從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素b、e的方法

專利名稱：從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素b、e的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法。
背景技術(shù)：
多粘菌素也稱硫酸粘菌素，英文通用名=Polymyxin BSulfate,分子式 C56H98N16O13H2SO4,分子量1301. 56。多粘菌素是1947年發(fā)現(xiàn)由多粘桿菌(Bacillus polymyxa)所產(chǎn)生，由多種氨基酸 和脂肪酸組成的一族堿性多肽類抗生素的總稱，不同菌種所產(chǎn)生的多粘菌素，由于所含氨 基酸和脂肪酸的不同，又分為多粘菌素A、B、C、D、E、M。多粘菌素B (polymyxin B)又分為 Bl和B2，多粘菌素E (polymyxin E,colistin,)又分為El和E2，多粘菌素M又稱多勝菌素 甲，多粘菌素B和多粘菌素E 二者具有相似的藥理作用，應(yīng)用較廣，多粘菌素B多用于人用 藥，多粘菌素E多用于獸用藥。本品為抗革蘭氏陰性桿菌的抗生素，對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陰性桿菌有較強(qiáng)的抗菌 作用，對(duì)綠膿桿菌的作用更為顯著，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿 菌、產(chǎn)氣桿菌及肺炎桿菌等也有良好的作用。多粘菌素對(duì)生長(zhǎng)繁殖期和靜止期的細(xì)菌都有 效，其殺菌作用機(jī)制是改變細(xì)菌細(xì)胞的滲透性。多肽類抗生素具有表面活性，因其中含有 親脂性官能基團(tuán)(帶陽(yáng)電荷的游離氨基)，可引入脂蛋白，和細(xì)胞膜磷脂中的磷酸根結(jié)合， 使細(xì)菌合成的胞漿膜的成分發(fā)生改變，細(xì)胞膜表面積增大，破壞了原來(lái)胞漿膜的屏蔽功能， 使其通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分大量外漏而死亡。細(xì)菌對(duì)本品不易產(chǎn)生耐藥性?？谕断?化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，無(wú)副作用，多粘菌素E是最安全的禽畜促生長(zhǎng)抗生素之 一。同時(shí)多粘菌素B及其類似結(jié)構(gòu)物被發(fā)現(xiàn)具有抗內(nèi)毒素作用(CN1583245、CN1493368、 W02006/108586.W02006/112934)引起了廣泛關(guān)注。多粘菌素已通過(guò)由枯草芽孢桿菌經(jīng)生物發(fā)酵產(chǎn)生，多粘菌素B的發(fā)酵單位一般可 以達(dá)到lg_2g/L。通過(guò)適當(dāng)?shù)目股靥崛〖夹g(shù)就可以從多粘菌素發(fā)酵液中分離純化出多粘 菌素。US2565057公布了通過(guò)活化活性炭的特征吸附來(lái)獲得多肽類抗生素的方法。通過(guò)調(diào) 節(jié)PH值，酸性條件下吸附雜質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值中性條件下吸附產(chǎn)品，最后用丙酮解析。該提取 方法由于活性炭的吸附選擇性較差，造成收率損失，且成品含量較低。同時(shí)活性炭的大量使 用不利于工業(yè)擴(kuò)大化生產(chǎn)。專利GB742589、GB782926、W02007/142611等都涉及到用樹脂提取分離多粘菌素 B、E的方法。專利GB742589、GB782926公布的方法為濾液用弱酸性陽(yáng)離子樹脂吸附，通過(guò) PH3-5水溶液來(lái)解析，繼續(xù)用陰離子樹脂或強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂來(lái)純化。專利W02007/142611 涉及到用非離子聚苯乙烯樹脂來(lái)吸附濾液，用有機(jī)溶劑的水溶液來(lái)解析。由于多粘菌素類 抗生素發(fā)酵單位較低，樹脂法生產(chǎn)存在工時(shí)過(guò)長(zhǎng)、吸附收率難以提高等缺點(diǎn)，提高了該產(chǎn)品 的生產(chǎn)成本。專利GB9798887公布的方法為通過(guò)反應(yīng)萃取到有機(jī)溶劑(如二辛脂、二壬酯)中， 達(dá)到分離富集的目的。此操作需在濾液pH7. 0條件下進(jìn)行，此時(shí)產(chǎn)品的穩(wěn)定性差，生產(chǎn)收率 較低，且由于運(yùn)用到有機(jī)溶媒，增加了環(huán)保費(fèi)用，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量也有一定的影響。
