用于制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變大腸桿菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過基因工程和進(jìn)化適應(yīng)制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E.coli菌株的方法；使用該方法制備的突變E.coli；以及使用該突變E.coli生產(chǎn)生物燃料、生物活性成分、藥用材料或化用基本化學(xué)物質(zhì)的方法。與野生型E.coli相比，能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E.coli能夠更有效地應(yīng)用于由生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的酶促糖化過程。
【專利說明】用于制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變大腸桿菌的方 法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E. coli的方法。更具體 而言，本發(fā)明涉及通過基因工程和進(jìn)化適應(yīng)制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E. coli 菌株的方法；使用該方法制備的突變E. coli ;以及使用該突變E. coli生產(chǎn)生物燃料、生物 活性成分、藥用材料或化工用化學(xué)物質(zhì)的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 隨著石化燃料的消耗，引起了對(duì)全球?qū)商娲茉吹拿芮嘘P(guān)注。作為可替代能源 之一的燃料乙醇可以由纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得。每年，由于通過光合作用固定（fixed)纖 維素而生產(chǎn)大量的纖維素。另外，纖維素是可再生的。當(dāng)考慮到其可再生性和生產(chǎn)率，纖維 素在功能上和經(jīng)濟(jì)上是非常有利的。目前，在纖維素類生物質(zhì)以外，主要是利用木質(zhì)纖維素 類生物質(zhì)，并且大量研究已聚焦于有效降解木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的成分，包括纖維素、半纖 維素和木質(zhì)素；另外對(duì)產(chǎn)生纖維素類生物質(zhì)的新菌株的尋找以及糖化作用和發(fā)酵過程也正 處于研究中。
[0004] 纖維素燃料的生產(chǎn)可大致分為i)使用至少三種酶（內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶 和β-葡聚糖酶）的生物質(zhì)酶促糖化過程，和ii)由此得到的糖的微生物發(fā)酵過程。近期， 已經(jīng)有關(guān)于同步糖化發(fā)酵（SSF)的大量研究，同步糖化發(fā)酵目的是在一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn) 行酶促糖化過程和發(fā)酵過程，通過同步糖化發(fā)酵使設(shè)備成本和酶抑制活性顯著降低，導(dǎo)致 乙醇的生產(chǎn)效率得到提高。在這些過程中，酶促糖化過程是最昂貴的。因此，研究方向針對(duì) 通過研發(fā)產(chǎn)生相關(guān)酶的細(xì)菌發(fā)酵菌株使得用于糖化作用的酶功能強(qiáng)化或者用量減少。特 別是，近期在生物工程技術(shù)已允許將糖化作用相關(guān)酶的基因?qū)爰?xì)菌發(fā)酵菌株并在其中表 達(dá)，從而開發(fā)出能夠同時(shí)進(jìn)行糖化作用和發(fā)酵作用的細(xì)菌菌株。然而，這種策略有外源基因 如糖化作用相關(guān)基因表達(dá)效率非常低以及對(duì)過表達(dá)后的細(xì)胞生長和代謝有負(fù)面影響的缺 點(diǎn)。因此，所關(guān)注的焦點(diǎn)從引入外源基因轉(zhuǎn)向改變發(fā)酵菌株內(nèi)源途徑的調(diào)節(jié)。
[0005] 大腸桿菌被視為生產(chǎn)木質(zhì)纖維素類燃料的有效工具，因?yàn)槠淇梢岳么嬖谟谏?質(zhì)水解產(chǎn)物中的所有糖類。然而，如果優(yōu)選的糖（例如葡萄糖）存在于水解產(chǎn)物中，則會(huì)發(fā) 生導(dǎo)致抑制參與除靶標(biāo)外的碳源分解代謝的酶合成的碳源代謝物抑制（CCR)，并伴隨著限 制微生物潛能的結(jié)果。盡管糖類如木糖和阿拉伯糖存在于水解產(chǎn)物中，但直到葡萄糖完全 消耗后木糖才可以代謝。葡萄糖的這種優(yōu)先性擾亂了發(fā)酵過程，由此降低該過程的效率，并 且由于未利用的碳源的累積，對(duì)下游過程具有負(fù)面影響。從木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物獲得的糖 混合物在組成上有很大變化，但相對(duì)其他糖，葡萄糖和木糖占主要部分。為了在成本、效率 和簡易度上改善纖維素燃料的生產(chǎn)，有需要研發(fā)可以同時(shí)利用這兩種糖的突變E. coli。
[0006] 通過一些分解代謝物脫阻抑的E. coli菌株已證明葡萄糖和木糖的同時(shí)利 用。許多研究已聚焦于cAMP受體蛋白（cAMP receptor protein, CRP)，稱為CCR的整 體（global)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。一些具有CRP突變（CRP*)的E. coli菌株被認(rèn)為部分脫 離 CCR 的控制（Karimova，G.，et al·，Research in Microbiology, 2004, 155(2) :76-79; Nair, N. U. , et al. ,Metabolic Engineering, 2010, 12(5) :462-468 ；Kimata, K. , et al. , Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America, 1997, 94 (24) : I 29 14-129 19 ； Inada,T. ,et al.,Genes Cells, 1996, 1(3) :293-301)。另外，缺少E. coli的葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS)部分地除 去（deprivecOCCR，并且甲基乙二醛合酶基因的刪除有利于調(diào)節(jié)葡萄糖的利用模式。然而， 這些方法無法以足夠程度消除CCR，以生產(chǎn)纖維素生物燃料，因此，仍然需要新的方法。
