具有改進(jìn)的特異性的新型免疫球蛋白結(jié)合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種修飾的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，例如，葡萄球菌(Staphyloccocus)蛋白A，所述蛋白具有改善的免疫球蛋白結(jié)合特異性；以及所述蛋白的制備方法和使用方法。
【專利說明】具有改進(jìn)的特異性的新型免疫球蛋白結(jié)合蛋白
[0001]本申請(qǐng)是2009年8月11日提交的題為“具有改進(jìn)的特異性的新型免疫球蛋白結(jié)合蛋白”的中國專利申請(qǐng)200910221476.7的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求以2008年8月11日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/188，549和2009年4月16日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/212，812為優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。上述臨時(shí)申請(qǐng)?jiān)诖司囊胱鳛閰⒖肌?br>
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及修飾的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，例如葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A，其具有改進(jìn)的免疫球蛋白結(jié)合特異性，以及制備和應(yīng)用該蛋白的方法。
[0005]背景
[0006]葡萄球菌蛋白A (SpA),是一種來自細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的42kDa的多域蛋白。SpA通過其羧端的細(xì)胞壁結(jié)合域被結(jié)合到細(xì)菌的細(xì)胞壁上，該結(jié)合域被稱為X結(jié)構(gòu)域。在氨基端的結(jié)構(gòu)域，其包括5個(gè)免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，被稱為E、
D、A、B 和 C 區(qū)(Sjodhal，Eur J B1chem.Sep ;78 (2): 471-90 (1977) ;Uhlen 等人，J B1lChem.Feb 10 ；259 (3): 1695-702 (1984))。上述每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含大約58個(gè)氨基酸殘基，且它們具有65-90%的氨基酸序列同一性。SpA的Z結(jié)構(gòu)域是一個(gè)工程化了的SpA的B結(jié)構(gòu)域的類似物，其在第29位上包括一個(gè)丙氨酸來替代甘氨酸殘基。
[0007]基于SpA的試劑在生物【技術(shù)領(lǐng)域】具有廣泛的應(yīng)用，例如，在捕獲和純化抗體的親和層析以及抗體的檢測方法等方面。目前，基于SpA的親和介質(zhì)可能是應(yīng)用最廣泛的親和介質(zhì)，其用于從不同樣品，包括細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行單克隆抗體及其片段的分離。相應(yīng)地，包括蛋白A配體的各種基質(zhì)可以在市場上購買到，包括例如，ProSep? -vA High Capacity,ProSep? vA Ultra、ProSep? UltraPlus (Millipore)和 Protein A Sepharose?,MabSelect?, MabSelect Xtra? 以及 MabSelect S U Re? (GE Healthcare)。
[0008]發(fā)明概沭
[0009]本發(fā)明至少部分提供新的改進(jìn)的SpA變體，其相對(duì)于以前所知的SpA變體表現(xiàn)出或者降低、或者升高的結(jié)合免疫球蛋白Fab部分的能力，同時(shí)保留其結(jié)合免疫球蛋白Fe部分的能力。
[0010]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供新的改進(jìn)的SpA變體，其相對(duì)于市場上可購買到的很多基于蛋白A的Fab結(jié)合試劑表現(xiàn)出降低的Fab結(jié)合活性，而后者的Fab結(jié)合活性在有些時(shí)候是人們所不希望的。
[0011 ] 在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合域是基于SpA的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(即E、D、A、B、C和Z)，其被修飾為至少替換第29位的氨基酸。對(duì)于E、D、A、B和C結(jié)構(gòu)域而言，第29位的氨基酸是甘氨酸，其被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸。對(duì)于結(jié)構(gòu)域Z而言，第29位的氨基酸是丙氨酸，其被替換為除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，第29位的甘氨酸被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸，或者第29位的丙氨酸被替換為除甘氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸。
