蟬蛻蛋白酶酶解物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蟬蛻蛋白酶酶解物及其用途，具體步驟如下：A、凈選蟬蛻，粉碎成細(xì)粉；B、將蟬蛻細(xì)粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，離心，所得上清液和殘渣備用；C、取上清液，干燥，得到蟬蛻胃蛋白酶酶解物；D、取殘渣轉(zhuǎn)入人工腸液中，加入胰蛋白酶水解，得到蟬蛻胰蛋白酶酶解物；步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為蟬蛻蛋白酶酶解物。蟬蛻蛋白酶酶解物具有抗凝血或溶栓的作用。
【專利說明】蟬蛻蛋白酶酶解物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥制藥領(lǐng)域，具體涉及蟬蛻蛋白酶酶解物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蝶脫為蝶科昆蟲黑蚱Cryptotympana pustulata Fabricius的若蟲羽化時脫落 的皮殼。性甘，味寒，歸肺、肝經(jīng)。具有疏散風(fēng)熱，利咽，透疹，明目退翳，解痙的作用，臨床主 要用于風(fēng)熱感冒，咽痛音啞，麻疹不透，風(fēng)疹瘙癢，目赤翳障，驚風(fēng)抽搐，破傷風(fēng)等。主要成分 為甲殼質(zhì)及蛋白質(zhì)、氨基酸等，藥材中活性成分尚不清楚，因此目前多以全粉末入藥，存在 著劑量大，易造成微生物污染等弊病。鑒于動物類蛋白質(zhì)、粘多糖等大分子物質(zhì)只有到達(dá)胃 腸道后受消化酶、酸、堿等作用，方可被酶解或者水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子 物質(zhì)，吸收入血而發(fā)生藥效，故生物酶仿生提取方法模擬體內(nèi)消化過程，提取的有效成分治 療效果更佳。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明目的是提供一種抗凝血和溶栓的蟬蛻蛋白酶酶解物及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容： 蟬蛻蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選蟬蛻，粉碎成細(xì)粉； B、 將蟬蛻細(xì)粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，離心， 所得上清液和殘渣備用； C、 取上清液，干燥，得到蟬蛻胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣轉(zhuǎn)入人工腸液中，加入胰蛋白酶水解，得到蟬蛻胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為蟬蛻蛋白酶酶解物。
[0005] 蟬蛻蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選蟬蛻，粉碎成細(xì)粉； B、 將蟬蛻細(xì)粉置于人工胃液中，密閉，于37°C恒溫水浴30分鐘后，加入3%胃蛋白酶水 解3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶酶解液置于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室 溫，以4500r/min離心15分鐘，所得上清液和殘渣備用； C、 取上清液，干燥，得蟬蛻胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30分鐘后，加入5%胰蛋白酶水解4小 時，將酶解液于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室溫，以4500r/min離心15分鐘，取上清液， 干燥，得蟬蛻胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為蟬蛻蛋白酶酶解物。
[0006] 蟬蛻蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選蟬蛻，粉碎成細(xì)粉； B、 將蟬蛻細(xì)粉置于人工胃液中，蟬蛻細(xì)粉與人工胃液的重量體積比為1:20,密閉，于 37°C恒溫水浴30分鐘后，加入3%胃蛋白酶水解3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶 酶解液置于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室溫，以4500r/min離心15分鐘，所得上清液和 殘渣備用； C、 取上清液，干燥，得蟬蛻胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30分鐘后，加入5%胰蛋白酶水 解4小時，將酶解液于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室溫，以4500r/min離心15分鐘，取上 清液，干燥，得蟬蛻胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為蟬蛻蛋白酶酶解物。
[0007] 所述蟬蛻胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制備抗凝血或溶栓的藥物中的應(yīng) 用。
[0008] 所述藥物的劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液或丸劑。
[0009] 為了驗證蟬蛻蛋白酶酶解物的抗凝血和溶栓作用，做了如下實驗： 蟬蛻胃蛋白酶解產(chǎn)物抗凝血或溶栓活性評價： 本發(fā)明采用活化部分凝血酶時間法（APTT法）和纖維蛋白原平板法對活性成分的抗凝 血和溶栓效果進(jìn)行評價，評價方法如下： 1材料 1. 1藥材 蟬蛻(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供)，置干燥箱60°C以下干燥，粉碎成細(xì)粉，備 用。
