用蛋白酶處理并純化的纖維素酶組合物以及在酶促石磨中降低返染的方法

專利名稱：用蛋白酶處理并純化的纖維素酶組合物以及在酶促石磨中降低返染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在斜紋粗棉布織物和衣服用纖維素酶石磨時(shí)，用來降低或防止靛藍(lán)染料反染到斜紋粗棉布上的組合物和方法。
斜紋粗棉布是一種編織棉布，其經(jīng)紗經(jīng)常用藍(lán)色染料靛藍(lán)染色。用靛藍(lán)染色的斜紋粗棉布的一個(gè)必要特征是由經(jīng)紗和緯紗的藍(lán)線和白線交替所產(chǎn)生的觀感，由于平常的磨耗和磨損使斜紋粗棉布具有藍(lán)上見白的外觀。斜紋粗棉布的流行外觀是石磨外觀。這種石磨外觀包括與未石磨的斜紋粗棉布比較，特別是在線縫處周圍，局部有淡藍(lán)色，甚至是較淡的顏色。石磨材料通常具有較軟的質(zhì)地，與藍(lán)色相對(duì)維持所希望的白色。依照傳統(tǒng)的做法，石磨通過將斜紋粗棉布材料在有浮石存在的條件下洗滌來完成的，使得織物具有褪色或穿舊的觀感以及在與之相對(duì)的藍(lán)色上有所希望的白色。
酶，特別是纖維素酶，經(jīng)常用在斜紋粗棉布的加工過程中。特別地，使用纖維素酶使斜紋粗棉布具有石磨的外觀，而不需使用傳統(tǒng)石磨方法中那么多的浮石。這種處理方法在這里稱之為酶促“石磨”，即使在洗滌機(jī)中沒有使用浮石也是這樣。由于石頭的使用有幾方面的缺點(diǎn)，所以石磨中使用酶變得更加普遍了。例如在加工過程中使用的石頭會(huì)引起機(jī)器的磨耗和磨損、由于產(chǎn)生硬渣而導(dǎo)致的環(huán)境廢物問題，以及與從機(jī)器和衣服的口袋中除去石頭相關(guān)的高勞動(dòng)成本。因此期望在洗滌中減小石頭的用量或不用石頭。
與使用石頭相反，對(duì)于機(jī)器來說，酶(特別是纖維素酶)是安全的，導(dǎo)致了小的或沒有廢物問題，大大地降低了勞動(dòng)成本。因此在石磨中使用酶是有利的。盡管使用如纖維素酶之類的酶比使用石頭相比是有利的，然而存在與為這一目的而使用酶相關(guān)的問題。例如，與某些纖維素酶—如從朽木真菌木霉屬(wood-rotting fungus Trichoderma)中得到的纖維素酶，相關(guān)的一個(gè)問題被稱之為“再沉積(redeposition)”或“返染(backstaining)”(這兩個(gè)術(shù)語在此將被交替使用)，這是指在酶促石磨過程中某些染料返回到織物上。這種“再沉積”或“返染”會(huì)導(dǎo)致藍(lán)顏色染到斜紋粗棉布的白色紗上，使得藍(lán)色與白色紗之間的對(duì)比較小，并且有磨蝕點(diǎn)出現(xiàn)(如，在藍(lán)色外觀上有藍(lán)點(diǎn)，而不是在藍(lán)色外觀上有白色)。請(qǐng)參看AmericanDyestuff Reporter，Sept.1990，pp.24-28。
再沉積和返染對(duì)某些使用者來說是令人討厭的。例如，盡管木霉屬纖維素酶與腐殖菌屬(Humicola)纖維素酶相比對(duì)斜紋粗棉布材料具有特殊的活性，但是由于從腐殖菌屬獲得的纖維素酶的具有低水平的返染，所以是優(yōu)選的。同樣，由于木霉屬纖維素的能力越高酶的使用量就越少，在明顯較短的加工過程中能得到程度越高的磨蝕。
染料在石磨過程中的再沉積問題已為斜紋粗棉布加工者所關(guān)心。過去曾對(duì)木霉屬纖維素酶組合物問題所作的努力包括向纖維素酶洗滌中添加抗再沉積化學(xué)藥品，如表面活性劑和其它試劑，幫助分散釋放出來的靛藍(lán)染料以降低再沉積。此外，斜紋粗棉布加工者還試圖使用對(duì)斜紋粗棉布活性較小的纖維素酶，再加上超量的漂洗。這將導(dǎo)致額外的化學(xué)藥品的成本和較長(zhǎng)的加工時(shí)間。為解決再沉積問題的另一方法包括在加工過程中加入適度的漂白劑或污漬去除劑。這種方法影響衣服的最終色澤且延長(zhǎng)了加工時(shí)間。
這些方法對(duì)減小再沉積程度的能力是有限的，不能完全令人滿意，并且還有一些令人討厭的返染存在。酶和石頭一起使用在減輕再沉積程度上是有利的，然而對(duì)于加工者存在與使用石頭有關(guān)的問題。
另一種方法是在石磨處理過程中添加蛋白酶，正如Clarkson等人在公開的PCT說明書No.WO94/29426(以下稱之為“Clarkson等人的”)中所描述的。發(fā)現(xiàn)用包含再沉積纖維素酶和添加的蛋白酶的組合物處理斜紋粗棉布改善了白色和藍(lán)色紗之間的對(duì)比，降低了染料的再沉積。蛋白酶在洗衣機(jī)中起作用，由于某些原因被認(rèn)為能防止纖維素酶蛋白質(zhì)(cellulaseproteins)粘附到有色的顆粒上再返回到斜紋粗棉布的表面，當(dāng)用量適度時(shí)，它們對(duì)由于纖維素酶的作用所得的磨蝕外觀的沒有顯著的不良影響。這一方法在提供了某些優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，其成本很高，而且需要小心控制，這是因?yàn)榈鞍酌赣捎谄湫再|(zhì)趨向于破壞纖維素酶。工作人員必需在期望的對(duì)減少返染的蛋白酶解作用(proteolytic effect)與不期望的對(duì)降低纖維素酶活性的蛋白酶解作用之間保持平衡。
在Clarkson等人的方法中，蛋白酶基本上是作為一種污漬去除劑或污漬抑制劑使用，必須在洗滌過程中使用。在Clarkson等人提出了三種選擇(1)與纖維素酶一起直接向洗衣機(jī)中添加蛋白酶；(2)在用纖維素酶處理后向漂洗循環(huán)中添加蛋白酶；(3)在洗滌之前將蛋白酶與纖維素酶摻混。相對(duì)于同時(shí)添加蛋白酶和纖維素酶的基本方法，在漂洗循環(huán)中添加蛋白酶避免了對(duì)纖維素的酶的顯著蛋白酶解作用，其缺點(diǎn)是增加了額外的加工步驟。另一方面，纖維素酶與蛋白酶的預(yù)先摻混提供了一種簡(jiǎn)單的易使用的配方，但是難以在期望的去除污漬的蛋白酶解作用與不期望的破壞纖維素酶活性的蛋白酶解作用之間保持平衡。例如，高活性的蛋白酶在通常的儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間內(nèi)能完全破壞纖維素酶。這種儲(chǔ)存的穩(wěn)定性是能解決的，但是需要(1)選擇一種具有抗沾污能力，但至多在有限限度內(nèi)能消化(digest)纖維素酶的蛋白酶(枯草溶菌素(subtilisins)是一種對(duì)纖維素酶活性不太高的，卻是熟知的蛋白污漬去除劑，是優(yōu)選的)，(2)在提高的溫度下將選擇的蛋白酶和纖維素酶預(yù)先保溫，以保證在纖維素酶上的蛋白酶解作用所要攻擊的物質(zhì)能完全消除，而且工業(yè)配方在儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間將是穩(wěn)定的。