[0012]相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其包括至少SpA的E區(qū)，其中至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基，且其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的結(jié)合活性，而相對(duì)于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分降低的結(jié)合。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，E區(qū)第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基。
[0013]在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其包括至少SpA的D區(qū)，其中至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基，且其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的結(jié)合活性，而相對(duì)于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分降低的結(jié)合。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，D區(qū)第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基。
[0014]在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其包括至少SpA的A區(qū)，其中至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基，且其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的結(jié)合活性，而相對(duì)于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分降低的結(jié)合。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，A區(qū)第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基。
[0015]在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其包括至少SpA的B區(qū)，其中至少第2 9位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基，且其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的結(jié)合活性，而相對(duì)于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分降低的結(jié)合。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，B區(qū)第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基。
[0016]在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其包括至少SpA的C區(qū)，其中至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基，且其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的結(jié)合活性，而相對(duì)于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分降低的結(jié)合。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，C區(qū)第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基。
[0017]在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其包括至少SpA的Z區(qū)，其中至少第29位的丙氨酸殘基被替換為除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基，且其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的結(jié)合活性，而相對(duì)于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分降低的結(jié)合。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，Z區(qū)第29位的丙氨酸殘基被替換為除甘氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基。
[0018]在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白包括多于一個(gè)修飾的SpA結(jié)構(gòu)域或其已知的變體(例如，多于一個(gè)的E、D、A、B、C和/或Z結(jié)構(gòu)域以及其任意組合)其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括將第29位的甘氨酸(即，對(duì)于E、D、A、B和C結(jié)構(gòu)域而言)或丙氨酸(即，對(duì)于Z結(jié)構(gòu)域而言)替換為另一個(gè)氨基酸，例如，除丙氨酸、甘氨酸或色氨酸以外的一個(gè)氨基酸。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，第29位的甘氨酸或丙氨酸被替換為除丙氨酸、甘氨酸、色氨酸和蘇氨酸以外的氨基酸。