專利CN1583245涉及到一種用泡沫分離的方法從多粘菌素E的發(fā)酵液中提取分離 的方法。該方法的使用局限性較大，對(duì)發(fā)酵液質(zhì)量有較高的要求。同時(shí)勞動(dòng)生產(chǎn)率較低，不 利于生產(chǎn)的連續(xù)操作。且泡沫分離機(jī)的使用也提高了產(chǎn)品的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，以簡(jiǎn) 便、高效從發(fā)酵液中提取多粘菌素B、E為特征，解決了其它提取方法生產(chǎn)過(guò)程中勞動(dòng)強(qiáng)度 高、工序長(zhǎng)、提取收率低造成的生產(chǎn)成本較高的問(wèn)題，是一種經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保的適于產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)的提取方法。本發(fā)明的目的是以如下方式實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明以通過(guò)工業(yè)上常用的微生物培養(yǎng)手段 培養(yǎng)可以生產(chǎn)多粘菌素B、E的芽孢桿菌的發(fā)酵液或發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后的產(chǎn)物為對(duì)象，經(jīng)過(guò) 一定的工序及工藝條件后得到多粘菌素B、E成品。該方法包括發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物直接堿化； 固液分離收集菌渣；然后調(diào)節(jié)PH值至1. 0-6. 0使多粘菌素B、E從菌渣中溶解；然后通過(guò)納 濾濃縮去除無(wú)機(jī)鹽；然后噴干得到成品。具體方法如下在0_25°C條件下將發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值至10. 0-14. 0后攪拌 30分鐘；固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離堿沉淀，固液分離采用一般抗生素提取 純化專業(yè)技術(shù)人員所能利用的固液分離方法，如板框過(guò)濾、重力離心、離心過(guò)濾、錯(cuò)流過(guò)濾 等；將通過(guò)固液分離技術(shù)得到的游離堿沉淀用酸性物質(zhì)或溶液調(diào)節(jié)PH值至1.0-6.0，待多 粘菌素B、E游離堿沉淀溶解后，選用任一種常規(guī)的固液分離方法，如離心過(guò)濾、抽濾、板框 過(guò)濾等將溶解液進(jìn)行固液分離得到多粘菌素B、E鹽的濃縮液，為提高色澤度可以通過(guò)加入 0. 06-0. 1% (W/V)的高錳酸鉀攪拌30分鐘對(duì)得到的濃縮液進(jìn)行脫色處理，然后經(jīng)納濾去除 無(wú)機(jī)鹽，最后噴干得到成品。多粘菌素B、E發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物包括多粘菌素B、E發(fā)酵液、多粘菌素B、E發(fā)酵液通 過(guò)固液分離技術(shù)得到的上清液，優(yōu)選多粘菌素B、E發(fā)酵液。堿性物質(zhì)為工業(yè)上常用的堿性物質(zhì)，包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水。固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離堿沉淀以5-10倍游離堿沉淀體積的無(wú) 鹽水洗滌2-4次后再加入酸性物質(zhì)或溶液調(diào)節(jié)pH值。將發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值優(yōu)選12. 5-13. 5。將發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值至10. 0-14. 0時(shí)的溫度優(yōu)選5_15°C。酸性物質(zhì)為工業(yè)上常用的酸性物質(zhì)，包括硫酸、磷酸、草酸、鹽酸。用酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)溶液pH值優(yōu)選3. 0-4. 5。本發(fā)明以簡(jiǎn)便、高效從發(fā)酵液中提取多粘菌素B、E為特征，解決了其它提取方法 生產(chǎn)過(guò)程中勞動(dòng)強(qiáng)度高、工序長(zhǎng)、提取收率低造成的生產(chǎn)成本較高的問(wèn)題，具有不使用溶 媒、成本低、環(huán)保、收率高、對(duì)發(fā)酵液及設(shè)備的特性要求低的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1多粘菌素B發(fā)酵液3.01^含量1.78/1。先將發(fā)酵液降溫至15°C ；再用4mol/L的 KOH溶液調(diào)節(jié)pH至12. 5后攪拌30分鐘并保持溫度15°C ；將堿化的發(fā)酵液在3000轉(zhuǎn)速下
4離心15分鐘后，收集離心物，以60ml無(wú)鹽水洗滌兩次后，然后用1. Omol/L的HCL溶液調(diào)節(jié) 上清液PH至3. 0-4. 0使多粘菌素B沉淀溶解；抽濾溶解液，得到濃縮液加0. 08 %高錳酸鉀 攪拌30分鐘，抽濾所得脫色濃縮液，納濾處理，所得除鹽的濃縮液噴干進(jìn)風(fēng)溫度120°C，出 風(fēng)溫度80°C，得多粘菌素B鹽酸鹽4. 10克，含量80. 5%。實(shí)施例2多粘菌素B發(fā)酵液4.01^含量1.58/1。先將發(fā)酵液降溫至20°C ；再用4mol/L的 NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至13. 5后攪拌30分鐘并保持溫度20°C ；將堿化的發(fā)酵液在3000轉(zhuǎn)速下 離心20分鐘后，收集離心物，以75ml無(wú)鹽水洗滌兩次后，然后用1. Omol/L的H2SO4溶液調(diào) 節(jié)上清液PH至3. 0-4. 0使多粘菌素B沉淀溶解。抽濾溶解液，得到濃縮液加0. 