較強(qiáng)的蛋白酶作用，特別是蛋白酶木瓜蛋白對(duì)木霉屬纖維素酶的作用，已得到了深入的研究。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有限量的木瓜蛋白消化作用能夠?qū)⒛久箤倮w維素生物水解酶(cellobiohydrolases)的核心區(qū)(core domains)與其天然的結(jié)合區(qū)割裂。這就具備了基本消除這些酶所具有的抵抗結(jié)晶纖維素如微晶纖維素(Avicel)或棉花的任何可測(cè)量的活性以及同時(shí)保護(hù)它們抵抗可溶性物質(zhì)如β-葡聚糖的活性的效果。作為結(jié)果，以前的操作工推斷天然結(jié)合區(qū)域在使纖維素生物水解酶對(duì)結(jié)晶纖維素進(jìn)行攻擊中扮演了重要的角色。使木瓜蛋白完全消除CBH在結(jié)晶纖維素上的活性所需的量大約為每克纖維素酶蛋白0.1-0.5克木瓜蛋白，如果都乘以以分鐘計(jì)的處理時(shí)間(g min/g)，則是乘以了處理時(shí)間的蛋白酶蛋白與纖維素酶蛋白的重量比率。
基于前述關(guān)于降低或防止再沉積方法的缺點(diǎn)，有必要提出一種更易控制、成本更為有效的方法解決染料在石磨過程中的再沉積或返染。
與之相應(yīng)，需要找到一種酶促組合物或方法，它在成本上更有效、具有更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和高性能，而不包括再沉積或返染纖維素酶。
本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將含有纖維素生物水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)的木霉屬纖維素酶經(jīng)過有限的蛋白水解(即有限蛋白酶處理)后除去添加的蛋白酶，從而制成的低返染纖維素酶組合物，用這樣制成的低返染纖維素酶組合物洗滌靛藍(lán)染色的棉花，與使用再沉積纖維素酶制劑或既含有纖維素酶又含有蛋白酶的制劑比較是一種改進(jìn)。通過用這種組合物處理得到的斜紋粗棉布出人意料地具有低水平的染料再沉積，因此，在斜紋粗棉布上具有良好的藍(lán)白紗的對(duì)比。這種組合物是儲(chǔ)存穩(wěn)定的，與過去的方法比較只需要明顯少量的蛋白酶，即使在沒有Clarkson等人指出的“返染抑制組合物”(即蛋白酶)存在的條件下也具有令人驚奇地低的再沉積水平。本發(fā)明者還提供了一種回收和再循環(huán)蛋白酶使這種昂貴的組份能夠再利用的方法。斜紋粗棉布的洗滌過程中，可以選擇地向所描述的組合物或方法中添加少量的化學(xué)表面活性劑。如果添加表面活性劑，它可以和纖維素酶一起在洗滌時(shí)加入，也可以作為一種后處理漂洗。此外，在進(jìn)行斜紋粗棉布洗滌過程中，可以向所述組合物中添加或不添加石頭。
當(dāng)斜紋粗棉布與木霉屬纖維素酶組合物一起石磨時(shí)，顯示出返染水平明顯降低，并且在藍(lán)白紗之間的對(duì)比有明顯的提高，該組合物經(jīng)受有限的蛋白酶處理，接著純化以除去蛋白酶。發(fā)明者并不寄希望有任何特別的理論來幫助，但是對(duì)這種明顯矛盾的現(xiàn)象，一方面在洗滌中需要蛋白酶(Clarkson等人的)，另一方面它又不必存在(本發(fā)明)，的一種可能的解釋是蛋白酶在斜紋粗棉布的洗滌過程中以兩種獨(dú)立的、不同的機(jī)理影響返染。
第一種機(jī)理是Clarkson等人提出的，蛋白酶在洗衣機(jī)中簡(jiǎn)單地起污漬去除劑的作用。這種機(jī)理與Clarkson等人的發(fā)現(xiàn)相一致，這一發(fā)現(xiàn)是即使在纖維素酶處理中白色的斜紋粗棉布已經(jīng)被沾污，蛋白酶也能除去再沉積的染料。這也與熟知的在洗滌劑系統(tǒng)中將蛋白酶用作污漬去除劑相一致。有一點(diǎn)并不令人驚奇，即由纖維素蛋白產(chǎn)生的以染料為基礎(chǔ)的污漬是可以用一種熟知的處理與蛋白質(zhì)一蛋白酶有關(guān)的污漬的方法來除去。
然而，如果本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員從來沒有將蛋白酶放入洗衣機(jī)中的話，在第一種機(jī)理的引導(dǎo)下，并不能預(yù)料蛋白酶能夠抑制洗滌中的返染。為了解釋發(fā)明者的驚人的發(fā)現(xiàn)，即蛋白酶似乎能夠做到這一點(diǎn)，本發(fā)明者認(rèn)為存在第二種機(jī)理，與第一種機(jī)理相比是更微妙和更不明顯的。特別是本發(fā)明者相信有限的蛋白酶處理改變了纖維素酶的作用模式，把它們變成了更小、更易分散的不會(huì)返染的顆粒。已有報(bào)道蛋白酶通過切割其天然纖維素結(jié)合區(qū)，能使存在于木霉屬纖維素酶復(fù)合物中的纖維素生物水解酶組份對(duì)結(jié)晶纖維素不具有活性。本發(fā)明者假設(shè)這種處理仍然可以留下能夠使纖維素中產(chǎn)生小缺口的纖維素生物水解酶，它自身是不能檢測(cè)出來的，但是當(dāng)與木霉屬纖維素酶復(fù)合物中的其它組份，如內(nèi)切葡聚糖酶，結(jié)合使用時(shí)，將在斜紋粗棉布的洗滌環(huán)境中導(dǎo)致實(shí)實(shí)在在的磨蝕。本發(fā)明者還進(jìn)一步認(rèn)為，由于改性的纖維素生物水解酶不具有結(jié)合區(qū)，與用未經(jīng)處理過的木霉屬纖維素酶處理的相比，它們對(duì)結(jié)晶纖維素作用可能受到較少的局限，并更均勻地分布在斜紋粗棉布纖維上。對(duì)于未經(jīng)處理過的木霉屬纖維素酶，它們的高度局部化的作用模式可能會(huì)導(dǎo)致相對(duì)大的顆粒，這些顆粒是當(dāng)酶在大部分纖維中直接切入時(shí)從纖維素的主體上釋放出來的。與此相反，在存在有顯著量的剪切和混合的環(huán)境中，用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物的分散樣式越多，將使得從纖維素主體上松動(dòng)脫落下來的顆粒越小、越容易分散。其結(jié)果是返染也就越少。