[0019]在一些實(shí)施方式中，一種或多種分離的E、D、A、B和C結(jié)構(gòu)域的第29位的甘氨酸(G)或分離的Z結(jié)構(gòu)域的第29位的丙氨酸被替換為選自下列組的氨基酸:亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、天冬酰胺(N)、纈氨酸(V)、異亮氨酸(I)、絲氨酸(S)，半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、組氨酸(H)、脯氨酸(P)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或其功能性變體或衍生物。
[0020]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白包括一個(gè)或多個(gè)分離的E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，其中所述的一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域包括將第29位的甘氨酸殘基(例如，對(duì)于E、D、A、B和C結(jié)構(gòu)域而言)或第29位的丙氨酸(例如，對(duì)于Z結(jié)構(gòu)域而言)替換為選自下列組的氨基酸:亮氨酸，賴氨酸和精氨酸或其功能性變體或衍生物。[0021 ] 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合蛋白進(jìn)一步包括至少一部分SpA的羧基端區(qū)域(特指X結(jié)構(gòu)域)。
[0022]在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白進(jìn)一步包括一個(gè)天冬酰胺，例如，在第23位處，其被替換為另一個(gè)氨基酸。
[0023]在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，提供了一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其包括葡萄球菌蛋白A的一個(gè)或多個(gè)分離的E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域包括:(i)當(dāng)所述結(jié)構(gòu)域是E、D、A、B或C的時(shí)候，至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸外的氨基酸殘基；或(ii)當(dāng)所述結(jié)構(gòu)域是Z的時(shí)候，至少第29位的丙氨酸殘基被替換為除甘氨酸外的氨基酸殘基，其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白能夠結(jié)合免疫球蛋白的Fe部分，且相對(duì)于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分增強(qiáng)的結(jié)合活性。
[0024]在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白包括第29位的蘇氨酸或色氨酸，其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白能夠結(jié)合免疫球蛋白的Fe部分，且相對(duì)于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分增強(qiáng)的結(jié)合活性。在一些實(shí)施方式中，所述Fe部分可以是Fe融合蛋白的一部分。
[0025]在此描述的能夠被不同種類的免疫球蛋白結(jié)合蛋白所結(jié)合的免疫球蛋白包括一種或多種IgG、IgA和IgM0
[0026]在其它的實(shí)施方式中，提供了一種可用于分離免疫球蛋白或抗體的層析基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的一種層析基質(zhì)包括在此描述的一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其偶聯(lián)于一種固體載體上。
[0027]在此還提供了編碼不同的所述免疫球蛋白結(jié)合蛋白的核酸分子，以及包含這些核酸分子的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在其它的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
[0028] 另外，本發(fā)明還包括了一種多肽文庫，其包括一種或多種所述的免疫球蛋白結(jié)合蛋白及其功能性變體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種核酸分子文庫，其編碼一種或多種本發(fā)明所涵蓋的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，或編碼其功能性變體。
[0029]在此還提供一種應(yīng)用所述免疫球蛋白結(jié)合蛋白的方法。在一些實(shí)施方式中，提供了一種從樣品中親和純化一種或多種免疫球蛋白的方法，其包括以下步驟:(a)提供包括一種或多種免疫球蛋白的樣品；(b)使樣品接觸層析基質(zhì)，該層析基質(zhì)包括一種所述的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，接觸的條件使得所述的一種或多種免疫球蛋白與基質(zhì)結(jié)合；以及通過在合適的PH下進(jìn)行洗脫，回收所述的一種或多種結(jié)合的免疫球蛋白。
[0030]在此描述的各種實(shí)施方式中，將一種或多種結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行洗脫的合適的PH是酸性pH。
[0031]附圖簡沭
[0032]圖1描述了 SpA的野生型(wt) IgG結(jié)合域的核酸序列，如SEQ ID NOs: 1-5所示。SEQ ID NO:1表示wt E區(qū)的核酸序列；SEQ ID勵(lì):2表示被D區(qū)的核酸序列；SEQ ID NO: 3表示wt A區(qū)的核酸序列；SEQ ID NO: 4表示wt B區(qū)的核酸序列；以及SEQ ID勵(lì):5表示被C區(qū)的核酸序列。