[0010] 1.2 試劑 牛纖維蛋白原（Sigma F8630,購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）;胰蛋白酶1 : 250 (Amresco0458,購自北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司）;胃蛋白酶1 :10000 (Sigma P7000,購 自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；醫(yī)用注射性尿激酶(購自北京市望京醫(yī)院）；凝血 酶（Sigma T4648,購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；活化部分凝血酶時間（APTT) 試劑10*1. 5ml (購自上海太陽生物試劑公司）;三氯乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司）；乙醇(分析純)。
[0011] 生理鹽水(稱取氯化鈉9g，加蒸餾水定容至1000ml，搖勻，即得）；人工胃液(取鹽 酸9ml，加蒸餾水稀釋成1000ml，即得）；人工腸液(取0. 2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，加 0. 2mol/L氫氧化鈉溶液118ml，用水稀釋至1000ml，搖勻，即得)。
[0012] 1.3 動物 健康的雄性日本大耳白兔，體重約2Kg(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供）， 符合國家健康一級動物標(biāo)準(zhǔn)。
[0013] 1.4 儀器 UV-2000型分光光度計；800B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠）；ES-120型電子分析天 平(長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠）；DZ-1BC型真空干 燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司）。
[0014] 2 方法 2. 1不同提取方法 2. 1. 1仿生酶解 稱取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250ml圓底燒瓶，按固液比1:20加入人工胃液(取鹽酸9ml， 加蒸餾水稀釋成l〇〇〇ml，即得)，密閉，于37°C恒溫水浴作用30min后，加入3%胃蛋白酶水 解3h，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15min滅酶，冷卻至室溫，以4500r/min離心15min， 取上清液水浴揮干，即得蟬蛻胃蛋白酶酶解物。殘渣稱重按固液比1:20加入人工腸液(取 0· 2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，加0· 2mol/L溶液118ml，用水稀釋至1000ml，搖勻，即得)， 密閉，于45°C恒溫水浴作用30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h,將酶解液于85°C恒溫水浴 作用15min滅酶，冷卻至室溫，以4500r/min離心15min,取上清液，干燥即得蝶脫胰蛋白酶 酶解物。
[0015] 2. 1.2 水提取 稱取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250ml圓底燒瓶，按固液比1:20加蒸餾水，回流提取3次，每 次2h，合并提取液，干燥，即得蟬蛻水提物。
[0016] 2. 1.3水提醇沉 稱取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250ml圓底燒瓶，按固液比1:20加蒸餾水，回流提取3次，每 次lh，合并提取液，濃縮至藥液比1:1，加入95%乙醇至含醇量90%，置冰箱中放置過夜后 4500r/min離心15min，取上清液回收干燥，即得蟬蛻90%水提醇沉物。殘渣干燥，即得醇沉 (渣)。
[0017] 2. 2抗凝纖溶藥效指標(biāo) 供試品溶液的制備取上述適量蟬蛻提取物，加生理鹽水或90%乙醇配制成濃度為 10mg/ml溶液，即為供試品溶液。
[0018] 取健康家兔(雌雄各半，產(chǎn)地北京）耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉，頸動脈取血，3. 8% 枸櫞酸鈉抗凝（1 : 9)，混勻后以1000r/min，離心lOmin，取上清液，即得富血小板血楽 (PRP)，以3000r/min，離心lOmin，取上清液，即得貧血小板血漿（PPP)。
[0019] 2.2.1 PT 試驗 取ΡΡΡΙΟΟμ 1于測試杯中，加樣品液10μ 1，37°C預(yù)溫3min，加入PT試劑200μ 1(預(yù)溫 3min)，開始計時，至有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準(zhǔn)確記錄凝固時間。以生理鹽水為陰性對照（每個 樣品平行測定6份） 2. 2. 2 APTT 試驗 取ΡΡΡΙΟΟμ 1于測試杯中，加樣品液10μ 1，37°C預(yù)溫3min，加人APTT試劑100μ 1(預(yù) 溫5min)，孵育5min后加入CaCl2 100μ 1(預(yù)溫15min)，開始計時，至有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準(zhǔn) 確記錄凝固時間。以生理鹽水為陰性對照(每個樣品平行測定6份)。
[0020] 2. 2. 3血小板聚集率試驗 PPP調(diào)零后，將PRP 300μ 1與樣品液?ομ 1置于測試杯中37°C預(yù)溫10min，加入誘導(dǎo) 劑ADP(lmmol/L) 10 μ 1，測定10min內(nèi)血小板最大聚集率。以生理鹽水為陰性對照(每個樣 品平行測定6份)。
