土鱉蟲蛋白酶酶解物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種土鱉蟲蛋白酶酶解物及其用途，具體步驟為A、凈選土鱉蟲，粉碎成細粉；B、將土鱉蟲細粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，離心；C、取上清液，干燥，得到土鱉蟲胃蛋白酶酶解物；D、取殘渣轉入人工腸液，加入胰蛋白酶水解，得到土鱉蟲胰蛋白酶酶解物；步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。土鱉蟲蛋白酶酶解物具有抗凝血或溶栓的作用。
【專利說明】土鱉蟲蛋白酶酶解物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥制藥領域，具體涉及土鱉蟲酶解物及其應用。
【背景技術】
[0002] 土鳘蟲為鳘爐科昆蟲地鳘Eupolyphaga sinensis Walker 或冀地鳘Steleophaga plancyi (Boleny)的雌蟲干燥體；主產于江蘇、湖北、河南、河北等地；味咸，寒；有小毒；歸 肝經。主要功能為破血逐瘀，續(xù)筋接骨。用于跌打損傷，筋骨骨折，血瘀經閉，產后瘀阻腹痛， 癥瘕痞塊。
[0003] 土鱉蟲目前報道的主要成分為揮發(fā)油和氨基酸。但具體活性成分未有文獻報道， 傳統中藥以土鱉蟲全蟲入藥，存在著服用劑量大，易造成微生物污染等弊病。鑒于動物類蛋 白質、粘多糖等大分子物質只有到達胃腸道后受消化酶、酸、堿等作用，方可被酶解或者水 解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物質，吸收入血而發(fā)生藥效，故生物酶仿生提取方法 模擬體內消化過程，提取的有效成分治療效果更佳。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明公開了一種土鱉蟲蛋白酶酶解物及其應用，具有很好的抗凝血和溶栓作 用。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術方案： 土鱉蟲蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 將土鱉蟲細粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，離 心； C、 取上清液，干燥，得到土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣轉入人工腸液，加入胰蛋白酶水解，得到土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
[0006] 土鱉蟲蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 將土鱉蟲細粉置于人工胃液中，密閉，于37 °C恒溫水浴30min，加入胃蛋白酶水解 2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶解液置于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，離 心； C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入胰蛋白酶水解2-4小時， 將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，離心15min，取上清液，干燥，得土鱉蟲胰蛋 白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
[0007] 土鱉蟲蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 向土鱉蟲細粉中加入與土鱉蟲細粉重量體積比為1 :20的人工胃液，密閉，于37°C恒 溫水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶酶解液，置 于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min ; C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入4%胰蛋白酶水 解2-4h，將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清 液，干燥，得土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
[0008] 土鱉蟲蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 向土鱉蟲細粉中加入與土鱉蟲細粉重量體積比為1 :20的人工胃液，密閉，于37°C恒 溫水浴30min，加入3%胃蛋白酶水解2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，用Imol/mlNaOH溶液 調節(jié)酶解液的pH=6. 8,將胃蛋白酶酶解液置于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/ min 離心 15min ; C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入3%胰蛋白酶水 解2-4h，將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清 液，干燥，得土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