[0033]圖2描述了 SpA的Z區(qū)的核酸序列，如SEQ ID NO:6所示。
[0034]圖3描述了 SpA(E、D、A、B和C)的野生型(wt) IgG結(jié)合區(qū)的氨基酸序列比對(duì)，其包括第29位的甘氨酸。SEQ ID N0:7表示wt E區(qū)的氨基酸序列；SEQ ID N0:8表示wt D區(qū)的氨基酸序列；SEQ ID NO: 9表示wt A區(qū)的氨基酸序列；SEQ ID NO: 10表示wt B區(qū)的氨基酸序列；SEQ ID N0:11表不wt C區(qū)的氣基酸序列。
[0035]圖4描述了 Z區(qū)的氨基酸序列，如SEQ ID NO: 12所示。
[0036]圖5描述了質(zhì)粒pJ56:8620的示意圖，其中“His6”如SEQ ID N0:22所示。
[0037]圖6描述了三個(gè)SpA的B區(qū)突變體的核酸序列，其中第29位的甘氨酸被替換為亮氨酸、賴氨酸或精氨酸。SEQ ID NO: 13表示SpA突變體G29L的核酸序列；SEQ ID NO: 14表示SpA突變體G29K的核酸序列；以及SEQ IDNO: 15表示SpA突變體G29R的核酸序列。
[0038]圖7描述了三個(gè)SpA的B區(qū)突變體的氨基酸序列，其中第29位的甘氨酸被替換為亮氨酸、賴氨酸或精氨酸。SEQ ID NO: 16表示SpA的B區(qū)突變體G29L的氨基酸序列；SEQID NO: 17表示SpA的B區(qū)突變體G29K的氨基酸序列；以及SEQ ID NO: 18表示SpA的B區(qū)突變體G29R的氨基酸序列。
[0039]圖8描述了一個(gè)示例性的蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn),其中在大腸桿菌(E.Coli)BL21 (DE3)細(xì)胞中表達(dá)自載體PETlla:8620的蛋白A通過雞IgY抗-蛋白A抗體進(jìn)行檢測。
[0040]圖9描述了一個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其評(píng)價(jià)了免疫球蛋白的Fe和F(ab)2部分與單獨(dú)的鎳樹脂(陰性對(duì)照)的結(jié)合，或與MabSelect SuRe?層析介質(zhì)(陽性對(duì)照)的結(jié)合，繼而進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖所示。E表示層析后的洗脫物或結(jié)合的部分，S表示層析后的上清液或未結(jié)合的部分。自左至右:第I道表示分子量標(biāo)準(zhǔn);第2-5道表示F(ab)2(第2(E)、3⑶道)或Fe(第4(E)、5⑶道)與鎳樹脂的結(jié)合；第6_9道表示F (ab) 2 (第6 (S)、7(E)道)或Fe(第8(S)、9(E)道)與MabSelect SuRe?的結(jié)合；第10和11道表示單獨(dú)的F(ab) 2和Fe。F(ab) 2作為二聚體在SDS-PAGE上大約為18和20kDa，F(xiàn)c在SDS-PAGE上大約為22kDa。如第2(E)和4(E)道分別所示，F(xiàn)(ab)2和Fe都表現(xiàn)出與鎳樹脂(陰性對(duì)照)弱到無的結(jié)合活性。同樣，如第7(E)道所示，F(xiàn)(ab)2表現(xiàn)出能與MabSelect SuRe?結(jié)合，而Fe則表現(xiàn)出與MabSelect SuRe? (陽性對(duì)照)的顯著結(jié)合。
[0041]圖10描述了一個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其評(píng)價(jià)了免疫球蛋白的F(ab)2和Fe部分結(jié)合帶有組氨酸標(biāo)簽的野生型SpA(WtSpA),或結(jié)合帶有組氨酸標(biāo)簽的B-結(jié)構(gòu)域變體,該變體包括第29位上用丙氨酸取代甘氨酸(G29A)，其中使用鎳親和層析，繼而進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖所示。F表示蛋白A加樣；FT表示蛋白A流出物；S表示Fe或Fab結(jié)合步驟后的上清液(未結(jié)合的部分)；E表示洗脫部分(結(jié)合的部分)。自左至右:第I道表示分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道表示評(píng)價(jià)wt SpA與F(ab)2或Fe結(jié)合的實(shí)驗(yàn)中的F組分；第3_5道描述了在FT(第3道)、S(第4道)和E(第5道)組分中wt SpA與F (ab)2的結(jié)合；第6-8道描述了在FT(第6道)、S(第7道)和E(第8道)組分中wt SpA與Fe的結(jié)合；第9道表示評(píng)價(jià)G29A與F(ab)2*Fc結(jié)合的實(shí)驗(yàn)中的F組分；第10-12道表示在FT (第10道)、S(第11道)和E(第12道)組分中G29A與F(ab)2的結(jié)合?’第13-15道表示在FT(第13道)、S(第14道)和E(第15道)組分中G29A與Fe的結(jié)合。
[0042]圖11描述了一個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其評(píng)價(jià)了免疫球蛋白的F(ab)2和Fe部分結(jié)合帶有組氨酸標(biāo)簽的B-結(jié)構(gòu)域變體，該變體包括第29位上用亮氨酸取代甘氨酸(G29L)，其中使用鎳親和層析，繼而進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖所示。F表示蛋白A加樣；FT表示蛋白A流出物；S表示Fe或Fab結(jié)合步驟后的上清液(未結(jié)合的部分)；E表示洗脫部分(結(jié)合的部分)。自左至右:第I道表示分子量標(biāo)準(zhǔn);第2道表示F組分；第3-5道描述了在FT (第3道)、S(第4道)和E(第5道)組分中F (ab) 2與G29L的結(jié)合；第6-8道表示在FT (第6道)、S(第7道)和E(第8道)組分中Fe與G29L的結(jié)合。
