靶標而相區(qū)別的氨基酸序列。
[0037] 下表中總結(jié)了DARPin的實例且圖21A-21G圖釋了其核苷酸序列:
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種雙特異性嵌合蛋白,包含: 設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin),和 與DARPin連接的IgG抗體、scFv-Fc抗體片段、或其組合。
2. 依照權(quán)利要求1的雙特異性嵌合蛋白,其中所述DARPin是抗EGFR DARPin。
3. 依照權(quán)利要求1的雙特異性嵌合蛋白,包含: 抗 EGFR DARPin,和 與所述DARPin連接的抗c-Met IgG抗體、抗c-Met scFv-Fc抗體片段、或其組合。
4. 依照權(quán)利要求2或3的雙特異性嵌合蛋白,其中所述抗EGFR DARPin包含SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、或 SEQ ID NO: 112 的一種或多種,任選地,其中任 一種重復(fù)2至10次。
5. 依照權(quán)利要求3或4的特異性嵌合蛋白,其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含: 選自下組的至少一種重鏈互補決定區(qū)(⑶R):(a)⑶R-H1,其包含SEQ ID N0:4的氨基 酸序列;(b)CDR_H2,其包含,SEQ ID NO:5的氨基酸序列,SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或具 有SEQ ID N0:2的8-19個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID N0:2第3位到第10位氨基酸殘基的 氨基酸序列;和(c)CDR_H3,其包含,SEQ ID N0:6的氨基酸序列,SEQ ID N0:85的氨基酸序 列,或具有SEQ ID NO: 85的6-13個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸殘基的氨基酸序列; 選自下組的至少一種輕鏈互補決定區(qū):(a)⑶R-L1,包含SEQ ID N0:7的氨基酸序列, 〇3)0?-12,包含5£〇10勵:8的氨基酸序列,和((3)0)1?-13,其包含,5£〇10勵:9的氨基酸 序列,SEQ ID NO: 86的氨基酸序列,或具有SEQ ID NO: 89的9-17個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID N0:89第1位到第9位氨基酸殘基的氨基酸序列;或者所述至少一種重鏈互補決定區(qū)和 所述至少一種輕鏈互補決定區(qū)的組合。
6. 依照權(quán)利要求5的雙特異性嵌合蛋白,其中 所述〇?-111包含5£0 10勵:1、5£0 10勵:22、5£0 10勵:23、或5£0 10勵:24的氨 基酸序列, 所述〇?-112包含5£0 10勵:2、5£0 10勵:25、或5£0 10勵:26的氨基酸序列, 所述〇?-113包含5£0 10勵:3、5£0 10勵:27、5£0 10勵:28、或5£0 10勵:85的氨 基酸序列;和 所述 CDR-L1 包含 SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、或 SEQ ID NO:106 的氨基酸序列, 所述〇?-12包含5£0 10勵:11、5£0 10勵:34、5£0 10勵:35、或5£0 10勵:36的氨 基酸序列,和 所述 CDR-L3 包含 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO:86、或 SEQ ID NO:89 的氨基酸序列。
7. 依照權(quán)利要求5的雙特異性嵌合蛋白,其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含: 重鏈,包含以下:SEQ ID N0:62的氨基酸序列,從SEQ ID N0:62的第18位至第462位 的氨基酸序列,SEQ ID N0:64的氨基酸序列,從SEQ ID N0:64的第18位至第461位的氨 基酸序列,SEQ ID N0:66的氨基酸序列,或從SEQ ID N0:66的第18位至第460位的氨基 酸序列;和 輕鏈,包含以下:SEQ ID N0:68的氨基酸序列,從SEQ ID N0:68的第21位至第240位 的氨基酸序列,SEQ ID NO:70的氨基酸序列,從SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨 基酸序列,或SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。
8. -種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物,其包含權(quán)利要求2至7中任一項的雙特異 性嵌合蛋白。
9. 一種制備雙特異性嵌合蛋白的方法,包括: 將i)DARPin和ii) IgG抗體、scFv-Fc抗體片段或其組合連接;或 在細胞中表達編碼所述雙特異性嵌合蛋白的核酸。 10?權(quán)利要求 9 的方法,其中所述 DARPin 包含 SEQ ID N0:109、SEQ ID N0:110、SEQ ID NO: 111、或SEQ ID NO: 112的一種或多種,任選地,其中任一種重復(fù)2至10次。
11. 權(quán)利要求9或10的方法,其中所述抗體或抗體片段是抗c-Met抗體或其抗體片段。
12. 權(quán)利要求11的方法,其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含: 選自下組的至少一種重鏈互補決定區(qū)(⑶R):(a)⑶R-H1,包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列;(b)CDR-H2,其包含,SEQ ID N0:5的氨基酸序列,SEQ ID N0:2的氨基酸序列,或具有 SEQ ID NO: 2的8-19個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO: 2第3位到第10位氨基酸殘基的氨 基酸序列;和(c)⑶R-H3,其包含,SEQ ID NO:6的氨基酸序列,SEQ ID NO:85的氨基酸序 列,或具有SEQ ID NO: 85的6-13個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸殘基的氨基酸序列; 選自下組的至少一種輕鏈互補決定區(qū):(a)⑶R-L1,包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列, 〇3)0?-12,包含5£〇10勵:8的氨基酸序列,和((3)0)1?-13,其包含,5£〇10勵:9的氨基酸 序列,SEQ ID NO: 86的氨基酸序列,或具有SEQ ID NO: 89的9-17個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO:89第1位到第9位氨基酸殘基的氨基酸序列;或 所述至少一種重鏈互補決定區(qū)和所述至少一種輕鏈互補決定區(qū)的組合。
13. 權(quán)利要求11或12的方法,其中所述雙特異性嵌合蛋白的抗癌功效相比于沒有所述 DARPin與其連接的所述抗c-Met抗體或抗體片段增強。
14. 編碼權(quán)利要求1至7中任一項的雙特異性嵌合蛋白的核酸,任選地在載體中。
15. 包含權(quán)利要求14的核酸的細胞。
【文檔編號】C07K19/00GK104341529SQ201410363385
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】鄭光鎬, 李承炫, 高榮晙, 金罠京, 黃載雄, 趙美英, 李政昱, 林柏瑋 申請人:三星電子株式會社
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