[0021] 血小板最大聚集率=PRP最大聚集時與基線之間的距離/90 X 100% 血小板聚集抑制率=(對照管血小板聚集率％_給藥管聚集率％)/對照管血小板聚集 $%X100% 2. 2. 4血凝-纖溶動態(tài)圖試驗 取PRP 150μ 1與樣品液10μ 1混勻，37°C預(yù)溫10min，PPP調(diào)零，同時加入0· lmol/L CaCl2 50 μ 1，攪動10s，平衡記錄儀記錄動態(tài)圖，直至圖形峰值持續(xù)穩(wěn)定2min為止，以生理 鹽水或90%乙醇為陰性對照（每個樣品平行測定6份)。所得曲線即為血凝-纖溶動態(tài)圖。 根據(jù)動態(tài)圖觀察以下參數(shù)： ①凝固啟動時間（CST):即從曲線開始前，與橫軸平行的直線線段。CST反映從凝固 劑加入到纖維蛋白開始形成所需要的時聞，是體現(xiàn)血凝開始快慢的參數(shù)。?最大凝固程 度（MCE):即曲線上升的峰值段，也是開始凝固到凝固完全時透光度變化的峰值。MCE的高 低與測定用血漿量，即纖維蛋白原水平有關(guān)。它表示液態(tài)的纖維蛋白原已基本凝固成凝膠 態(tài)的纖維蛋白，凝固反應(yīng)已基本完成。@凝固時間（CT):即從曲線開始到曲線峰值所需的 時間，CT是血漿開始凝固到凝固完全所需的時間，是反映血漿凝固快慢的參數(shù)。g)平均凝 固速度（ACR):即MCE / CT的比值，代表平均每秒鐘形成的凝固程度，ACR是反映纖維蛋白 形成，即血凝反應(yīng)速度的參數(shù)。
[0022] 3實驗結(jié)果 3. 1 PT與APTT藥效考察 經(jīng)SPSS17. 0軟件統(tǒng)計，PT結(jié)果表明，所有蟬蛻提取物均不能明顯延長PT值，推測其抗 凝作用可能與外源性凝血系統(tǒng)無關(guān)。
[0023] APTT結(jié)果表明，與生理鹽水對照，胰蛋白酶酶解物、水提物、90%水提醇沉(渣)可延 長APTT，推測其可干擾內(nèi)源性凝血因子的活性，達(dá)到抗凝作用。結(jié)果見表1和圖1。
[0024] 表1蟬蛻不同工藝提取物PT、APTT藥效考察（交土s,n = 5 )
【權(quán)利要求】
1. 蟬蛻蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選蟬蛻，粉碎成細(xì)粉； B、 將蟬蛻細(xì)粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，離心， 所得上清液和殘渣備用； C、 取上清液，干燥，得到蟬蛻胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣轉(zhuǎn)入人工腸液中，加入胰蛋白酶水解，得到蟬蛻胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為蟬蛻蛋白酶酶解物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟬蛻蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選蟬蛻，粉碎成細(xì)粉； B、 將蟬蛻細(xì)粉置于人工胃液中，密閉，于37°C恒溫水浴30分鐘后，加入3%胃蛋白酶水 解3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶酶解液置于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室 溫，以4500r/min離心15分鐘，所得上清液和殘渣備用； C、 取上清液，干燥，得蟬蛻胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30分鐘后，加入5%胰蛋白酶水解4小 時，將酶解液于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室溫，以4500r/min離心15分鐘，取上清液， 干燥，得蟬蛻胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為蟬蛻蛋白酶酶解物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟬蛻蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選蟬蛻，粉碎成細(xì)粉； B、 將蟬蛻細(xì)粉置于人工胃液中，蟬蛻細(xì)粉與人工胃液的重量體積比為1:20,密閉，于 37°C恒溫水浴30分鐘后，加入3%胃蛋白酶水解3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶 酶解液置于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室溫，以4500r/min離心15分鐘，所得上清液和 殘渣備用； C、 取上清液，干燥，得蟬蛻胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30分鐘后，加入5%胰蛋白酶水 解4小時，將酶解液于85°C恒溫水浴15分鐘，冷卻至室溫，以4500r/min離心15分鐘，取上 清液，干燥，得蟬蛻胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為蟬蛻蛋白酶酶解物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的蟬蛻蛋白酶酶解物的應(yīng)用，其特征在于：所述蟬蛻 胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制備抗凝血或溶栓的藥物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述藥物的劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、 散劑、口服液或丸劑。
【文檔編號】A61P7/02GK104055801SQ201310095752
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月23日
【發(fā)明者】李曉燕, 趙韶華, 王鑫國, 王玉蓉 申請人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司