[0043]圖12描述了一個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其評(píng)價(jià)了免疫球蛋白的F(ab)2和Fe部分結(jié)合帶有組氨酸標(biāo)簽的B-結(jié)構(gòu)域變體,該變體包括第29位上用賴氨酸取代甘氨酸(G29K)以及第29位上用精氨酸取代甘氨酸 (G29R)，其中使用鎳親和層析，繼而進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖所示。F表示蛋白A加樣；FT表示蛋白A流出物；S表示Fe或Fab結(jié)合步驟后的上清液(未結(jié)合的部分)；E表示洗脫部分(結(jié)合的部分)。自左至右:第I道表示分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2道表示表示評(píng)價(jià)G29K與F(ab)2或Fe結(jié)合的實(shí)驗(yàn)中的F組分；第3_5道表示在FT (第3道)、S(第4道)和E(第5道)組分中F(ab)2與6291(的結(jié)合；第6_8道表示在FT (第6道)、S(第7道)和E(第8道)組分中Fe與G29K的結(jié)合；第9道表示G29R與F(ab)2*Fe結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的F組分；第10-12道表示在FT(第10道)、S(第11道)和E(第12道)組分中G29R與F(ab)2的結(jié)合；第13-15道表示在FT (第13道)、S (第14道)和E (第15道)組分中G29R與Fe的結(jié)合。
[0044]圖13A-13E描述了一個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中使用表面等離子共振分析進(jìn)一步評(píng)價(jià)了本發(fā)明的SpA變體與免疫球蛋白的Fe部分的結(jié)合。這些附圖描述了濃度范圍45nM-185pM的Fe與對(duì)照組野生型蛋白A(圖13A)和G29A(圖13B)，以及與構(gòu)建體G29K(圖13C)、G29R(圖 13D)和 G29L(圖 13E)的結(jié)合。
[0045]圖14A-14E描述了一個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中使用表面等離子共振分析進(jìn)一步評(píng)價(jià)了本發(fā)明的SpA變體與免疫球蛋白的F(ab)2部分的結(jié)合。這些附圖描述了濃度范圍45nM-185pM的F(ab)2與各種蛋白A構(gòu)建體的結(jié)合。對(duì)于野生型蛋白A觀察到強(qiáng)的結(jié)合(圖14A)，對(duì)于G29A對(duì)照觀察到弱的結(jié)合(圖14B)。對(duì)于G29K(圖14C)、G29R(圖14D)和G29L(圖14E)沒有檢測到結(jié)合。
[0046]圖15A-15B描述了用于SpA層析樹脂的Fe和Fab脈沖實(shí)驗(yàn)的代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在圖15A中，F(xiàn)e的未結(jié)合部分出現(xiàn)于7個(gè)柱體積(CV)，結(jié)合的Fe洗脫出現(xiàn)于23CV。在圖15B中，F(xiàn)(ab)2的未結(jié)合部分出現(xiàn)于7CV，結(jié)合的Fe洗脫出現(xiàn)于23-25CV之間。
[0047]發(fā)明詳沭
[0048]至少在某種程度上，本發(fā)明提供SpA變體，其結(jié)合免疫球蛋白的Fab部分的親和性低于野生型SpA和之前所述的SpA變體，而保留與免疫球蛋白的Fe部分結(jié)合的能力。在一些實(shí)施方式中，在此所述的SpA變體結(jié)合免疫球蛋白的Fab部分的親和力高于第29位上具有丙氨酸的SpA。
[0049]1.定義
[0050]為了使當(dāng)前公開的內(nèi)容更容易理解，對(duì)一些術(shù)語進(jìn)行了首次定義。額外的定義貫穿于詳細(xì)描述中。
[0051 ] 在此所使用的，術(shù)語“免疫球蛋白結(jié)合蛋白”指一種“SpA”或“金黃色葡萄球菌蛋白A”的氨基酸序列變體，包括一個(gè)或多個(gè)修飾的SpA結(jié)構(gòu)域(例如，一種或多種修飾的E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域)，其相對(duì)于野生型SpA(wt SpA)或已知的變體SpA結(jié)構(gòu)域(例如,Z結(jié)構(gòu)域)，表現(xiàn)出降低的結(jié)合免疫球蛋白Fab部分或Ig分子的結(jié)合活性。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合蛋白包括一個(gè)或多個(gè)修飾的E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括對(duì)第29位的氨基酸進(jìn)行替換。對(duì)于E、D、A、B或C結(jié)構(gòu)域而言，第29位的甘氨酸被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸；對(duì)于結(jié)構(gòu)域Z而言，第29位的丙氨酸被替換為除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，第29位的甘氨酸被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸，第29位的丙氨酸被替換為除甘氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，變體的氨基酸序列可以不同于作為其衍生來源的親代氨基酸序列，其中在親代氨基酸序列的任何位置進(jìn)行替換、刪除和/或插入一種或多種氨基酸，且包括至少在第29位進(jìn)行氨基酸殘基的替換。在一些實(shí)施方式中，氨基酸序列變體相對(duì)于親代序列(即wt SpA結(jié)構(gòu)域或Z結(jié)構(gòu)域)具有至少大約70%,或至少大約80%,或至少大約85 %，或至少大約90 %，或至少大約95 %，或至少大約96 %，或至少大約97 %，或至少大約98%的同一性，其中所述變體結(jié)合免疫球蛋白的Fe部分，然而，其相對(duì)于在第29位包括甘氨酸或丙氨酸的SpA氨基酸序列，表現(xiàn)出與免疫球蛋白的Fab部分的降低的結(jié)合活性。