[0007] 同時(shí)，L-阿拉伯糖代謝相關(guān)的操縱子和基因通常被稱為ara操縱子，其是編碼 將阿拉伯糖分解代謝為木酮糖5-磷酸鹽（磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物）所需的酶的基因 序列。在ara操縱子中，是araBAD操縱子和araFGH操縱子，以及作為個(gè)體基因的araE。 它們之中，araB編碼L-核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，araD編碼L-核酮 糖-5-憐酸酶 4_ 差向異構(gòu)酶（L-ribulose-5-phosphatase 4-epimerase) ;araF、araG 和 araH編碼各自的阿拉伯糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基；以及araE編碼阿拉伯糖/氫離子同向轉(zhuǎn)運(yùn) 體(symporter)(Mayer, C. and ff. Boos, Chapter 3. 4. I, Hexose/Pentose and Hexitol/ Pentitol Metabolism(己糖/戊糖和己糖醇/戊糖醇的代謝）。在A. B6ck，R. Curtiss III, J. B. Kaper, P. D. Karp, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, J. M. Slauch, C. L. Squires, and D. Ussery (ed. ), EcoSal-Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology(大腸桿菌和沙門氏菌：細(xì)胞與分子生物學(xué)）中。http://www.ecosal.org.ASM Press, Washington, DC.) 〇
[0008] 同樣，D-木糖代謝相關(guān)的操縱子和基因通常被稱為xyl操縱子，其是編碼將木 糖分解代謝為木酮糖5-磷酸鹽（磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物）所需的酶的基因序列。xyl 操縱子含有xylAB操縱子和xylGHl操縱子，其中sylA編碼D-木糖異構(gòu)酶，xylB編碼木 酮糖激酶，以及xylF、xyIG和xyIH編碼各自的D-木糖ABC轉(zhuǎn)移酶亞基（Mayer，C. and W. Boos, Chapter3. 4.1，Hexose/Pentose and Hexitol/Pentitol Metabolism.在A. B0ck, R. Curtiss III, J. B. Kaper, P. D. Karp, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, J. M. Slauch, C. L. Squires, and D. Ussery (ed. ), EcoSal-Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology(大腸桿菌和沙門氏菌：細(xì)胞與分子生物學(xué)）中。http://www. ecosal. org. ASM Press, Washington, DC.) 〇
[0009] 關(guān)于本發(fā)明，對(duì)由生物質(zhì)有效生產(chǎn)生物燃料、生物活性成分和藥用材料的廣泛而 深入的研究帶來如下結(jié)果：當(dāng)野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基 因、xylAB操縱子和xylGHl操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被改變成組成型啟動(dòng)子時(shí)，所獲得的在 木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中生長的突變E. coli可以同時(shí)利用葡萄 糖和木糖。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010] 因此，本發(fā)明的目的在于提供用于制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變大腸桿 菌的方法。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供使用該方法制備的能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的 突變 E. coli。
[0012] 本發(fā)明的又一目的在于提供從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、生物活性成分、藥用材料或 化工用化學(xué)物質(zhì)的方法。
[0013] 根據(jù)其中一方面，本發(fā)明提供用于從野生型E. COli制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和 木糖的突變E. coli的方法，包括：（1)將野生型E. coli中araBAD操縱子、araFGH操縱子、 araE基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成各自的組成型啟動(dòng)子；以 及（2)將替換啟動(dòng)子后的E. coli在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中生 長10天或以上。