亚洲精华国产精华精| 色94色欧美一区二区| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美精品av麻豆av| 国产精品 国内视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 在线观看一区二区三区激情| 制服诱惑二区| 国产精品国产三级国产专区5o| 91大片在线观看| 午夜免费成人在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区二区三区av在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品在线美女| 久久 成人 亚洲| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲国产欧美网| 久9热在线精品视频| 美女中出高潮动态图| 欧美中文综合在线视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美国产精品一级二级三级| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产精品国产三级国产专区5o| 桃花免费在线播放| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品一区在线观看国产| 91av网站免费观看| 亚洲成人免费av在线播放| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 人妻一区二区av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 波多野结衣一区麻豆| 青春草视频在线免费观看| 在线观看免费高清a一片| 久久这里只有精品19| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 麻豆乱淫一区二区| a在线观看视频网站| 久久久精品区二区三区| 黄片播放在线免费| e午夜精品久久久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产日韩欧美在线精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 韩国精品一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 两性夫妻黄色片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一级毛片精品| 各种免费的搞黄视频| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜福利在线观看吧| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 女警被强在线播放| 日本欧美视频一区| 老司机亚洲免费影院| 午夜两性在线视频| 最黄视频免费看| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 真人做人爱边吃奶动态| 男女免费视频国产| 精品亚洲成a人片在线观看| 午夜福利在线观看吧| 丁香六月天网| 国产1区2区3区精品| 久久99一区二区三区| av天堂在线播放| 欧美乱码精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 日本黄色日本黄色录像| 三上悠亚av全集在线观看| 精品国产国语对白av| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品免费久久久久久久清纯 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 丝袜脚勾引网站| 精品国产一区二区久久| 久久中文字幕一级| 久久av网站| av在线app专区| 制服人妻中文乱码| 色婷婷av一区二区三区视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 99国产综合亚洲精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 丝袜脚勾引网站| 99久久人妻综合| 丝袜喷水一区| 日韩视频在线欧美| 午夜激情久久久久久久| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品偷伦视频观看了| 最黄视频免费看| 色综合欧美亚洲国产小说| 一级毛片电影观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产成人a∨麻豆精品| 9191精品国产免费久久| 欧美乱码精品一区二区三区| 99热全是精品| 亚洲第一av免费看| 日本黄色日本黄色录像| 欧美在线一区亚洲| 午夜老司机福利片| 狂野欧美激情性xxxx| 夫妻午夜视频| 久久久久久久精品精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产色视频综合| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 十八禁网站网址无遮挡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲视频免费观看视频| 国产av精品麻豆| 欧美xxⅹ黑人| 国产亚洲欧美在线一区二区| 大陆偷拍与自拍| 天天添夜夜摸| 欧美激情高清一区二区三区| 一区二区三区精品91| 黄片大片在线免费观看| 午夜老司机福利片| 高清av免费在线| 亚洲 欧美一区二区三区| netflix在线观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 男人爽女人下面视频在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久久久国产电影| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 人妻 亚洲 视频| 国产精品二区激情视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 大香蕉久久网| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产xxxxx性猛交| av在线老鸭窝| 两个人免费观看高清视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| tube8黄色片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 新久久久久国产一级毛片| 国产又爽黄色视频| 在线观看免费视频网站a站| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲av电影在线进入| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 日日夜夜操网爽| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男女边摸边吃奶| 国产精品 国内视频| 亚洲人成77777在线视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 极品少妇高潮喷水抽搐| av欧美777| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 五月开心婷婷网| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 不卡一级毛片| 999久久久精品免费观看国产| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 黄色视频在线播放观看不卡| 丝袜在线中文字幕| 亚洲欧美色中文字幕在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品影院久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 老司机靠b影院| 久久久久久久国产电影| 午夜影院在线不卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 亚洲人成电影免费在线| 欧美日韩一级在线毛片| 在线av久久热| 中文字幕最新亚洲高清| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜免费成人在线视频| 国产精品二区激情视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久国产精品麻豆| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产男女超爽视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 