[0052]在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，第29位的甘氨酸或丙氨酸被蘇氨酸或色氨酸所取代，其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白能夠結(jié)合免疫球蛋白的Fe部分，且相對(duì)于在第29位包括丙氨酸的SpA氨基酸序列，表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分增強(qiáng)的結(jié)合活性。
[0053]術(shù)語“序列同一性”表示對(duì)于兩個(gè)核苷酸或兩個(gè)氨基酸序列，當(dāng)使用缺省空位權(quán)重通過例如GAP或BESTFIT等程序進(jìn)行最優(yōu)化對(duì)齊的時(shí)候，具有至少70%序列同一性，或至少80%序列同一性，或至少85%序列同一性，或至少90%序列同一性，或至少95%或以上的序列同一性。對(duì)于序列對(duì)比，一般采用一個(gè)序列作為參考序列(例如，親代序列)，將待測序列與其進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)使用序列比對(duì)算法時(shí)，將待測和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要的話指定相應(yīng)的亞序列，然后指定序列算法程序參數(shù)。接下來序列比對(duì)算法根據(jù)指定的程序參數(shù)計(jì)算得出待測序列(們)相對(duì)于參考序列的序列同一性百分比。
[0054]用于比較的最佳序列比對(duì)可以通過例如Smith和Waterman的局部同源性算法得出，Adv.App1.Math.2:482 (1981)，或由Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法得出，J.Mol.B1l.48:443 (1970)，或由 Pearson 和 Lipman 的相似性查找方法得出，Proc.Natl.Acad Sc1.USA 85:2444 (1988),或由這些算法的計(jì)算機(jī)化運(yùn)行得出(威斯康星遺傳軟件包(the Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA,遺傳計(jì)算機(jī)小組(Genetics Computer Group), 575Science Dr.，Madison,威斯康星)，或由目測方法得出(大致參見 Ausubel 等,Current Protocols in Molecular B1logy)。適用于測定序列同一性和序列相似性的一個(gè)算法的例子是BLAST算法，其記載于Altschul等，J.Mol.B1l.215:403(1990)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可以通過國家生物技術(shù)信息中心(Nat1nalCenter for B1technology Informat1n)為公眾所獲得(通過登錄國家健康研究所(Nat1nal Institutes of Health)NCBI網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)入)。一般的,可以使用缺省程序參數(shù)進(jìn)行序列比對(duì)，雖然也可以使用設(shè)定的參數(shù)。對(duì)于氨基酸序列，BLAST程序使用缺省的字長(W)為 3，期望值(E)為 10，以及 BL0SUM62 分?jǐn)?shù)矩陣(參見 Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915 (1989))。
[0055]在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合蛋白是基于分離的WtSpA的結(jié)構(gòu)域(即，E、D、A、B或C)，其包括至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基，其中相對(duì)于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，所述免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)Ig分子的Fab部分降低的結(jié)合活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合蛋白是基于SpA的Z結(jié)構(gòu)域，其包括至少第29位的丙氨酸殘基被替換為除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第29位的甘氨酸殘基(即，對(duì)于E、D、A、B和C結(jié)構(gòu)域而言)被替換為除丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸外的氨基酸殘基，或第29位的丙氨酸殘基(即，對(duì)于Z結(jié)構(gòu)域而言)被替換為除甘氨酸、蘇氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基，其中相對(duì)于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，所述免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)Ig分子的Fab部分降低的結(jié)合活性。