[0014] 根據(jù)其中另一方面，本發(fā)明提供了能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E. coli菌 株，其是通過將野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操 縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成各自的組成型啟動(dòng)子，并將替換啟動(dòng)子后的 E. coli在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中生長10天或以上而制備的。
[0015] 根據(jù)其中又一方面，本發(fā)明提供了通過使用能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變 E. coli從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、生物活性成分、藥用材料或化工用化學(xué)物質(zhì)的方法，所述突 變E. coli是通過以下方法制備：將野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE 基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成各自的組成型啟動(dòng)子，并將替 換啟動(dòng)子后的E. coli在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中生長10天或以 上。
[0016] 與野生型E. coli相反，本發(fā)明的突變E. coli具有同時(shí)利用葡萄糖和木糖的能力， 其可以減少用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、生物活性成分、藥用材料或化工用化學(xué)物質(zhì)的生 化工程所需的時(shí)間，由此可以提高生產(chǎn)效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的以下說明并結(jié)合附圖，本發(fā)明的以上和其他目的和特征將是顯而易 見的，附圖分別示出了：
[0018] 圖1是通過使用λ -紅重組系統(tǒng)將E. coli的染色體上的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（內(nèi)源性 啟動(dòng)子）替換成組成型啟動(dòng)子CP的過程的示意圖；
[0019] 圖2示出了將araBAD操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成組成型啟動(dòng)子的過程；
[0020] 圖3示出了將araFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成組成型啟動(dòng)子的過程；
[0021] 圖4示出了將araE基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成組成型啟動(dòng)子的過程；
[0022] 圖5示出了將xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成組成型啟動(dòng) 子的過程；
[0023] 圖6描述了在葡萄糖基本培養(yǎng)基⑷和木糖基本培養(yǎng)基⑶中的生長率，其中菱 形（?)代表野生型E. coli (WT);矩形（)代表菌株（AXcp)，其具有替換了 araBAD操縱 子、araFGH操縱子和araE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子，但沒有進(jìn)行進(jìn)化適應(yīng)；X代表實(shí)施例1的菌株（AXcpX50)，其具有替換 了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和araE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及xylAB操縱子和xylFGH操 縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子，然后在木糖基本培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)化適應(yīng)；以及三角 形（Λ )代表實(shí)施例2的菌株（AXcpAX50)，其具有替換了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和 araE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子， 然后在阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)化適應(yīng)；
[0024] 圖7描述了野生型E. coli (WT) (A)、具有替換了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和 araE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子 但沒有進(jìn)行進(jìn)化適應(yīng)的菌株（AXcp) (B)、實(shí)施例1的具有替換了 araBAD操縱子、araFGH操 縱子和araE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組成型 啟動(dòng)子然后在木糖基本培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)化適應(yīng)的菌株（AXcpX50) (C)、實(shí)施例2的具有替換 了 araBAD操縱子、araFGH操縱子和araE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及xylAB操縱子和xylFGH操 縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子然后在阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)化適 應(yīng)的菌株（AXcpAX50) (D)，在含有葡萄糖（2g/L)和木糖（2g/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的期間，葡 萄糖（?)和木糖（)的殘余濃度以及生長率。