第二種機(jī)理，盡管還未被認(rèn)識(shí)，但它在Clarkson等人所描述的結(jié)合纖維素酶和蛋白酶的處理上可能扮演了一個(gè)次要的角色。由于以前的操作人員集中研究在洗衣機(jī)中更明顯地使用蛋白酶來去除污漬，所以至今不這未能認(rèn)識(shí)。如果一個(gè)人準(zhǔn)備制造一種包括纖維素酶和蛋白酶的單一的商用酶組合物，是難以有效地操縱蛋白酶解作用的，因此不能全面地研究。用Clarkson等人自己的話說，這是一種困難的協(xié)調(diào)，你必須“在對(duì)降低污漬的蛋白酶解作用與降低磨蝕的蛋白酶解作用之間保持平衡”。因此，為了制造一種能直接加到洗滌中的結(jié)合纖維素酶/蛋白酶的酶組合物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員肯定會(huì)避免使用如木瓜蛋白這樣的蛋白酶，這是因?yàn)槿藗円呀?jīng)知道這種蛋白酶能破壞結(jié)晶纖維素活性，而采用人們更了解的，如枯草溶菌素在洗滌劑中抗污漬性能。
令人驚奇的是本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)按下面的方法能得到較好的總效果(1)放棄第一種“抗污漬”機(jī)理帶來的好處(即從酶的制劑中除去蛋白酶再洗滌斜紋粗棉布)，(2)利用這種變化帶來的優(yōu)點(diǎn)改進(jìn)蛋白酶解反應(yīng)的條件得到更強(qiáng)和更富攻擊性的處理，從而使從前未認(rèn)識(shí)到的第二種機(jī)理的效果最大?？傊眠@種方法得到的新組合物能使斜紋粗棉布得到很好的，而且成本上更有效的洗滌。
在進(jìn)一步詳細(xì)討論本發(fā)明之前，先定義下面的術(shù)語術(shù)語“木霉屬纖維素組合物”至少包括一種或多種纖維素生物水解酶(CBH)，和一種或多種由真菌微生物木霉屬(Trichoderma sp.)產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶(EG)。當(dāng)組合物是由天然存在的木霉屬微生物產(chǎn)生的時(shí)，每一種組份都是以微生物自然產(chǎn)生的比率存在，這一組合物有時(shí)稱之為“完全的或天然的木霉屬纖維素酶組合物”。
本發(fā)明中的木霉屬纖維素酶組合物也可以是指含有纖維素生物水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的從木霉屬(Trichoderma sp.)得到的纖維素酶組合物，這種木霉屬已在遺傳上改性，能多生成、少生成或不生成CHB和/或EG纖維素酶組份中的一種或多種。這些內(nèi)切葡聚糖酶和纖維素生物水解酶不僅可以包括作為天然木霉屬纖維素酶組合物中一部分的那些酶，而且可以包括作為截短的纖維素酶蛋白質(zhì)的改性纖維素酶組合物，或它們的一部分，或其衍生物，其中的纖維素酶蛋白質(zhì)含有CBHs或EGs的結(jié)合區(qū)或核心區(qū)。改性纖維素酶組合物的其它例子可以包括在某種程度上的糖基化轉(zhuǎn)化或在纖維素酶或截短的纖維素酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)上的氨基酸取代。也可以認(rèn)為天然木霉屬纖維素酶，如上面所描述的那些，的任何天然的或改性的變體都可認(rèn)為是木霉屬纖維素酶的組合物，即使它們是以木霉屬以外的基因改性的宿主微生物所產(chǎn)生的也是這樣。術(shù)語“蛋白酶處理過的木霉屬纖維素酶”是指其中有很大一部分CBH核心區(qū)已經(jīng)使它們的CBH結(jié)合區(qū)切割了的木霉屬纖維素酶組合物，這種處理的例子有通過添加蛋白酶來處理。然而，這種用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物中不應(yīng)有大量增加的或殘留的高于由微生物自然產(chǎn)生量的活性蛋白酶存在。例如，這一增量應(yīng)小于纖維素酶組合物中蛋白質(zhì)總量的0.1％。
認(rèn)為是本發(fā)明的用蛋白酶處理的纖維素酶組合物可以包括兩種制劑，其中添加的蛋白酶用來將CBH核心和結(jié)合區(qū)切割，此外，改性纖維素酶組合物的CBH核心區(qū)沒有結(jié)合區(qū)域是直接由基因改性的微生物產(chǎn)生的。在所有情形中，用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物都應(yīng)含有內(nèi)切葡聚糖酶和CBH核心蛋白。
在發(fā)明方法包括使要部分或全部酶促石磨的斜紋粗棉布與用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物接觸，其中組合物的用量應(yīng)足以達(dá)到從衣服上去除染料的程度。這樣一種酶的使用將使衣服在藍(lán)白紗之間具有良好的對(duì)比，并且具有低水平的返染。酶本身具有良好的穩(wěn)定性，而且不存在蛋白酶明顯降解的危險(xiǎn)。
在本發(fā)明的一個(gè)方案中，用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物是通過將木霉屬纖維素酶組合物與添加的處理量的蛋白酶接觸來制備的，蛋白酶蛋白質(zhì)對(duì)纖維素酶蛋白質(zhì)的重量比率乘以平均處理時(shí)間應(yīng)為1.0g min/g_10,000g min/g。然后，使用色譜分離法從纖維素酶中除去蛋白酶。在本發(fā)明的另一方案中，用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物與靛藍(lán)染色的斜紋粗棉布一起放入洗衣機(jī)中，在斜紋粗棉布的藍(lán)色和白色纖維上產(chǎn)生高對(duì)比度的磨蝕現(xiàn)象。纖維素酶木霉屬纖維素酶組合物通常是用木霉屬真菌浸入培養(yǎng)(submergedculture)來生產(chǎn)的，其生產(chǎn)和回收方法在文獻(xiàn)中有詳細(xì)記載，是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的。這些酶的來源有包括Iogen Corporation，GenencorInternational，Novo Nordisk，Gist-Brocades，Sigma Chemicals和EnymeDevelopment Corporation。
本發(fā)明的一種優(yōu)選木霉屬纖維素酶組合物是用真菌木霉屬longibrachiatum的菌株生產(chǎn)的。其中，酶CBH1、CBH2、EG1、EG2和EG3的相對(duì)濃度與完全或天然木霉屬纖維素酶組合物中所發(fā)現(xiàn)的一致。
