專利名稱：一種氯霉素－顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有氯霉素的復(fù)合物，特別涉及一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
氯霉素是人體及動(dòng)物治病防病的一種重要的抗生素，在動(dòng)物治病中應(yīng)用廣泛，由于價(jià)格低廉等因素該抗菌素被廣泛應(yīng)用到動(dòng)物的飼料中，是常用的動(dòng)物飼料添加劑之一。但是抗生素的不合理的濫用導(dǎo)致許多病菌能夠耐受抗生素，產(chǎn)生抗藥性，對(duì)抗生素的有效治療疾病帶來負(fù)面影響。隨著人們生活水平以及對(duì)濫用抗生素的防范意識(shí)的提高，逐漸認(rèn)識(shí)到濫用抗生素的危害性，開始關(guān)注氯霉素的毒副作用，尤其肉食品中的抗生素的殘留量，肉食品及水產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易中對(duì)添加劑的成分及其含量，均有嚴(yán)格的限定。
肉制品及水產(chǎn)品中的氯霉素的殘留量是否超標(biāo)通常采用色譜檢測法，但操作較煩，且需要專人測定，給生產(chǎn)企業(yè)了解抗生素的殘留量帶來困難；后來人們開展放射免疫測定及酶聯(lián)免疫測定，但設(shè)備要從國外進(jìn)口，價(jià)格昂貴；由于氯霉素是半抗原，需要與載體蛋白交聯(lián)才能制備相應(yīng)的抗氯霉素的抗體，在此基礎(chǔ)上才能建立相關(guān)的免疫檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，將該人工抗原用于動(dòng)物體氯霉素殘留量及免疫檢測上，具有檢測快速、操作簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.3～0.5分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加5-20毫升比例添加，在封閉容器中水浴6-24h，生成含有羧基的氯霉素衍生物；
B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的5-10倍的冰冷1-5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用2-10倍體積的1-5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀2次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為40～75％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)5-10分鐘后，加入氯霉素重量30～50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0～50％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)5-10分鐘后，再加入氯霉素重量50-200倍重量的待偶聯(lián)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，離心洗滌除去未能偶聯(lián)的自由小分子化合物，獲得氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原；顆粒細(xì)胞是指常規(guī)原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
同現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將本氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物作為氯霉素人工抗原，用于動(dòng)物體氯霉素殘留量檢測及免疫檢測上，具有檢測快速、操作簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.3分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加5毫升比例添加，小量制備可在封閉容器中水浴60℃、24h(大量制備則需要在在回流裝置中進(jìn)行水浴60℃、24h)，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的5倍的冰冷5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用2倍體積的5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀2次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為40％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)5分鐘后，加入氯霉素重量50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)10分鐘后，再加入氯霉素重量50倍重量的待偶聯(lián)的常規(guī)細(xì)菌進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，通過10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，離心洗滌除去未能偶聯(lián)的自由小分子化合物，獲得氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
實(shí)施例2一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.5分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加20毫升比例添加，小量制備可在封閉容器中水浴60℃、24h(大量制備則需要在在回流裝置中進(jìn)行水浴60℃、24h)，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的10倍的冰冷1N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用10倍體積的1N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀3次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為75％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量20％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)10分鐘后，加入氯霉素重量30％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)5分鐘后，再加入氯霉素重量200倍重量的待偶聯(lián)的常規(guī)細(xì)菌進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，通過10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，離心洗滌除去未能偶聯(lián)的自由小分子化合物，獲得氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
實(shí)施例3一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，其特征在于采用以下步驟
A)按重量比為1∶0.4分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加12毫升比例添加，小量制備可在封閉容器中水浴60℃、24h(大量制備則需要在在回流裝置中進(jìn)行水浴60℃、24h)，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的7倍的冰冷3N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用7倍體積的3N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀3次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為55％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量35％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)8分鐘后，加入氯霉素重量40％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?5％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)8分鐘后，再加入氯霉素重量120倍重量的待偶聯(lián)的常規(guī)細(xì)菌進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，通過10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，離心洗滌除去未能偶聯(lián)的自由小分子化合物，獲得氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
實(shí)施例4一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.5分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加20毫升比例添加，小量制備可在封閉容器中水浴60℃、24h(大量制備則需要在在回流裝置中進(jìn)行水浴60℃、24h)，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的10倍的冰冷1N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用10倍體積的1N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀3次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為75％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量20％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)10分鐘后，加入氯霉素重量30％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)5分鐘后，再加入氯霉素重量200倍重量的待偶聯(lián)的普通酵母菌進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，通過10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，離心洗滌除去未能偶聯(lián)的自由小分子化合物，獲得氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
權(quán)利要求
1.一種氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，其特征在于采用以下步驟A)按重量比為1∶0.3～0.5分別稱取氯霉素和琥珀酸酐，先后加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯霉素加5-20毫升比例添加，在封閉容器中水浴60度6-24h，生成含有羧基的氯霉素衍生物；B)將上述氯霉素衍生物置于離心管中，加入氯霉素原反應(yīng)體積的5-10倍的冰冷1-5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)10分鐘，析出含有羧基的氯霉素紅色產(chǎn)物，再用2-10倍體積的1-5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉淀2-3次，得到紫紅色沉淀物；C)向沉淀物中加入濃度為40～75％的乙醇溶液，沉淀物溶解后加入氯霉素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應(yīng)5-10分鐘后，加入氯霉素重量30～50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾?；D)在帶有碳鏈?zhǔn)直鄣穆让顾刂屑尤肼让顾刂亓?0～50％的水溶性碳化二亞胺，反應(yīng)5-10分鐘后，再加入氯霉素重量50-200倍重量的待偶聯(lián)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，通過10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，離心洗滌除去未能偶聯(lián)的自由小分子化合物，獲得氯霉素-顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物為一種氯霉素人工抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于顆粒細(xì)胞是指常規(guī)原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
全文摘要
一種氯霉素－顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，是將氯霉素溶于無水吡啶中，并加入琥珀酸酐，使氯霉素分子導(dǎo)入了羧基，加交聯(lián)劑EDAC和6－氨基己酸，使氯霉素衍生物中的羧基與6－氨基己酸中的氨基縮合，增長了碳鏈，然后與顆粒細(xì)胞進(jìn)行偶聯(lián)，得到氯霉素－顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物是一種氯霉素人工抗原。同現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將本氯霉素－顆粒細(xì)胞偶聯(lián)復(fù)合物作為一種氯霉素人工抗原用于動(dòng)物體氯霉素殘留量檢測及免疫檢測上，具有檢測快速、操作簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1996017SQ200610155569
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者陳正賢, 鄔建敏, 葉興乾, 沈立榮, 吳建祥, 馬志超, 徐正 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)