[0025] 圖8描述了當(dāng)包括野生型E. coli MG1655(WT) (A)、實(shí)施例〈3-1>的敲除ptsG的 野生型菌株（WTAptsG) (B)、實(shí)施例2的突變菌株（AXcpAX50) (C)和實(shí)施例〈3-2>的敲除 PtsG的AXcpAX50菌株（AXAptsG) (D)的各菌株在含有葡萄糖（2. 5g/L)和木糖（2. 5g/L) 的M9基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，葡萄糖（·）和木糖(▼)的殘余濃度，以及細(xì)胞生長率（□);
[0026] 圖9描述了當(dāng)包括野生型E. coli MG1655(WT) (A)、實(shí)施例〈3-1>的敲除ptsG的野 生型菌株（WT Λ ptsG) (B)、實(shí)施例2的突變菌株（AXcpAX50) (C)和實(shí)施例〈3-2>的敲除PtsG 的AXcpAX50菌株（AXAptsG) (D)的各菌株在含有葡萄糖（5.0g/L)和木糖（5.0g/L)的M9 基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，葡萄糖（·）和木糖（V)的殘余濃度，以及細(xì)胞生長率（□);
[0027] 圖10比較了各菌株MG1655、AXcp、AXcpX50和AXcpAX50的修飾的DNA區(qū)域中的核 苷酸序列比對(duì)；
[0028] 圖11示出了各菌株的突變基因的肽序列比對(duì)；
[0029] 圖12是實(shí)施例4中根據(jù)在木糖基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后木糖的利用而篩選的 各突變菌株的生長率的圖表。
[0030] 圖13描述了實(shí)施例2的突變菌株（AXcpAX50)在含有以1:1、2:1、3:1或4:1比例 的葡萄糖和木糖（總共5g/L ;A-D)的M9基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，葡萄糖（·）和木糖（▼)的 殘余濃度，以及突變菌株的生長率；以及
[0031] 圖14描述了實(shí)施例5中獲得的WT-pXR菌株（A)和AX-pXR菌株⑶在含有5. 8g/ L葡萄糖和4. 2g/L木糖的M9基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，木糖醇的生成（)和菌株的生長率 (#)。
[0032] 發(fā)明詳述
[0033] 隨后，定義本文所使用的術(shù)語。
[0034] 如本文所用，術(shù)語"操縱子"是指在單個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)或啟動(dòng)子的控制下含有基因簇的 基因組DNA的功能單元。本發(fā)明所使用的'araBAD操縱子'、'araFGH操縱子'、'xylAB操縱 子'和'xylFGH操縱子'的結(jié)構(gòu)和功能是本領(lǐng)域已知的。
[0035] 如本文所用，術(shù)語"啟動(dòng)子"是指DNA的幫助特定基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。如本文所用，術(shù) 語"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"是指一種啟動(dòng)子，其活性是通過特定因子的存在或缺失而誘導(dǎo)的。術(shù)語 "組成型啟動(dòng)子"指的是未經(jīng)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，其允許相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)。araBAD操縱子、 araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子以及xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知 的。
[0036] 本發(fā)明提供了用于從野生型制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E. coli的方 法，包括：（1)將野生型E. coli中araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子 和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成相應(yīng)組成型啟動(dòng)子；以及（2)將替換啟動(dòng)子后的 E. coli在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中生長10天或以上。
[0037] 在工業(yè)上難以使用野生型E. coli從生物質(zhì)制備各種化學(xué)品，例如氨基酸、生物燃 料、生物聚合物和生物醇等，因?yàn)橐吧虴. coli由于碳源代謝物抑制而不能同時(shí)利用葡萄 糖和木糖。相反，本發(fā)明的突變E. coli明顯減少用于生產(chǎn)化學(xué)品的生化過程所需的時(shí)間， 隨之而來,提高了發(fā)酵效率、產(chǎn)率和生產(chǎn)效率,并降低了工藝操作成本。
[0038] 這些特性可以通過下述基因工程方法實(shí)現(xiàn)：將E. coli的染色體上的araBAD操縱 子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成各自 的組成型啟動(dòng)子；并結(jié)合使菌株在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中生長 的進(jìn)化適應(yīng)。