商用纖維素酶制劑都不是100％的纖維素酶蛋白質(zhì)，經(jīng)常包括填料、緩沖液、穩(wěn)定劑和其它組份?？偫w維素酶蛋白質(zhì)可以通過各種已知的測(cè)試方法來測(cè)定。在這里優(yōu)選的測(cè)試試料(assay)是可商購的由BioradCompany，Los Angeles出售的Biorad Coomassie Blue Protein試料，并使用高度純化的纖維素酶作為標(biāo)準(zhǔn)。添加的蛋白酶蛋白酶可以從包括微生物、植物和動(dòng)物的幾種來源得到，在文獻(xiàn)中有詳細(xì)記載。某些重要的微生物蛋白酶解源包括Bacillus licheniformis、枯草桿菌(Bacillus subtilis)和曲菌屬oryzae(Aspergillus oryzae)。植物蛋白酶的重要來源包括能得到木瓜蛋白酶的番瓜和能得到菠蘿蛋白酶的鳳梨。適于本發(fā)明的蛋白酶包括絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金屬蛋白酶。優(yōu)選的一種蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶(cysteine protease papain)。
蛋白酶很容易從如Sigma Chemical等公司以多種不同形式購買到，如液態(tài)溶液、粉末或負(fù)載在固體載體上的不溶性酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，木瓜蛋白酶是以液體懸浮體的形式使用。
商用纖維素酶制劑都不是100％的纖維素酶蛋白質(zhì)，經(jīng)常包括填料、緩沖液、穩(wěn)定劑和其它組份?？偟睦w維素酶蛋白質(zhì)可以通過各種已知的測(cè)試方法來測(cè)定。在這里優(yōu)選的測(cè)試試料(assay)是可商購的由BioradCompany，Los Angeles出售的Biorad Coomassie Blue Protein測(cè)試試料。蛋白酶處理本發(fā)明的有限蛋白酶處理包括使液體木霉屬纖維素酶組合物與添加的蛋白酶在受控制的反應(yīng)條件下接觸一定的時(shí)間。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到合適的處理程度取決于選擇用來制備混合物的溫度、pH值、濃度以及所選擇的蛋白酶的特殊活性，也能進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到針對(duì)給定的纖維素酶組合物和所添加的蛋白酶，可以使用常用的測(cè)試方法來選擇一套最優(yōu)的加工條件。
在優(yōu)選的方案中，有限蛋白酶處理是在20℃-60℃更優(yōu)選30℃-50℃的提高的溫度下進(jìn)行，在最優(yōu)選的方案中，采用的溫度是37℃。
在優(yōu)選的方案中，有限蛋白酶處理是在3.0-8.0優(yōu)選4-7的pH值下進(jìn)行，在最優(yōu)選的方案中，采用的PH值是4-5。
在優(yōu)選的方案中，有限蛋白酶處理是在5-250g/l優(yōu)選50-200g/l的纖維素酶蛋白質(zhì)濃度下進(jìn)行的，在最優(yōu)選的方案中，采用的濃度是約100g/l。
在優(yōu)選的方案中，有限蛋白酶處理的時(shí)間是5分鐘到四周，優(yōu)選1-120小時(shí)，在蛋白酶是木瓜蛋白酶時(shí)，其最優(yōu)選的方案中所采用的處理時(shí)間是24-48小時(shí)。
在優(yōu)選的方案中，處理程度是由蛋白酶蛋白質(zhì)與纖維素酶蛋白質(zhì)的重量比乘以平均處理時(shí)間所定義的，是在1.0g min/g-10,000g min/g之間，優(yōu)選在10-1,000g min/g之間。在在蛋白酶是木瓜蛋白酶時(shí)，其最優(yōu)選的方案中的處理程度是約200g min/g。
在這些優(yōu)選方案中，木瓜蛋白酶的濃度是約14gm/升。
如下的蛋白酶解反應(yīng)過程的一種優(yōu)選方法是使用濾紙和CMC試料，它們分別用來測(cè)定纖維素酶的FPUs和CMCUs(Ghose 1987)。優(yōu)選蛋白酶處理應(yīng)達(dá)到這樣的程度以濾紙單位(FPUs)測(cè)定時(shí)，纖維素酶失去至少5％的初始活性，以CMC單位測(cè)定時(shí)，失去的初始活性不超過50％。進(jìn)一步優(yōu)選的是，纖維素酶的處理應(yīng)達(dá)到這樣的程度以FPUs測(cè)定時(shí)，纖維素酶失去至少10％的初始活性，以CMCs測(cè)定時(shí)，基本上維持70％-100％的初始活性。更加優(yōu)選的是，纖維素酶的處理應(yīng)達(dá)到這樣的程度以FPUs測(cè)定時(shí)，纖維素酶失去約50％的初始活性，以CMCs測(cè)定時(shí)，失去小于10％的初始活性。蛋白酶的除去和回收本發(fā)明方法進(jìn)一步需要在已達(dá)到所需要的處理程度時(shí)終止蛋白酶解反應(yīng)，使得沒有顯著量的外源蛋白酶污染本發(fā)明的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物。例如可以通過冷卻調(diào)節(jié)pH值來終止反應(yīng)。然后可以從纖維素酶復(fù)合物中將添加的蛋白酶分離出來。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到有多種方法能從木霉屬纖維素酶組合物中選擇地除去添加的蛋白酶，包括色譜分離法、選擇沉淀法、超濾法、或過濾法(如果使用了固體載體上的不溶性酶)。合適的除去方法取決于所選擇用來處理的蛋白酶的形式和其特殊性質(zhì)。
完成這一分離的一種優(yōu)選的方法是將溶解的蛋白酶結(jié)合(bind)到固體材料上，然后從其上洗掉纖維素酶。在這里所用的一種結(jié)合介質(zhì)是可購買到的陽離子樹脂，S_瓊脂糖，是由瑞典的Pharmacia Biotech，Uppsala所出售的，當(dāng)它與纖維素酶和蛋白酶的水溶液在低于6的pH值下接觸時(shí)，能粘合多種工業(yè)蛋白酶。使用S-瓊脂糖從木霉屬纖維素酶制劑中除去蛋白酶木瓜蛋白酶的一種優(yōu)選方法是將纖維素酶和蛋白酶的混合物滲析到電導(dǎo)率為3,000μ-S或更小，然后使之在4.5_5.0的pH值和低于20℃的溫度下通過S-瓊脂糖樹脂。