1024视频免费在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 操美女的视频在线观看| 国产麻豆69| 国产麻豆69| 制服诱惑二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产一级毛片在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美中文综合在线视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产又色又爽无遮挡免| 天天影视国产精品| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲专区国产一区二区| 国产视频一区二区在线看| 99国产精品一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 一区二区三区乱码不卡18| 91老司机精品| 少妇的丰满在线观看| 麻豆国产av国片精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲视频免费观看视频| a级片在线免费高清观看视频| 日本五十路高清| 999精品在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 国产视频一区二区在线看| 97精品久久久久久久久久精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 岛国在线观看网站| 热99国产精品久久久久久7| 99国产精品一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 国产精品99久久99久久久不卡| 五月天丁香电影| 久热爱精品视频在线9| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一级黄色大片毛片| 三上悠亚av全集在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 午夜免费成人在线视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲 欧美一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 欧美性长视频在线观看| 欧美成人午夜精品| av在线app专区| 啦啦啦免费观看视频1| 1024香蕉在线观看| 国产欧美亚洲国产| 成年美女黄网站色视频大全免费| 1024视频免费在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 成人三级做爰电影| 在线观看舔阴道视频| 97精品久久久久久久久久精品| 成人av一区二区三区在线看 | 在线 av 中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 制服人妻中文乱码| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 动漫黄色视频在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av天堂在线播放| 午夜影院在线不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲 欧美一区二区三区| 99九九在线精品视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 人妻 亚洲 视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 91av网站免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 中亚洲国语对白在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久久久国内视频| 满18在线观看网站| 男女边摸边吃奶| 亚洲天堂av无毛| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美中文综合在线视频| 亚洲精品乱久久久久久| 国产区一区二久久| 国产人伦9x9x在线观看| 久久青草综合色| 色播在线永久视频| 国产1区2区3区精品| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜免费鲁丝| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 涩涩av久久男人的天堂| 精品人妻在线不人妻| 精品国产一区二区三区四区第35| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 香蕉国产在线看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 99久久综合免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 嫩草影视91久久| 丝袜在线中文字幕| 九色亚洲精品在线播放| 欧美日韩av久久| 成年人午夜在线观看视频| www日本在线高清视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 狠狠狠狠99中文字幕| 精品福利永久在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久视频综合| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲专区字幕在线| 久久久久久人人人人人| 精品一区二区三卡| 人妻 亚洲 视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲七黄色美女视频| 大香蕉久久成人网| www.熟女人妻精品国产| 国产97色在线日韩免费| 超碰成人久久| 国产成人系列免费观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 日韩欧美免费精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线永久观看黄色视频| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲av欧美aⅴ国产| 无遮挡黄片免费观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产xxxxx性猛交| 宅男免费午夜| 这个男人来自地球电影免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| av免费在线观看网站| 久久久精品区二区三区| kizo精华| 日本av免费视频播放| 国产成人免费观看mmmm| 大码成人一级视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 岛国在线观看网站| 色老头精品视频在线观看| 在线观看www视频免费| 久久久国产欧美日韩av| 人妻一区二区av| 亚洲欧洲日产国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 多毛熟女@视频| 日韩电影二区| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩视频在线欧美| 欧美一级毛片孕妇| 中国国产av一级| 又紧又爽又黄一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 老司机亚洲免费影院| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜福利视频精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲色图综合在线观看| 国产在线免费精品| 久久99热这里只频精品6学生| 搡老岳熟女国产| 女人精品久久久久毛片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 91字幕亚洲| 精品国产乱码久久久久久小说| 下体分泌物呈黄色| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 