[0039] 在本發(fā)明中，步驟1提出將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE 基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子取代為各自的組成型啟動(dòng)子。
[0040] araBAD操縱子中，araB編碼L-核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，且araD 編碼L-核酮糖-5-磷酸酶4-差向異構(gòu)酶。阿拉伯糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基分別由araF、araG和 araH編碼，araE負(fù)責(zé)編碼阿拉伯糖/氫離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體。araBAD操縱子的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)運(yùn)子 具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。araFGH操縱子和araE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分別具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
[0041] 在該步驟中，可以通過拼接重疊延伸（splice overlap extension, S0E)PCR使用 如圖1-4的λ -紅重組系統(tǒng)來進(jìn)行將araBAD操縱子、araFGH操縱子和araE基因的誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子替換為熟知的相應(yīng)組成型啟動(dòng)子的過程，但也可以采用本領(lǐng)域已知的替代方法。只 要允許特定基因的組成型轉(zhuǎn)錄是已知的，則任何組成型啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明。優(yōu)選具有 核苷酸序列SEQ ID NO:6的CP25啟動(dòng)子，或者具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的CP6啟動(dòng) 子。根據(jù)[Jensen, P. R. and K. Hammer (1998). ^The sequence of spacers between the consensus sequences modulates the strength of prokaryotic promoters. ^Applied and Environmental Microbiology 64(1):82-87]的報(bào)道，已知 CP25 啟動(dòng)子是固有活性 (constitutive activity)最強(qiáng)的，而CP6啟動(dòng)子排第二。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， araBAD操縱子和araE基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被CP25啟動(dòng)子替代，而araFGH操縱子的誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子被CP6啟動(dòng)子替代。
[0042] 同樣，在該步驟中，可以通過拼接重疊延伸（SOE) PCR使用如圖5所示的λ-紅重 組系統(tǒng)來進(jìn)行將xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換為熟知的相應(yīng)組成型 啟動(dòng)子的過程，但也可以通過本領(lǐng)域已知的替代方法進(jìn)行。
[0043] xylAB操縱子中，xylA編碼D-木糖異構(gòu)酶，而xylB編碼木酮糖激酶。D-木糖ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基分別由xylFGH操縱子中的xylF、xyIG和xyIH編碼。xylAB操縱子和xylFGH操 縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分別具有SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5的核苷酸序列。
[0044] 可以組成型轉(zhuǎn)錄特定基因的任何已知的啟動(dòng)子均可以用于本發(fā)明。優(yōu)選具有核苷 酸序列SEQ ID NO:6的CP25啟動(dòng)子，或者具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的CP6啟動(dòng)子。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，xyIAB操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被CP25啟動(dòng)子替代，而xyIFGH操 縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被CP6啟動(dòng)子替代。
[0045] 通過突變過程獲得的E. coli菌株獲得了同時(shí)利用葡萄糖和木糖的表型，因?yàn)樵?替代了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子的控制下，激活了 araBAD操縱子、araFGH操縱子、 araE基因、xylAB操縱子和xylFGH操縱子。