在優(yōu)選的方案中，蛋白酶被回收并用于另一批木霉屬纖維素酶。一種優(yōu)選的回收蛋白酶的方法是使之在4.5_5.0的pH值和低于20℃的溫度下結(jié)合到S_瓊脂糖樹脂上。S_瓊脂糖樹脂大約能結(jié)合100gm/l的木瓜蛋白酶。纖維素酶/木瓜蛋白酶混合物通過樹脂，當(dāng)樹脂載滿木瓜蛋白酶時(shí)，用軟水洗滌以除去任何污染的纖維素酶，再用1M氯化鈉溶液使木瓜蛋白酶解吸。再滲析木瓜蛋白酶溶液以除去過量的鹽，這樣就可以再使用了。因?yàn)槟竟系鞍酌敢子诳赡嫜趸Щ?，所以在回收操作中維持一還原環(huán)境是很重要的。產(chǎn)品配方本發(fā)明的纖維素酶組合物可以包括本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的各種助劑。例如，能與纖維素酶組合物共混的(陰離子的或非離子的)表面活性劑在本發(fā)明的組合物中是有用的。優(yōu)選的表面活性劑是非離子的，例如，TRITON表面活性劑(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇非離子表面活性劑)系列中的聚氧乙烯醇，可以從Union Carbide購買到。應(yīng)當(dāng)注意到表面活性劑可以進(jìn)一步改進(jìn)在白色和藍(lán)色紗線之間的對(duì)比度，并能減少染料的再沉積量。必要時(shí)，在組合物中還可以使用其它材料或用其取代別的材料，這些材料包括石頭、填料、溶劑、緩沖液、酶穩(wěn)定劑、pH控制劑、酶激活劑、助洗劑和其它抗再沉積劑等。
酶組合物可以配成固體產(chǎn)品，這種固體可以是顆粒的、噴霧干燥的或造粒的。另外酶的組合物也可以配成液體、凝膠或糊狀產(chǎn)品，在這里制備成液體是優(yōu)選的。斜紋粗棉布的洗滌產(chǎn)生“石磨”外觀的斜紋粗棉布洗滌要以使用石頭或不使用石頭，斜紋粗棉布或斜紋粗棉布衣服在洗衣機(jī)中與含有用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物的水溶液組合物一起機(jī)械攪拌。用來處理斜紋粗棉布的的組合物的量取決于纖維素酶組合物中纖維素酶蛋白的濃度，洗衣機(jī)中斜紋粗棉布基料的量，所期望的石磨效果，和本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的其它參數(shù)。優(yōu)選的用蛋白酶處理的纖維素酶組合物的用量通常是每kg斜紋粗棉布500-200,000CMC單位的酶，進(jìn)一步優(yōu)選的用量是每kg斜紋粗棉布5,000-100,000CMC單位的酶。
在優(yōu)選的方案中，斜紋粗棉布的洗滌處理是在提高的溫度下進(jìn)行的，該溫度為30℃-70℃進(jìn)一步優(yōu)選45℃-55℃。
在優(yōu)選的方案中，斜紋粗棉布的洗滌是在4.0-7.5，進(jìn)一步優(yōu)選為4.5-6.5的pH值下進(jìn)行，在最優(yōu)選的方案中pH值是6.0。
除纖維素酶組合物外，斜紋粗棉布的洗滌步驟中還可以各種其它加工助劑。例如，在本發(fā)明的方法中，將能與纖維素酶組合物共混的(陰離子的或非離子的)表面活性劑加入洗衣機(jī)中是有用的。優(yōu)選的表面活性劑是非離子的，例如，TRITON表面活性劑(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇非離子表面活性劑)系列中的聚氧乙烯醇，可以從Union Carbide購買到。應(yīng)當(dāng)注意到表面活性劑可以進(jìn)一步改進(jìn)在白色和藍(lán)色紗線之間的對(duì)比度，并能減少染料的再沉積量。必要時(shí)，在組合物中還可以使用其它材料或用其取代別的材料，這些材料包括石頭、填料、溶劑、緩沖液、酶穩(wěn)定劑、pH控制劑、酶激活劑、助洗劑和其它抗再沉積劑等。
實(shí)施例在上面已經(jīng)討論了本發(fā)明組合物以及該組合物的制備方法和它在織物布料的“石磨”中的應(yīng)用。下面的實(shí)施例提供本發(fā)明的組合物和方法的特別詳細(xì)的細(xì)節(jié)?；谶@些指導(dǎo)，選擇添加蛋白酶和纖維素酶的其他選擇，以及選擇洗滌條件，如濃度、測(cè)定方法、pH值、溫度等對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是非常明顯的了。實(shí)施例1用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物的制備通過木霉屬longibrachiatum的發(fā)酵生產(chǎn)600升天然木霉屬纖維素酶制劑，再滲析到電導(dǎo)率為450μ-S。這種產(chǎn)品是不穩(wěn)定不能保存的，但可以從Iogen Corporation以穩(wěn)定和可保存的形式購買到Iogen Cellulase。基本類似的材料可以通過簡(jiǎn)單地滲析Iogen Cellulase除去穩(wěn)定劑和保存劑來制備。然后經(jīng)超濾濃縮到500升的體積。所得產(chǎn)品的蛋白質(zhì)濃度為140gm/l，用Ghose(1987)方法測(cè)定，內(nèi)切葡聚糖酶的活度為1599CMC單位。拿出150升制劑，剩下的制劑與150升軟水以及40kg Biocon木瓜蛋白酶粉末混合，該粉末是從Quest International(產(chǎn)品號(hào)為5x98490)購買的，據(jù)Quest International所標(biāo)明，蛋白質(zhì)濃度為105g/kg，其活度為1,000凝乳單位(MCU)/mg。用苯甲酸鈉將pH值調(diào)至4.8，混合物在大約35-40℃下培養(yǎng)42小時(shí)。所達(dá)到的處理程度為約216g min/g。在這一蛋白酶處理過程中，以FPUs測(cè)定時(shí)，有49％的起始活性損失掉了，以CMCUs測(cè)定時(shí)，則小于10％。在1小時(shí)內(nèi)混合物冷卻到約20℃。然后混合物在有硅藻土(diatamaceous)覆蓋的板和濾框澄清混合物。用漂洗水將制劑稀釋到約960升。按樹脂生產(chǎn)商的指引(Pharmacia Technical Manual 18-1022-19“Ion Exchange ChromatographyPrinciples and Methods”，1991)，使制劑通過S-瓊脂糖陽離子交換樹脂，從蛋白酶和纖維素酶的混合物中除去蛋白酶。首先用乙酸鹽緩沖液將S-瓊脂糖平衡到PH值為4.7，再將蛋白酶/纖維素酶混合物加到樹脂上，使得每升填料樹脂上有約13g木瓜蛋白酶蛋白質(zhì)。