專利名稱：化合物梅花參皂苷Ananaside B的制備方法及其抗腫瘤用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種皂苷類化合物及其制備方法，尤其是從海洋動(dòng)物梅花參(Thelenota ananas Jaeger)中分離到一種皂苷類化合物及其抗腫瘤的用途。
背景技術(shù)：
梅花參(Thelenota ananas J.)，又名“鳳梨參”，為海洋棘皮動(dòng)物(Echinodermata)海參綱(Holothuriae)刺參科(Stichopodidae)動(dòng)物，其體形很大，長(zhǎng)一般為700mm，寬約100mm，高約80mm，廣泛分布于我國(guó)西沙群島和臺(tái)灣南端，具有補(bǔ)肝腎，益精血的功效。
皂苷是梅花參的主要次生代謝產(chǎn)物之一，是其化學(xué)防御的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗真菌，抗凝血、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等各種生物活性。在體外細(xì)胞毒活性篩選中，發(fā)現(xiàn)梅花參的乙醇提取物具有強(qiáng)烈誘導(dǎo)稻瘟霉(Pyricularia oryzae)菌絲體變形，最小變形濃度MMDC＝8μg/ml，但迄今為止尚不清楚其主要的有效成分，也未見有關(guān)其所含的皂苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供化合物梅花參皂苷Ananaside B及其制備方法。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了梅花參皂苷Ananaside B用于抗腫瘤的用途。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為
化合物梅花參皂苷Ananaside B，該化合物為無(wú)色結(jié)晶性粉末，溶點(diǎn)m.p.203～205℃(MeOH-H2O)， Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molisch反應(yīng)均呈陽(yáng)性。由電噴霧質(zhì)譜信號(hào)m/z 1229[M+Na]+和m/z 1183[M-Na]-，推測(cè)化合物1的分子量為1206。由高分辨質(zhì)譜HRESI-MS+中準(zhǔn)分子離子峰提供的精確分子量m/z 1229.5017[M+Na]+(Calc.Mass 1229.5002)，結(jié)合13CNMR譜，確定該化合物的分子式C54H87O26SNa。紅外光譜(KBr)cm-1max-3416，強(qiáng)寬峰(羥基)，1740(羰基)，1637(雙鍵)，1256，1070(υs，磺酸基)。1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1。
用三氟乙酸水解后得到組成皂苷糖鏈的單糖，衍生得到糖腈乙酸酯衍生物，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)糖的糖腈乙酸酯衍生物對(duì)照，確定Ananaside B的糖鏈由木糖、奎諾糖、3-O-甲基葡萄糖組成，比例為1∶2∶1。
由上述分析得到，梅花參皂苷Ananaside B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
表1 化合物ananaside B的的1H和13C核磁共振數(shù)據(jù)
Xyl木糖，Qui奎諾糖，MeGlc3-氧甲基葡萄糖上述梅花參是生長(zhǎng)于中國(guó)福建海域的梅花參。
本發(fā)明還提供制備梅花參皂苷Ananaside B的方法，具體如下將原料梅花參粉碎，用乙醇作為溶劑進(jìn)行提取，將提取液濃縮得到浸膏，通過(guò)大孔吸附樹脂柱進(jìn)行層析分離，收集乙醇洗脫部分，濃縮，得到海參總皂苷；將海參總皂苷應(yīng)用硅膠柱層析，薄層層析檢測(cè)，收集含Ananaside B的餾份，濃縮；再經(jīng)ODS RP-C18反相柱低壓層析進(jìn)行分離和純化，得到Ananaside B。
上述Ananaside B應(yīng)用酸水解，脫硫反應(yīng)，紅外光譜儀，電噴霧質(zhì)譜儀，高分辨質(zhì)譜儀，核磁共振氫譜儀，核磁共振碳譜儀，以及多種二維核磁共振譜儀，得到上述海參烷型三萜皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-O-{3′-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃奎諾糖(1→4)-β-D-吡喃奎諾糖(1→2)-4′-O-磺酸鈉-β-D-吡喃木糖}-海參烷-9-烯-3β，12α，17α，25β-四醇。