[0046] 在本發(fā)明中，步驟2提出通過將E. coli在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基 本培養(yǎng)基中生長10天或以上，對(duì)在步驟1突變的E. COli進(jìn)行進(jìn)化適應(yīng)。本文中，術(shù)語'木糖 基本培養(yǎng)基'是指含有作為單獨(dú)碳源的木糖的培養(yǎng)基。木糖基本培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限 于，含有木糖4g/L、磷酸氫二鈉6. 78g/L、磷酸二氫鉀3. Og/L、氯化鈉0. 5g/L、氯化銨I. Og/ L、硫酸鎂2mM和氯化鈣0. ImM的M9基本培養(yǎng)基。術(shù)語'阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基'是 指不含除阿拉伯糖和木糖以外碳源的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的實(shí)例包括含有阿拉伯糖2g/L、木 糖2g/L、磷酸氫二鈉6. 78g/L、磷酸二氫鉀3. Og/L、氯化鈉0. 5g/L、氯化銨I. Og/L、硫酸鎂 2mM和氯化鈣0. ImM的M9基本培養(yǎng)基，但并不限于此。此外，生長期是可以影響葡萄糖和木 糖的利用的最短持續(xù)時(shí)間，菌株可以生長或適應(yīng)10天或以上、20天或以上、30天或以上、40 天或以上，或50天或以上。
[0047] 本發(fā)明還提供了能夠同時(shí)利葡萄糖和木糖的突變E. coli菌株，其是通過以下方 法制備：將野生型E. coli中的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和 xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成各自的組成型啟動(dòng)子，并將替換啟動(dòng)子后的E. coli 在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖與木糖的基本培養(yǎng)基中生長10天或以上。
[0048] 本發(fā)明的用于制備E. coli菌株的E. coli和組成型啟動(dòng)子如制備方法中所述。
[0049] 此外，本發(fā)明提供了通過使用本發(fā)明的突變E. coli從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、生物 活性成分、藥用材料或化工用化學(xué)物質(zhì)的方法。所述生物質(zhì)優(yōu)選是纖維素類生物質(zhì)，且更優(yōu) 選木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)。用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法是本領(lǐng)域廣泛已知的。本發(fā)明 以在酶促糖化過程和發(fā)酵過程中使用本發(fā)明的突變E. coli菌株為特征。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的突變E. coli菌株代替所有或一些酶來進(jìn)行糖化過程。在本發(fā) 明的另一實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的突變E. coli菌株進(jìn)行發(fā)酵過程。此外，本發(fā)明的突 變E. coli菌株可以用于同步糖化發(fā)酵（SSF)，其目的在于在一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行酶促糖 化過程和發(fā)酵過程。
[0050] 另外，本發(fā)明的突變E. coli菌株可以應(yīng)用于從生物質(zhì)生產(chǎn)化學(xué)品，例如氨基酸、 生物燃料、生物聚合物、生物醇、重組蛋白等。
[0051] 通過以下用于說明目的的實(shí)施例可以獲得對(duì)本發(fā)明更好的理解，但不應(yīng)被視為限 制本發(fā)明。
[0052] 實(shí)施例1 :通過啟動(dòng)子替換和進(jìn)化適應(yīng)制備突變E. coli
[0053] 通過下述方式將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、 xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換為各自的組成型啟動(dòng)子來制備突變 E. coli〇
[0054] 〈1-1>將araBAD橾縱子、araFGH橾縱子和araE某因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換為各自 的組成型啟動(dòng)子
[0055] 使用 Datta et al. (Datta，S.，N. Costantino, et al. (2006) · "A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. ^Gene 379 (0) : 109-115)所述的 λ -紅重組系統(tǒng)，將E. coli MG1655的染色體上的araBAD的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（SEQ ID NO: I) 替換為組成型CP25啟動(dòng)子（SEQ ID N0:6)(參見圖1)。
[0056] 簡言之，如文獻(xiàn)[Datta, S.，N. Costantino, et al. (2006) · "A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.^Gene 379(0):109-115 ； Datsenko KA et al. , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，97(12)，6640-6645,2000;和 Cherepanov，PP.，W Wackernagel. (1995). Gene disruption in Escherichia coli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158(1):9-14.]中所述，通過拼接重疊延伸（SOE)PCR擴(kuò)增用于啟動(dòng)子替換的兩個(gè)重疊片 段，以使CP25啟動(dòng)子與卡那霉素盒（cassette)連接。片段1具有組成型啟動(dòng)子CP25,其 攜帶與araB啟動(dòng)子的下游區(qū)域同源的引物序列，由此配置成使用表1列舉的三個(gè)拼接重疊 延伸化（SOEing)的引物將組成型啟動(dòng)子CP25與araB啟動(dòng)子的下游區(qū)域連接。片段2含 有來自PKD13的卡那霉素盒，其從與araB啟動(dòng)子的上游區(qū)域同源的突出部分開始，并終止 于允許與片段1連接的同源序列。在98°C下開始3分鐘后，使用95°C下30秒、50?60°C 下30秒和72°C下2分鐘的30個(gè)熱循環(huán)來進(jìn)行SOE PCR。該過程示意性地描述于圖2中， 并且在該過程中所用的引物和質(zhì)粒在表1中給出。