樹脂用pH值為4.7的緩沖液漂洗。從柱中流出的混合物流和洗滌相含有純的不含木瓜蛋白酶的纖維素酶在纖維素酶中的木瓜蛋白酶的活性是在基于偶氮酪蛋白(azo-casein)活性的檢測(cè)極限之下，使1.0M的PH值為4.8的氯化鈉溶液流過樹脂，回收與S-瓊脂糖結(jié)合的木瓜蛋白酶。用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶制劑的體積為約2,700升。通過將PH值調(diào)節(jié)到4.0再添加0.5％的苯甲酸鈉保存所得的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶制劑。然后通過超濾濃縮這一組合物并按傳統(tǒng)方法(“EnzymeApplications”，Encyclopedia of Chemical Technology，Vol.9，F(xiàn)ourth Edition，1994)穩(wěn)定到約1,800CMC單位/ml的最終濃度。實(shí)施例2用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物洗滌斜紋粗棉布使用35鎊的UniMac Washer/Extractor洗衣機(jī)。將約5.1kg的要洗的斜紋粗棉布衣服放入洗衣機(jī)中。斜紋粗棉布包括Swift 14oz.#37628斜紋粗棉布的3塊30cm長(zhǎng)的縫合的褲腿(pant legs)和5塊一平方米的布片，以及Swift 12oz.#25113斜紋粗棉布的3塊30cm長(zhǎng)的縫合的褲腿，所有這些都是由Swift，Drummondville，Quebec制造的。斜紋粗棉布用30g從Gist-Brocades購買的Rapidase UCα-淀粉酶在70℃下處理15分鐘。洗衣機(jī)中充入51升熱水，并調(diào)至50℃。液體比為10∶1(液體的重量對(duì)衣服重量)。用300克85％的磷酸和114克氫氧化鈉顆粒將液體緩沖至PH值為6.0。
洗衣機(jī)攪拌1分鐘，以分散緩沖物并達(dá)到所需溫度。這時(shí)向洗衣機(jī)中添加70ml實(shí)施例1的用蛋白酶處理的纖維素酶制劑。衣服在47RPM下洗滌60分鐘，之后放掉缸中的水。
缸中充入50℃的水，并添加2g/L的蘇打灰，將PH值調(diào)整到9.0-11.0以破壞纖維素酶的活性。洗衣機(jī)攪拌10分鐘，然后放掉缸中的水。接著衣服用冷水漂洗5分鐘，再用熱水漂洗30秒鐘。然后在50℃下漂洗10分鐘，再放掉缸中的水，甩干。衣服用標(biāo)準(zhǔn)家用干燥機(jī)干燥30分鐘。將衣服從干燥機(jī)中拿出并熨燙，熨燙時(shí)不使用蒸汽。
用Elrephro光度計(jì)(brightness meter)檢測(cè)斜紋粗棉布的光度。對(duì)于#37628褲腿，其光度讀數(shù)是用來和已知靛藍(lán)含量的樣品比較，以估計(jì)染料凈除去量并轉(zhuǎn)換成靛藍(lán)染料從織物上的凈除去量。其結(jié)果表示成未洗斜紋粗棉布上靛藍(lán)的百分?jǐn)?shù)。對(duì)于#25113褲腿，其光度讀數(shù)是用來和已知靛藍(lán)含量的樣品比較，以估計(jì)返染的程度并轉(zhuǎn)換成在織物上沉積的靛藍(lán)染料凈量，其結(jié)果表示成未洗斜紋粗棉布上靛藍(lán)的百分?jǐn)?shù)。
這一程序用88ml的標(biāo)準(zhǔn)再沉積纖維素酶-Iogen Cellulase進(jìn)行重復(fù)，結(jié)果列于表1。表1.用蛋白酶處理的和未處理過的木霉屬纖維素酶的比較。
從表1中可以明顯看出染料的除去程度基本相同，暴露于蛋白酶處理過的纖維素酶的斜紋粗棉布與暴露于再沉積纖維素酶的斜紋粗棉布相比，表現(xiàn)出小得多的返染。實(shí)施例3添加有表面活性劑的斜紋粗棉布洗滌除特別聲明外，使用實(shí)施例2的方法，在斜紋粗棉布的洗滌過程中使用了下列酶a.80ml實(shí)施例1的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶，按實(shí)施例2使用。b.80ml實(shí)施例1的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶，按實(shí)施例2使用，但在用纖維素酶開始洗滌時(shí)向洗衣機(jī)中添加40ppm的TRITONX100。c.80ml實(shí)施例1的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶，按實(shí)施例2使用，但在用纖維素酶開始洗滌時(shí)向洗衣機(jī)中添加80ppm的TRITONX100。d.80ml實(shí)施例1的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶，按實(shí)施例2使用，但在用纖維素酶開始洗滌時(shí)向洗衣機(jī)中添加160ppm的TRITONX100。表2.證實(shí)添加表面活性劑的效果。
表2證實(shí)了添加表面活性劑進(jìn)一步降低了返染，而沒有明顯降低染料的釋放。實(shí)施例4斜紋粗棉布洗滌結(jié)果的比較應(yīng)用實(shí)施例2的方法，在斜紋粗棉布的洗滌中使用了下列酶a.實(shí)施例1的并在實(shí)施例2中測(cè)試過的用蛋白酶處理的纖維素酶。b.按Clarkson等人的方案，添加Iogen Cellulase(含有142mg/ml的蛋白質(zhì))作為再沉積木霉屬纖維素酶，以及分別添加0.02ml，0.10ml，0.5ml，2.5ml，12.5ml的從Gist-Brocades購買的Rapidase WSL-枯草桿菌蛋白酶作為蛋白酶。這一蛋白酶含有110mg/ml的蛋白質(zhì)。IogenCellulase的用量是88ml，只有用12.5ml蛋白酶時(shí)例外，此時(shí)用78ml纖維素酶?？莶輻U菌蛋白酶蛋白質(zhì)重量對(duì)纖維素酶蛋白質(zhì)重量的水平分別為0.02％，0.08％，0.40％，2.0％，10％。Clarkson等人所指導(dǎo)的最低水平是0.1％。按Clarkson等人的建議，用152g冰醋酸和55g氫氧化鈉片將PH值調(diào)至5.0。所有其它程序按實(shí)施例2進(jìn)行。