[0009] 土鱉蟲蛋白酶酶解物，由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 向土鱉蟲細粉中加入與土鱉蟲細粉重量體積比為1 :20的人工胃液，密閉，于37°C恒 溫水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，用Imol/mlNaOH溶液 調節(jié)酶解液的pH=6. 8,將胃蛋白酶酶解液置于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/ min 離心 15min ; C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入2%胰蛋白酶水 解2-4h，將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清 液，干燥，得土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。 [0010] 所述土鱉蟲胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制備抗凝血或溶栓的藥物中的 應用。
[0011] 所述的藥物的劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液或丸劑。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：由于目前動物藥多以全粉入藥，存在著劑量大、易造成微生物 污染、用藥劑量不當而引起敏反應、急性肝腎功能損害、溶血反應、中樞抑制和致畸等毒副 作用。本發(fā)明提供了土鱉蟲進行抗凝、抗血栓活性成分的分離純化方法，可以有效的解決以 上問題。
[0013] 鑒于動物類蛋白質、粘多糖等大分子物質只有到達胃腸道后受消化酶、酸、堿等作 用，方可被酶解或水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物質，吸收入血而發(fā)揮藥效，故 本實驗模擬胃和小腸的環(huán)境及消化過程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶仿生提取土鱉蟲，使藥材 中的大分子蛋白水解為小分子肽類以利于人體吸收。APTT法、纖維蛋白原平板法為較常用 的體外抗凝，溶纖試驗方法，本實驗以其為考察指標，證明酶解工藝的可行性。具體為以水 解度為指標，單因素考察了仿生酶解法提取土鱉蟲的工藝條件；以APTT法、纖維蛋白原平 板法為考察指標，對仿生酶解法提取土鱉蟲的工藝進行驗證。結果證實，仿生酶解法凝血時 間長，抗血栓效果明顯。
[0014] 具體方法和結果通過以下實驗證實： 1材料 1.1藥材土鱉蟲（由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供） 1.2試劑牛血清白蛋白（Sigma A7906,購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學技術有限公司）； 牛纖維蛋白原（Sigma F8630,購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學技術有限公司）；胰蛋白酶1 :250 (Amresco0458,購自北京華美轉導科技有限公司）；胃蛋白酶1:10000 (Sigma P7000,購自 北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學技術有限公司）；醫(yī)用注射性尿激酶(購自北京市望京醫(yī)院）；凝血酶 (Sigma T4648,購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學技術有限公司）;APTT試劑10*1.5ml (購自上海 太陽生物試劑公司）;Protein Assay Dye Rgnt (Bio-red 5000006,北京澤平科技有限責任 公司）;三氯乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙醇(分析純）;屈臣氏純凈水(廣州 屈臣氏食品飲料有限公司）。
[0015] 生理鹽水(稱取氯化鈉9g，加蒸餾水定容至1000ml，搖勻，即得）；人工胃液(取鹽 酸9ml，加蒸餾水稀釋成1000ml，即得）；人工腸液(取0. 2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，加 0. 2mol/L氫氧化鈉溶液118ml，用水稀釋至1000ml，搖勻，即得)。
[0016] 1.3 儀器 UV-2000型分光光度計；800B型離心機(上海安亭科學儀器廠）； ES-120型電子分析天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器 廠）；DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司）。
[0017] 1. 4動物健康的雄性日本大耳白兔，體重約2Kg (均由北京維通利華實驗動物 技術有限公司提供)，符合國家健康一級動物標準。
[0018] 2方法與結果 以血漿凝血酶原時間（PT)和活化部分凝血活酶時間（APTT)為活性指標，對仿生酶解 工藝的酶底比和酶解時間進行考察。
[0019] 考察指標 2. 1. 1血漿凝血酶原時間（PT)測定法 樣品制備：取適量土鱉蟲提取物，配制成濃度為l〇mg/ml溶液，備用。
[0020] 血漿的制備：取健康家兔(雌雄各半，產地北京）耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉后，頸動 脈取血，3. 8%枸櫞酸鈉抗凝（1 : 9)，混勻后以3000r/min，離心lOmin，取上清液，分離出貧 血小板血漿（PPP)。
[0021] 取PPP100 μ 1于測試杯中，加樣品液10 μ 1，37°C，預溫3min，加入PT試劑200 μ 1 (預溫3min)，開始計時，至有纖維蛋白絲出現，準確記錄凝固時間。以生理鹽水或90%乙醇 為陰性對照(每個樣品平行測定5份)。
[0022] 凝血酶原時間比值（PTR)=待測血漿PT/空白PT 2. 1. 2活化部分凝血活酶時間（APTT)測定法 樣品和血漿的制備：同PT法。
[0023] 取PPP100 μ 1于測試杯中，加樣品液10 μ 1 0?溫5min)和APTT試劑100 μ 1 (預 溫5min)，孵育5min后加入CaCl2 100 μ 1 (預溫15min)，開始計時，至有纖維蛋白絲出現，準 確記錄凝固時間。以生理鹽水或90%乙醇為陰性對照(每個樣品平行測定5份)。