[0057] 〈表 1>
[0058]
【權(quán)利要求】
1. 由野生型E. coli (大腸桿菌）制備能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E. coli的方 法，包括： (1) 將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和 xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換為其各自的組成型啟動(dòng)子；以及 (2) 將啟動(dòng)子替換后的E. coli在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖和木糖基本培養(yǎng)基中培 養(yǎng)10天或更長。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操 縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分別具有SEQ ID NO: 1-5的核苷酸序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子具有SEQ ID N0:6或7的核苷酸 序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述木糖基本培養(yǎng)基是含有4g/L木糖、6. 78g/L磷 酸氫二鈉、3. Og/L磷酸二氫鉀、0. 5g/L氯化鈉、1. Og/L氯化銨、2mM硫酸鎂和0. ImM氯化鈣 的M9-基本培養(yǎng)基。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述阿拉伯糖和木糖培養(yǎng)基是含有2g/L阿拉伯糖、 2g/L木糖、6. 78g/L磷酸氫二鈉、3. Og/L磷酸二氫鉀、0. 5g/L氯化鈉、1. Og/L氯化銨、2mM硫 酸鎂和0. ImM氯化鈣的M9-基本培養(yǎng)基。
6. 通過以下方法制備的能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E. coli (大腸桿菌），所 述方法包括將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子 和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換為其各自的組成型啟動(dòng)子；以及將啟動(dòng)子替換后的 E. coli在木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖和木糖基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天或更長。
7. 如權(quán)利要求6所述的突變E. coli，其中araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、 xylAB操縱子和xylFGH操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分別具有SEQ ID NO: 1-5的核苷酸序列。
8. 如權(quán)利要求6所述的突變E. coli，其中所述組成型啟動(dòng)子具有SEQ ID N0:6或7的 核苷酸序列。
9. 如權(quán)利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID N0:55、56、58和60的核苷酸序 列表示的突變。
10. 如權(quán)利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID NO:51和53的氨基酸序列表 示的突變。
11. 如權(quán)利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID N0:50、52、54和55的核苷酸 序列表示的突變。
12. 如權(quán)利要求6所述的突變E. coli，其包括由SEQ ID NO:57和59的氨基酸序列表 示的突變。
13. 通過使用能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖的突變E. coli由生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、生物 活性成分、藥用材料或用于化學(xué)工業(yè)的化學(xué)物質(zhì)的方法，所述突變E. coli通過以下方式制 備：將野生型E. coli的araBAD操縱子、araFGH操縱子、araE基因、xylAB操縱子和xylFGH 操縱子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換為其各自的組成型啟動(dòng)子；以及將啟動(dòng)子替換后的E. coli在 木糖基本培養(yǎng)基或阿拉伯糖和木糖基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天或更長。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104371963SQ201410389340
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月14日
【發(fā)明者】李成國, 金久熙, 丁圣勛, 金奭玟, 崔倍榮 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人蔚山科學(xué)技術(shù)大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)