結(jié)果列于表3，它顯示了與Clarkson等人的方法比較，用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物得到了低得多的返染水平。這一結(jié)果反駁了Clarkson等人關(guān)于洗滌中需要蛋白酶的指導(dǎo)，它們不支持如下指導(dǎo)當(dāng)纖維素酶和蛋白酶一起添加到洗衣機(jī)中時(shí)，如果相對(duì)于纖維素酶的量蛋白酶的量高于0.1％，則反染明顯降低。表3.非再沉積纖維素酶組合物的比較。
實(shí)施例5蛋白酶處理過的木霉屬纖維素酶組合物的另一種制備方法。
通過木霉屬longibrachiatum的發(fā)酵生產(chǎn)1,000升天然木霉屬纖維素酶制劑，再滲析到電導(dǎo)率為310μS。這種產(chǎn)品是不穩(wěn)定不能保存的，但可以從Iogen Corporation以穩(wěn)定和可保存的形式購買到Iogen Cellulase。基本類似的材料可以通過簡(jiǎn)單滲析Iogen Cellulase除去穩(wěn)定劑和保存劑來制備。然后經(jīng)超濾濃縮到725升的體積。所得產(chǎn)品的蛋白質(zhì)濃度為98gm/l，用Ghose(1987)方法測(cè)定，內(nèi)切葡聚糖酶的活度為1325CMC單位/ml。拿出375升制劑，剩下的制劑與150升軟水以及15.75kg從FolexcoIncorporarte購買的“Folexco Papain 300MCU”混合，后者的活性木瓜蛋白酶蛋白質(zhì)濃度估計(jì)為32g/kg，其活度估計(jì)為300凝乳單位(MCU)/mg木瓜蛋白酶粉末。用苯甲酸鈉將PH值調(diào)至4.8，混合物在約35-50℃下培養(yǎng)27小時(shí)。所達(dá)到的處理程度為約24g min/g。本發(fā)明者估計(jì)在蛋白酶處理過程中，約有20％的FPU活性被損失掉了，但沒有CMCU活性損失。在2小時(shí)內(nèi)混合物冷卻到約10℃。然后混合物在有硅藻土(diatamaceous)覆蓋的板和濾框澄清混合物。用漂洗水將制劑稀釋到約800升。按樹脂生產(chǎn)商的指引(Pharmacia Technical Manual 18-1022-19“Ion ExchangeChromatographyPrinciples and Methods”，1991)，使制劑通過S-瓊脂糖陽離子交換樹脂，從蛋白酶和纖維素酶的混合物中除去蛋白酶。首先用乙酸鹽緩沖液將S-瓊脂糖平衡到PH值為4.7，再將蛋白酶/纖維素酶混合物加到樹脂上，使得每升填料樹脂上有約5g木瓜蛋白酶蛋白質(zhì)。樹脂用PH值為4.7的緩沖液漂洗。從柱中流出的混合物流和洗滌相含有純的不含木瓜蛋白酶的纖維素酶在纖維素酶中的木瓜蛋白酶的活性是在基于偶氮酪蛋白(azo-casein)活性的檢測(cè)極限之下，使1.0M的PH值為4.8的氯化鈉溶液流過樹脂，回收與S-瓊脂糖結(jié)合的木瓜蛋白酶。用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶制劑的體積為約1,600升。通過將PH值調(diào)節(jié)到4.0再添加0.5％的苯甲酸鈉保存所得的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶制劑。然后通過超濾濃縮這一組合物并按傳統(tǒng)方法(“Enzyme Applications”，Encyclopedia ofChemical Technology，Vol.9，F(xiàn)ourth Edition，1994)穩(wěn)定到約2,000CMC單位/ml的最終濃度。實(shí)施例6用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物洗滌斜紋粗棉布。
除特別聲明外，使用實(shí)施例2的方法，在斜紋粗棉布的洗滌過程中使用了下列酶a.86ml實(shí)施例5的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶，按實(shí)施例2使用。b.70ml實(shí)施例1的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶，按實(shí)施例2使用。c.88ml實(shí)施例2中所描述和測(cè)定過的Iogen Cellulase。
結(jié)果列于表4，證實(shí)了在實(shí)施例5(24g min/g)中使用較少量的木瓜蛋白酶來處理不能得到與實(shí)施例1(216g min/g)中同樣好的性能。表4.用蛋白酶處理的和未處理過的木霉屬纖維素酶的比較。
實(shí)施例7斜紋粗棉布洗滌結(jié)果的比較使用實(shí)施例2的方法，在斜紋粗棉布的洗滌過程中使用了下列酶a.在實(shí)施例2中測(cè)試過的，實(shí)施例1的用蛋白酶處理的纖維素酶。b.80ml實(shí)施例1的用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶，在用纖維素酶開始洗滌時(shí)向洗衣機(jī)中添加40ppm的TRITONX100，按照實(shí)施例3測(cè)試。c.添加100ml的Genencor International的商用纖維素酶產(chǎn)品EuroL，我們認(rèn)為它含有蛋白酶、再沉積木霉屬纖維素酶和表面活性劑。按生產(chǎn)商的指導(dǎo)，用150g冰醋酸和85g氫氧化鈉片將PH值調(diào)至5.5，所有其它程序都按實(shí)施例2進(jìn)行。d.向洗衣機(jī)中添加100ml的Euro L，在用纖維素酶開始洗滌時(shí)，還添加40ppm的TRITONX100。按生產(chǎn)商的指導(dǎo)，用150g冰醋酸和85g氫氧化鈉片將PH值調(diào)至5.5，所有其它程序都按實(shí)施例2進(jìn)行。e.添加250ml的Novo Nordisk的商用產(chǎn)品Denimax L，我們認(rèn)為它含有Humicola insolens產(chǎn)生(mage)的低返染酶。按生產(chǎn)商的指導(dǎo)，用297g磷酸和125g氫氧化鈉片將PH值調(diào)至6.5，所有其它程序都按實(shí)施例2進(jìn)行。f.向洗衣機(jī)中添加250ml的Denimax L，在用纖維素酶開始洗滌時(shí)，還添加40ppm的TRITONX100。按生產(chǎn)商的指導(dǎo)，用297g冰醋酸和125g氫氧化鈉片將PH值調(diào)至6.5，所有其它程序都按實(shí)施例2進(jìn)行。