看免费av毛片| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲 国产 在线| 99热国产这里只有精品6| av免费在线观看网站| 久久精品成人免费网站| 久久久久网色| 电影成人av| 国产成人免费无遮挡视频| 成人免费观看视频高清| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| avwww免费| 国产一区二区三区av在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 精品国内亚洲2022精品成人 | 看免费av毛片| h视频一区二区三区| 免费av中文字幕在线| 91成人精品电影| 成年女人毛片免费观看观看9 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 色视频在线一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 中文字幕制服av| 一级黄色大片毛片| 超碰97精品在线观看| av在线app专区| 宅男免费午夜| 黄色视频不卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 麻豆国产av国片精品| 日本vs欧美在线观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 免费观看av网站的网址| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久国产一区二区| 男女边摸边吃奶| 操出白浆在线播放| 极品人妻少妇av视频| 国产精品 欧美亚洲| 青青草视频在线视频观看| 精品久久久精品久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日韩欧美国产一区二区入口| 青春草视频在线免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 久久女婷五月综合色啪小说| 51午夜福利影视在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 香蕉国产在线看| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久久久人人人人人| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 看免费av毛片| 亚洲国产精品一区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品国产国语对白av| 欧美黑人欧美精品刺激| 人人妻人人澡人人看| 99久久人妻综合| 一区在线观看完整版| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 俄罗斯特黄特色一大片| 色播在线永久视频| 国产男女超爽视频在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频 | 曰老女人黄片| 青春草视频在线免费观看| av网站在线播放免费| 精品国产一区二区三区四区第35| 91大片在线观看| h视频一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 1024香蕉在线观看| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产看品久久| 久久这里只有精品19| 午夜影院在线不卡| 亚洲国产欧美在线一区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜久久久在线观看| 国产在线观看jvid| 成人国产av品久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 男女之事视频高清在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 伊人亚洲综合成人网| www日本在线高清视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 色播在线永久视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品人妻1区二区| √禁漫天堂资源中文www| 成年动漫av网址| 亚洲精品久久午夜乱码| 成年人免费黄色播放视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲精品粉嫩美女一区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品人妻一区二区三区麻豆| 狂野欧美激情性xxxx| 飞空精品影院首页| av网站在线播放免费| 精品人妻1区二区| 黑人猛操日本美女一级片| 国产欧美亚洲国产| 久久 成人 亚洲| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩一区二区三区影片| 亚洲男人天堂网一区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 中文字幕色久视频| 999久久久国产精品视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 久久天堂一区二区三区四区| 国产区一区二久久| 男人舔女人的私密视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜两性在线视频| 在线天堂中文资源库| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人a∨麻豆精品| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日韩免费高清中文字幕av| 国产在线免费精品| 精品一区二区三区av网在线观看 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 另类亚洲欧美激情| 午夜激情久久久久久久| 欧美成人午夜精品| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久久久久免费视频了| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人精品久久二区二区91| 中国国产av一级| 国产又爽黄色视频| 免费在线观看黄色视频的| 丰满少妇做爰视频| 日韩视频一区二区在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲五月色婷婷综合| 一二三四社区在线视频社区8| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| avwww免费| 一级片'在线观看视频| 日本欧美视频一区| 午夜激情久久久久久久| 免费少妇av软件| 在线观看免费日韩欧美大片| 91九色精品人成在线观看| 国产av精品麻豆| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日韩电影二区| 中文字幕色久视频| 蜜桃国产av成人99| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 少妇的丰满在线观看| videos熟女内射| 桃红色精品国产亚洲av| 黄色视频在线播放观看不卡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日本av手机在线免费观看| 啦啦啦免费观看视频1| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久国内视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 啦啦啦 在线观看视频| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 国产成人系列免费观看| 十分钟在线观看高清视频www| av天堂在线播放| 制服诱惑二区| 999久久久精品免费观看国产| 狠狠狠狠99中文字幕| www日本在线高清视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| www.精华液| 亚洲成人免费av在线播放| 国产麻豆69| 国产日韩欧美视频二区| 嫁个100分男人电影在线观看|