本發(fā)明對(duì)梅花參皂苷Ananaside B進(jìn)行了體外抗腫瘤試驗(yàn)，表明其具有明顯的抑制腫瘤的效果。試驗(yàn)所用細(xì)胞株為國(guó)際通用的腫瘤細(xì)胞株，即A-549(肺癌)MCF-7(乳腺癌)IA-9(卵巢癌)CAKI-1(腎癌)U-87-MG(神經(jīng)母細(xì)胞癌)PC-3(前列腺癌)KB(鼻咽癌)KB-VIN(鼻咽癌)SK-MEL-2(黑色素瘤)HCT-8(腸癌)試驗(yàn)方法為國(guó)際通用的SRB法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞以90μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)再加藥10μl/孔。每個(gè)濃度設(shè)三復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的生理鹽水溶媒對(duì)照及無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí)，然后傾去培養(yǎng)液，用10％冷TCA固定細(xì)胞，4℃放置1小時(shí)后用蒸餾水洗滌5次，空氣干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶標(biāo)儀520nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。試驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2.Ananaside B抗人類腫瘤的療效試驗(yàn)結(jié)果(ED50，μg/ml)
表2的結(jié)果表明，Ananaside B對(duì)10種不同的腫瘤細(xì)胞株均顯示明顯的抑制作用。
本發(fā)明提供了一種新的化合物梅花參皂苷及其制備方法，并發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤作用，因此得到了新的治療腫瘤的藥物或?yàn)檠兄菩碌目拱┧幬锾峁┝诵碌南葘?dǎo)化合物，也為開發(fā)利用中國(guó)的海洋藥用生物資源提供了一條重要途徑。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1將梅花參(干品)10公斤粉碎，于5倍量(重量)的80％乙醇中浸泡7天，得到乙醇提取液，再重復(fù)提取3次，合并提取液，減壓回收乙醇后得浸膏；將浸膏混懸于30％乙醇中，以乙醚萃取3～5次，棄乙醚萃取液；下層乙醇液減壓回收乙醇后得浸膏；浸膏溶于蒸餾水中，通過(guò)DA201-B大孔吸附樹脂柱，用水和50％乙醇依次沈脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得梅花參總皂苷提取物；將總皂苷提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(7∶3∶1)混合溶劑(下層)洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含Ananaside B的餾份，再經(jīng)ODS RP-C18反相柱層析，以甲醇∶水(55∶45)進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，得Ananaside B純品。
實(shí)施例2將梅花參鮮品10公斤，分別用5倍量(重量)95％、85％、85％的乙醇依次浸泡浸泡7天后提取乙醇提取液并合并，減壓回收乙醇后得流浸膏；將流浸膏溶于3倍量的水中，過(guò)濾，濾液通過(guò)DA201-B大孔吸附樹脂柱，依次用水和50％乙醇洗脫；收集50％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，得到梅花參總皂苷；將總皂苷進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(7∶3∶1)混合溶劑(下層)冼脫，薄層層析檢測(cè)，收集含Ananaside B的餾份，再經(jīng)ODS RP-C18反相柱層析，以甲醇∶水(5～10∶5～0)進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，得Ananaside B純品。
權(quán)利要求
1.一種化合物梅花參皂苷Ananaside B，其特征在于具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)
2.權(quán)利要求1所述的化合物梅花參皂苷Ananaside B的制備方法，其特征在于步驟如下(1)提取將原料梅花參粉碎，用乙醇作為溶劑進(jìn)行提取，將提取液濃縮得到浸膏，通過(guò)大孔吸附樹脂柱進(jìn)行層析分離，收集乙醇洗脫部分，濃縮得到海參總皂苷；(2)分離將上述海參總皂苷應(yīng)用硅膠柱層析，薄層層析檢測(cè)，收集含Ananaside B的餾份，濃縮；再經(jīng)ODS RP-C18反相柱低壓層析進(jìn)行分離和純化，得到Ananaside B。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物梅花參皂苷Ananaside B的制備方法，其特征在于(1)提取浸泡時(shí)乙醇濃度為30～95％、用量為梅花參的2～5倍量(重量)，冷浸提取7天，重復(fù)提取2～4次；大孔樹脂柱層析時(shí)，將浸膏混懸于水中，依次用水和10～90％醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇；(2)分離薄層層析以氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶1)混合溶劑梯度洗脫，ODS RP-C18反相柱層析以甲醇∶水(55∶45)進(jìn)行梯度洗脫。
4.權(quán)利要求1所述化合物梅花參皂苷Ananaside B治療腫瘤的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種皂苷類化合物及其制備方法，尤其是從海洋動(dòng)物梅花參中分離得到一種皂苷類化合物及其抗腫瘤的用途?；衔锩坊▍⒃碥誂nanaside B，其分子式C
文檔編號(hào)A61P35/00GK1986559SQ20061015546
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者巫軍 申請(qǐng)人:巫軍