[0024] 2. 2工藝步驟如下： 2. 2. 1胃蛋白酶酶解工藝篩選 2. 2. 1. 1酶底比考察 稱取5g 土鱉蟲藥材細粉于250ml圓底燒瓶，加入人工胃液（固液比1 : 20)，密閉，于 37°C恒溫水浴作用30min后，分別加入酶底比為2%、3%與4%的胃蛋白酶水解3h，將各酶解 液置于85°C恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清液水浴揮 干，得到不同酶底比的土鱉蟲胃蛋白酶酶解物，每種提取物平行5份。
[0025] 對不同酶底比的提取物進行PT與APTT藥效考察，結果見表1和圖1、2。
[0026] 表1 胃蛋白酶不同酶底比提取物PT和APTT考察結果（ X 土s,n = 5 )
【權利要求】
1. 土鱉蟲蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 將土鱉蟲細粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，離 心； C、 取上清液，干燥，得到土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣轉入人工腸液，加入胰蛋白酶水解，得到土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
2. 根據權利要求1所述的土鱉蟲蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 將土鱉蟲細粉置于人工胃液中，密閉，于37°C恒溫水浴30min，加入胃蛋白酶水解 2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶解液置于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，離 心； C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入胰蛋白酶水解2-4小時， 將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，離心15min，取上清液，干燥，得土鱉蟲胰蛋 白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
3. 根據權利要求1所述的土鱉蟲蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 向土鱉蟲細粉中加入與土鱉蟲細粉重量體積比為1 :20的人工胃液，密閉，于37°C恒 溫水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，將胃蛋白酶酶解液，置 于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min ; C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入4%胰蛋白酶水 解2-4h，將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清 液，干燥，得土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
4. 根據權利要求1所述的土鱉蟲蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 向土鱉蟲細粉中加入與土鱉蟲細粉重量體積比為1 :20的人工胃液，密閉，于37°C恒 溫水浴30min，加入3%胃蛋白酶水解2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，用Imol/mlNaOH溶液 調節(jié)酶解液的pH=6. 8,將胃蛋白酶酶解液置于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/ min 離心 15min ; C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入3%胰蛋白酶水 解2-4h，將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清 液，干燥，得土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
5. 根據權利要求1所述的土鱉蟲蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制備： A、 凈選土鱉蟲，粉碎成細粉； B、 向土鱉蟲細粉中加入與土鱉蟲細粉重量體積比為1 :20的人工胃液，密閉，于37°C恒 溫水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小時，得到胃蛋白酶酶解液，用Imol/mlNaOH溶液 調節(jié)酶解液的pH=6. 8,將胃蛋白酶酶解液置于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/ min 離心 15min ; C、 取上清液，干燥，得土鱉蟲胃蛋白酶酶解物； D、 取殘渣加入20倍量人工腸液，密閉，于45°C恒溫水浴30min后，加入2%胰蛋白酶水 解2-4h，將酶解液于85°C恒溫水浴15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清 液，干燥，得土鱉蟲胰蛋白酶酶解物； 步驟C所得胃蛋白酶酶解物與步驟D所得胰蛋白酶酶解物即為土鱉蟲蛋白酶酶解物。
6. 根據權利要求1-5任一項所述的土鱉蟲蛋白酶酶解物的應用，其特征在于：所述土 鱉蟲胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制備抗凝血或溶栓的藥物中的應用。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述的藥物的劑型為膠囊劑、片劑、顆粒 齊[J、散劑、口服液或丸劑。
【文檔編號】A61K38/01GK104055800SQ201310094652
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月23日 優(yōu)先權日:2013年3月23日
【發(fā)明者】李曉燕, 趙韶華, 王鑫國, 王玉蓉 申請人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司