結(jié)果列于表5，可以看出，與Euro L或Denimax L比較，在染料釋放量差不多的情況下，用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶組合物能給予斜紋粗棉布較低的返染水平。不帶表面活性劑的用處理過的木霉屬纖維素酶，相對(duì)于Euro L，甚至相對(duì)于含有提高性能的表面活性劑的Euro L，都表現(xiàn)出良好的性能。與其它酶比較，需要多于2-3倍的Denimax L才能使斜紋粗棉布褪色，從這一事實(shí)就可以看出，Humicola insolens纖維素酶的性能較差。表5.非再沉積纖維素酶組合物的比較。
至此，已經(jīng)描述完了本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明僅僅用用所附的權(quán)利要求書來限。
權(quán)利要求
1.一種含有用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶的低返染纖維素酶組合物，它是包括下列加工步驟的產(chǎn)品(a)通過向含有纖維素生物水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的木霉屬纖維素酶中添加蛋白酶，使纖維素酶經(jīng)受有限的蛋白酶處理；和(b)通過基本上除去所添加的蛋白酶來純化該纖維素酶，從而限定該組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的低返染纖維素酶組合物，其特征在于，所述的蛋白酶處理應(yīng)達(dá)到這樣的程度以濾紙單位測(cè)定時(shí)，被處理的纖維素酶的起始活性至少損失5％，以CMC單位測(cè)定時(shí)，其起始活性的損失不超過50％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，所述的蛋白酶處理應(yīng)達(dá)到這樣的程度以濾紙單位測(cè)定時(shí)，被處理的纖維素酶基本上維持在其起始活性的15％_90％之間，以CMC單位測(cè)定時(shí)，基本上維持在其起始活性的70％_100％之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，有限的蛋白酶處理步驟是這樣限定的使用的蛋白酶對(duì)纖維素酶的重量比率乘以平均處理時(shí)間基本上在1.0_10,000gmin/g之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其特征在于，有限的蛋白酶處理步驟是這樣限定的使用的蛋白酶對(duì)纖維素酶的重量比率乘以平均處理時(shí)間基本上在10.0_5,000gmin/g之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，所添加的蛋白酶包括木瓜蛋白酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，相對(duì)于組合物的重量，按總蛋白質(zhì)測(cè)定，在純化步驟后保留在組合物中的添加的蛋白酶少于0.1％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，相對(duì)于組合物的重量，按總蛋白質(zhì)測(cè)定，在純化步驟后保留在組合物中的添加的蛋白酶少于0.05％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，在純化步驟后的組合物中沒有可檢測(cè)的所添加的蛋白酶。
10.一種含有用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶的低返染纖維素酶組合物，所述木霉屬纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和纖維素二氫酶(CBH)核心區(qū)，其中CBH核心區(qū)不連接到它們?cè)瓉淼慕Y(jié)合區(qū)，相對(duì)于木霉屬天然產(chǎn)生的量，組合物基本上沒有增加的或殘留的蛋白酶活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其特征在于，所述纖維素酶是通過培養(yǎng)經(jīng)基因改性能直接產(chǎn)生沒有結(jié)合區(qū)的CBH核心區(qū)的木霉屬的株系制備的。
12.一種向靛藍(lán)染色的斜紋粗棉布表面引入局部顏色變化和藍(lán)紗與白紗之間高對(duì)比度的方法，所述方法包括使斜紋粗棉布與有效量的含有用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶的低返染纖維素酶組合物接觸，該組合物是包括下列加工步驟的產(chǎn)品(a)通過向含有纖維素生物水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的木霉屬纖維素酶中添加蛋白酶，使纖維素酶經(jīng)受有限的蛋白酶處理；和(b)通過基本上除去所添加的蛋白酶來純化該纖維素酶，從而限定該組合物。
13.一種向靛藍(lán)染色的斜紋粗棉布表面引入局部顏色變化和藍(lán)紗與白紗之間高對(duì)比度的方法，所述方法包括使斜紋粗棉布與有效量的含有用蛋白酶處理的木霉屬纖維素酶的低返染纖維素酶組合物接觸，所述木霉屬纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和纖維素生物水解酶(CBH)核心區(qū)，其中CBH核心區(qū)不連接到它們?cè)瓉淼慕Y(jié)合區(qū)，相對(duì)于木霉屬天然產(chǎn)生的量，該組合物基本上沒有增加的或殘留的蛋白酶活性。
全文摘要
在斜紋粗棉布織物和/或衣服的酶促“石磨”過程中，經(jīng)常發(fā)生不希望的藍(lán)色染料在斜紋粗棉布表面上的再沉積。本發(fā)明涉及一種解決這一問題的方法，該方法中使用了含有木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶和木霉屬纖維素生物水解酶的酶的組合物，這些酶已用蛋白酶部分消化以分離其核心區(qū)和結(jié)合區(qū)。使用這一組合物以降低藍(lán)色染料的再沉積，從而改進(jìn)涉及使用再沉積或返染纖維素酶的石磨過程。
文檔編號(hào)C11D11/00GK1144288SQ9610534
公開日1997年3月5日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者布賴恩·福蒂, 科林·尼科爾森, 杰弗里·托蘭, 特里薩·懷特 申請(qǐng)人:埃歐金公司