專利名稱：一種氯霉素人工抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有氯霉素的復(fù)合物，特別涉及一種氯霉素人工抗原的制備方法。
背景技術(shù)：
氯霉素是人體及動物治病防病的一種重要的抗生素，在動物治病中應(yīng)用廣泛，由于價格低廉等因素該抗菌素被廣泛應(yīng)用到動物的飼料中，是常用的動物飼料添加劑之一。但是抗生素的不合理的濫用導(dǎo)致許多病菌能夠耐受抗生素，產(chǎn)生抗藥性，對抗生素的有效治療疾病帶來負(fù)面影響。隨著人們生活水平以及對濫用抗生素的防范意識的提高，逐漸認(rèn)識到濫用抗生素的危害性，開始關(guān)注氯霉素的毒副作用，尤其肉食品中的抗生素的殘留量，肉食品及水產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易中對添加劑的成分及其含量，均有嚴(yán)格的限定。
肉制品及水產(chǎn)品中的氯霉素的殘留量是否超標(biāo)通常采用色譜檢測法，但操作較煩，且需要專人測定，給生產(chǎn)企業(yè)了解抗生素的殘留量帶來困難；后來人們開展放射免疫測定及酶聯(lián)免疫測定，但設(shè)備要從國外進(jìn)口，價格昂貴；由于氯霉素是半抗原，需要與載體蛋白交聯(lián)才能制備相應(yīng)的抗氯霉素的抗體，在此基礎(chǔ)上才能建立相關(guān)的免疫檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種氯霉素人工抗原的制備方法，將該人工抗原用于動物體氯霉素殘留量及免疫檢測上，具有檢測快速、操作簡便、成本低的優(yōu)點。
一種氯霉素人工抗原的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.3～0.5分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加5-20毫升比例添加，在封閉容器中水浴6-24h，生成含有羧基的氯霉素衍生物；
B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的5-10倍的冰冷1-5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用2-10倍體積的1-5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀2次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為40～75％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)5-10分鐘后，加入氯霉素重量30～50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾匮苌?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾匮苌镏屑尤肼让顾刂亓?0～50％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)5-10分鐘后，再加入氯霉素重量50-200倍重量的待偶聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯霉素-碳鏈-載體蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原；其中的載體蛋白是指常規(guī)的可作免疫載體使用的可溶性蛋白質(zhì)。
同現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點是將本氯霉素-碳鏈-載體蛋白復(fù)合物作為氯霉素人工抗原用于動物體氯霉素殘留量檢測及免疫檢測領(lǐng)域，使相關(guān)免疫檢測具有檢測快速、操作簡便、成本低的優(yōu)點。
具體實施例方式
實施例1一種氯霉素人工抗原的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.3分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加5毫升比例添加，小量制備可在封閉容器中水浴60℃、24h(大量制備則需要在在回流裝置中進(jìn)行水浴60℃、24h)，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的5倍的冰冷5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用2倍體積的5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀2次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為40％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)5分鐘后，加入氯霉素重量50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)10分鐘后，再加入氯霉素重量50倍重量的待偶聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯霉素-碳鏈-載體蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
實施例2一種氯霉素人工抗原的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.5分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加20毫升比例添加，小量制備可在封閉容器中水浴60℃、6h(大量制備則需要在在回流裝置中進(jìn)行水浴60℃、6h)，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的10倍的冰冷1N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用10倍體積的1N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀3次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為75％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量20％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)10分鐘后，加入氯霉素重量30％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾兀籇)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)5分鐘后，再加入氯霉素重量200倍重量的待偶聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯霉素-碳鏈-載體蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
實施例3一種氯霉素人工抗原的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.4分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加12毫升比例添加，小量制備可在封閉容器中水浴60℃、15h(大量制備則需要在在回流裝置中進(jìn)行水浴60℃、15h)，生成含有羧基的氯霉素衍生物；
B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的7倍的冰冷3N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用7倍體積的3N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀3次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為55％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量35％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)8分鐘后，加入氯霉素重量40％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?5％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)8分鐘后，再加入氯霉素重量120倍重量的待偶聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯霉素-碳鏈-載體蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
權(quán)利要求
1.一種氯霉素人工抗原的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.3～0.5分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加5-20毫升比例添加，在封閉容器中或在回流裝置中水浴6-24h，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的5-10倍的冰冷1-5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用2-10倍體積的1-5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀2-3次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為40～75％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)5-10分鐘后，加入氯霉素重量30～50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾兀籇)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0～50％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)5-10分鐘后，再加入氯霉素重量50-200倍重量的待偶聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯霉素—碳鏈—載體蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于蛋白質(zhì)是指常規(guī)的可作免疫載體使用的可溶性蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種氯霉素人工抗原的制造方法，是將氯霉素溶于無水吡啶中，并加入琥珀酸酐，使氯霉素分子導(dǎo)入了羧基，加交聯(lián)劑EDAC和6－氨基己酸，使氯霉素衍生物中的羧基與6－氨基己酸中的氨基縮合，增長了碳鏈，然后與載體蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)，得到氯霉素—碳鏈—載體蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物是一種氯霉素人工抗原。同現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點是偶聯(lián)方法簡便易行，將本氯霉素—碳鏈—載體蛋白復(fù)合物用于動物體氯霉素殘留量檢測及免疫檢測上，有助于提高檢測水平。
文檔編號A61K39/00GK1996016SQ20061015556
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者陳正賢, 鄔建敏, 葉興乾, 沈立榮, 吳建祥, 馬志超, 徐正 申請人:浙江大學(xué)