[0056]在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合蛋白包括至少兩個(gè)或以上，或至少三個(gè)或以上，或至少四個(gè)或以上，或至少五個(gè)或以上所述的E、D、A、B、C和Z結(jié)構(gòu)域，其中所述的每個(gè)兩個(gè)或以上，或三個(gè)或以上，或四個(gè)或以上，或五個(gè)或以上的結(jié)構(gòu)域包括至少第29位的甘氨酸(例如，對(duì)結(jié)構(gòu)域E、D、A、B和C而言)或丙氨酸(對(duì)Z結(jié)構(gòu)域而言)被替換為除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基，且其中相對(duì)于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，所述免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)Ig分子的Fab部分降低的結(jié)合活性。
[0057]在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合蛋白包括相同結(jié)構(gòu)域的多聚體(例如，兩個(gè)或以上的E區(qū)；兩個(gè)或以上的D區(qū)；兩個(gè)或以上的A區(qū)；兩個(gè)或以上的B區(qū)；兩個(gè)或以上的C區(qū)；以及兩個(gè)或以上的Z區(qū))，其中任何一個(gè)單體包括至少第29位的甘氨酸或丙氨酸被替換為除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基，其中相對(duì)于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，所述免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)Ig分子的Fab部分降低的結(jié)合活性。
[0058]替代第29位甘氨酸或丙氨酸的合適的氨基酸包括任何標(biāo)準(zhǔn)的天然產(chǎn)生的氨基酸，但不包括甘氨酸、丙氨酸和色氨酸，且在特定的實(shí)施方式中，不包括甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸。在一些實(shí)施方式中，所述天然產(chǎn)生的氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和亮氨酸之一。在其它的實(shí)施方式中，所述天然產(chǎn)生的氨基酸包括賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、絲氨酸、纈氨酸和酪氨酸之一。本領(lǐng)域所熟知的非天然產(chǎn)生的氨基酸和氨基酸衍生物同樣可以被用于替代第29位的甘氨酸或丙氨酸。
[0059]示例性的SpA結(jié)構(gòu)域修飾如表1所示。本發(fā)明所包括的免疫球蛋白結(jié)合蛋白可以包括任何下列組合:一個(gè)或以上，兩個(gè)或以上，三個(gè)或以上，四個(gè)或以上，五個(gè)或以上，或六個(gè)或以上的結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B、C和Z)，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括對(duì)第29位的修飾，且其中第29位的甘氨酸或丙氨酸被替換為除甘氨酸、丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基，且在一些實(shí)施方式中，被替換為除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸以外的氨基酸殘基。本發(fā)明還涵蓋了包括兩個(gè)或以上相同種類的結(jié)構(gòu)域(例如，兩個(gè)或以上E區(qū)；兩個(gè)或以上D區(qū)；兩個(gè)或以上A區(qū)；兩個(gè)或以上B區(qū)；兩個(gè)或以上C區(qū)；以及兩個(gè)或以上Z區(qū))的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中每個(gè)區(qū)包括對(duì)第29位的修飾，其中第29位的氨基酸殘基被替換為除甘氨酸、丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸殘基，且在一些實(shí)施方式中，被替換為除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸以外的氨基酸殘基。
[0060]表1
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，包含一個(gè)或多個(gè)分離的葡萄球菌(Staphyloccocus)蛋白A的E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域,所述一種或多種分離的結(jié)構(gòu)域中包括:(i)當(dāng)所述結(jié)構(gòu)域?yàn)镋、D、A、B或C結(jié)構(gòu)域時(shí)，至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸或色氨酸外的氨基酸殘基；或(ii)當(dāng)結(jié)構(gòu)域?yàn)閆結(jié)構(gòu)域時(shí)，至少第29位的丙氨酸被替換為除甘氨酸或色氨酸外的氨基酸，其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白與免疫球蛋白的Fe部分結(jié)合，而相對(duì)于第29位處包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白Fab部分的降低的結(jié)合。