07 %高錳酸 鉀攪拌30分鐘，抽濾所得脫色濃縮液，納濾處理得到除鹽的濃縮液，噴干進(jìn)風(fēng)溫度120°C， 出風(fēng)溫度75°C，得多粘菌素B硫酸鹽4. 76克，含量80. 0%。實(shí)施例3多粘菌素E發(fā)酵液3. OL含量5g/l。先將發(fā)酵液降溫至20°C ；再用4mol/L的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至11. 0后保持溫度20°C攪拌30分鐘；將堿化的發(fā)酵液在3000轉(zhuǎn)速下離心15 分鐘后，收集離心物，以100無(wú)鹽水洗滌三次后，然后用1. Omol/L的H2SO4溶液調(diào)節(jié)上清液 PH至3. 0-4. 0使多粘菌素E沉淀溶解；抽濾溶解液，得到濃縮液加0. 1 %高錳酸鉀攪拌30 分鐘，抽濾所得脫色濃縮液，納濾處理得到除鹽的濃縮液，噴干進(jìn)風(fēng)溫度110°C，出風(fēng)溫度 75°C，得多粘菌素E硫酸鹽13克，含量81.5%。
權(quán)利要求
一種從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于在025℃條件下將發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值至10.0 14.0后攪拌30分鐘；固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離堿沉淀；將通過(guò)固液分離技術(shù)得到的游離堿沉淀用酸性物質(zhì)或溶液調(diào)節(jié)pH值至1.0 6.0，待多粘菌素B、E游離堿沉淀溶解后，經(jīng)固液分離得到多粘菌素B、E鹽的濃縮液，經(jīng)納濾去除無(wú)機(jī)鹽，最后噴干得到成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于 多粘菌素B、E發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物包括多粘菌素B、E發(fā)酵液、多粘菌素B、E發(fā)酵液通過(guò)固液分 離技術(shù)得到的上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于 堿性物質(zhì)為工業(yè)上常用的堿性物質(zhì)，包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于 固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離堿沉淀以5-10倍游離堿沉淀體積的無(wú)鹽水洗滌 2-4次后再加入酸性物質(zhì)或溶液調(diào)節(jié)pH值。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于 將發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)PH值為12. 5-13. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于 將發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)PH值至10. 0-14. 0時(shí)的溫度保持在5-15°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于 酸性物質(zhì)為工業(yè)上常用的酸性物質(zhì)，包括硫酸、磷酸、草酸、鹽酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于 用酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)溶液PH值為3. 0-4. 5。
全文摘要
一種從發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物中提取多粘菌素B、E的方法，在0-25℃條件下將發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)物用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值至10.0-14.0后攪拌30分鐘；固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離堿沉淀；將通過(guò)固液分離技術(shù)得到的游離堿沉淀用酸性物質(zhì)或溶液調(diào)節(jié)pH值至1.0-6.0，待多粘菌素B、E游離堿沉淀溶解后，經(jīng)固液分離得到多粘菌素B、E鹽的濃縮液，經(jīng)納濾去除無(wú)機(jī)鹽，最后噴干得到成品。本發(fā)明以簡(jiǎn)便、高效從發(fā)酵液中提取多粘菌素B、E為特征，解決了其它提取方法生產(chǎn)過(guò)程中勞動(dòng)強(qiáng)度高、工序長(zhǎng)、提取收率低造成的生產(chǎn)成本較高的問(wèn)題，具有不使用溶媒、成本低、環(huán)保、收率高、對(duì)發(fā)酵液及設(shè)備的特性要求低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101974075SQ20101051667
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者于雪梅, 左良成, 常曉菲, 張利強(qiáng) 申請(qǐng)人:山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司