2.權(quán)利要求1中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中除丙氨酸、甘氨酸或色氨酸外的氨基酸選自由下列氨基酸組成的組:亮氨酸，賴氨酸和精氨酸。
3.權(quán)利要求1中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸以外的氨基酸殘基，或至少第29位的丙氨酸被替換為除甘氨酸、色氨酸和蘇氨酸以外的氨基酸。
4.權(quán)利要求1中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中至少第29位的甘氨酸殘基或第29位的丙氨酸被替換為選自由下列氨基酸組成的組的氨基酸:賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、纈氨酸和酪氨酸。
5.權(quán)利要求1中的分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，進(jìn)一步包含葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A的羧基端結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
6.一種層析基質(zhì)，包含偶聯(lián)于固體載體的權(quán)利要求1所述的分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。
7.一種多肽文庫，包含權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。
8.權(quán)利要求1中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，進(jìn)一步包含在一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域中用其它氨基酸殘基對(duì)天冬酰胺的替換。
9.權(quán)利要求8中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中天冬酰胺在第23位。
10.權(quán)利要求1中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中所述的免疫球蛋白是IgG或其片段。
11.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。
12.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11所述的核酸分子。
13.一種從樣品中親和純化一種或多種免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: (a)提供包含一種或多種免疫球蛋白的樣品； (b)在使得所述的一種或多種免疫球蛋白與權(quán)利要求6的基質(zhì)結(jié)合的條件下使樣品接觸所述基質(zhì)；和 (C)通過在適宜的條件下進(jìn)行洗脫，回收所述的一種或多種結(jié)合的免疫球蛋白。
14.一種分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，包含一個(gè)或多個(gè)分離的葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域包括:(i)當(dāng)所述結(jié)構(gòu)域是E、D、A、B或C結(jié)構(gòu)域時(shí)，至少第29位的甘氨酸殘基被替換為除丙氨酸以外的氨基酸殘基；或(ii)當(dāng)所述結(jié)構(gòu)域是Z結(jié)構(gòu)域的時(shí)候，至少第29位的丙氨酸殘基被替換為除甘氨酸外的氨基酸殘基，其中免疫球蛋白結(jié)合蛋白與免疫球蛋白的Fe部分結(jié)合，且相對(duì)于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白結(jié)合蛋白表現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白的Fab部分增加的結(jié)合。
15.權(quán)利要求14中的分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中至少第29位的甘氨酸或第29位的丙氨酸被替換為蘇氨酸或色氨酸。
16.一種層析基質(zhì)，包括偶聯(lián)于固體載體的權(quán)利要求14所述的分離的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。
17.一種從樣品中親和純化一種或多種免疫球蛋白的方法，該方法包括以下步驟: (a)提供包括一種或多種免疫球蛋白的樣品； (b)在使得所述的一種或多種免疫球蛋白與權(quán)利要求16的基質(zhì)結(jié)合的條件下使樣品接觸所述基質(zhì)；和 (C)通過在適宜的條件下進(jìn)行洗脫，回收所述一種或多種結(jié)合的免疫球蛋白。
18.權(quán)利要求14中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中所述免疫球蛋白選自由IgG、IgA或IgM、或它們的片段所組成的組。
19.權(quán)利要求1中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中所述免疫球蛋白的Fe部分是Fe融合蛋白的一部分。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104163866SQ201410389062
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2008年8月11日
【發(fā)明者】S·斯佩克特 申請(qǐng)人:Emd密理博公司