一種基于羅丹明衍生物的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)亞硝酰氫的熒光探針的制作方法

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)亞硝酰氫的新型羅丹明類熒光探針，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

亞硝酰氫（hno）是一氧化氮的單電子還原質(zhì)子化產(chǎn)物，并在生物體內(nèi)具有和一氧化氮截然不同的生理和藥理作用。hno在正常濃度下，可在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用。例如，hno可以激發(fā)動(dòng)物血管系統(tǒng)中電壓控制的鉀離子通道，能夠直接與生物體系內(nèi)的硫醇等抗氧化劑直接發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控生物體內(nèi)的氧化/還原環(huán)境。hno還可增加正常及心力衰竭時(shí)心肌的收縮力，同時(shí)改善心肌的舒張功能。由于心力衰竭以心肌收縮力下降為主要特征，而目前臨床仍然缺少理想的治療藥物，由此看來，hno可能是一種潛在具有治療心肌衰竭的理想藥物。此外，hno可以抑制血小板聚集，以及抑制乙醛脫氫酶。因此，實(shí)時(shí)檢測(cè)生物體內(nèi)的hno水平和分布，對(duì)于深入討論hno生物藥理作用具有很重要的意義。

傳統(tǒng)的hno檢測(cè)方法主要有電化學(xué)法、電子自旋共振波譜法、化學(xué)發(fā)光法和比色法等，但這些方法操作較為復(fù)雜，且很難進(jìn)行實(shí)時(shí)原位檢測(cè)，不適合直接用于檢測(cè)生物體系內(nèi)的原位檢測(cè)。相比于這些方法，熒光成像法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、選擇性好、非侵入性等特點(diǎn)，而且還能進(jìn)行原位實(shí)時(shí)監(jiān)控和觀察。相比于單光子成像，雙光子熒光成像具有近紅外（650~900nm）激發(fā)、低背景干擾成像、低熒光漂白和光致毒、高橫向分辨率與縱向分辨率、低生物組織吸等特點(diǎn)，可為生命科學(xué)研究提供了更為銳利的工具。同時(shí)，相比于藍(lán)色和綠色熒光團(tuán)，紅色熒光團(tuán)所發(fā)射的紅色熒光具有較低能量，可以更為有效地降低生物組織吸收和自發(fā)熒光干擾。目前，所開發(fā)的雙光子hno熒光探針大都具有藍(lán)色或綠色熒光發(fā)射，而具有紅色熒光發(fā)射的雙光子hno熒光探針未見報(bào)道。因此開發(fā)新的具有高選擇性、高靈敏度、光穩(wěn)定性及透膜性好，能夠?qū)崟r(shí)快速檢測(cè)生物體內(nèi)亞硝酰氫，且具有雙光子紅色熒光發(fā)射的熒光探針具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種新型檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的新型檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針為羅丹明衍生物，其特征在于：所述熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式（）所示，其中三苯基膦部分為hno的響應(yīng)位點(diǎn)：

式（）。

本發(fā)明所述的熒光探針的制備方法為：將式（ⅱ）所示的化合物(1mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（2mmol）、4-二甲氨基吡啶（2.2mmol）和二氯甲烷(5ml)加入到50ml單口燒瓶中，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，過濾，烘干。將所得固體進(jìn)行柱層析純化，得到白色的產(chǎn)物即為本發(fā)明所述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針。

式（ⅱ）。

本發(fā)明所述的熒光探針在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的熒光探針可應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)hno的檢測(cè)評(píng)價(jià)。該探針作為細(xì)胞內(nèi)hno的特異性探針，在hno存在的環(huán)境下，基于斯陶丁格反應(yīng)，可以將三苯基膦部分轉(zhuǎn)化為羥基，生成具有高熒光發(fā)射能力的熒光物質(zhì)，通過檢測(cè)不同的熒光強(qiáng)度來測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的hno。

具體測(cè)定方法為：室溫條件下，配制5μm熒光探針甲醇溶液，加入到具有不同濃度的hno溶液系中，測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度作為hno濃度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本發(fā)明所述的熒光探針在hno存在的條件下，羅丹明衍生物染料部分的三苯基膦部分轉(zhuǎn)化為羥基，此時(shí)該分子可以發(fā)射強(qiáng)烈的紅色熒光（峰值約為638nm）。檢測(cè)該探針加入hno時(shí)的雙光子吸收截面，探討該探針的雙光子性質(zhì)。采用熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的快速靈敏檢測(cè)；檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)為580nm，在590~700nm之間進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的檢測(cè)。

熒光探針在生物成像應(yīng)用研究主要內(nèi)容包括該探針對(duì)活細(xì)胞的毒性、膜穿透能力、染色能力、活細(xì)胞的熒光成像。采用mtt比色法，通過分析細(xì)胞在加入熒光探針之后的存活率，討論熒光探針對(duì)活細(xì)胞的生物毒性。在此基礎(chǔ)上，將本發(fā)明所述的熒光探針對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的hno通過熒光成像進(jìn)行快速檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明所述的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針可經(jīng)化學(xué)方法合成，制備工藝簡(jiǎn)單易行，原料廉價(jià)易得，制備成本低，易于推廣。

本發(fā)明所述的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針具有高特異性，在進(jìn)行相應(yīng)hno檢測(cè)過程中基本不受其他組分的干擾，可用于活細(xì)胞內(nèi)hno的實(shí)時(shí)測(cè)定，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明所述的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針靈敏度高，具有良好的熒光發(fā)射光譜特性（590~700nm），可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞中的hno快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。

附圖說明

圖1是熒光探針的¹hnmr圖譜；

圖2是熒光探針在不同濃度hno條件下的熒光光譜；

圖3是熒光探針與hno濃度的線性關(guān)系數(shù)據(jù)；

圖4是熒光探針與不同物質(zhì)反應(yīng)后的熒光光譜；

圖5是熒光探針加入hno時(shí)的雙光子吸收截面；

圖6是熒光探針在活細(xì)胞中的成像應(yīng)用。

a圖：只加10μm探針的細(xì)胞明場(chǎng)照片；b圖：只加10μm探針的細(xì)胞紅色通道熒光照片；c圖：a圖和b圖的疊加照片；d圖：只加10μm探針的雙光子細(xì)胞紅色通道熒光照片；e圖：加入10μm探針和100μmhno的細(xì)胞明場(chǎng)照片；f圖：加入10μm探針和100μmhno的細(xì)胞紅色通道熒光照片；g圖：d圖和e圖的疊加照片；h圖：加入10μm探針和100μmhno的雙光子細(xì)胞紅色通道熒光照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)內(nèi)容不僅限于此。

實(shí)施例1

本發(fā)明所述檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針的制備

將式（ⅱ）所示的化合物(1mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（2mmol）、4-二甲氨基吡啶（2.2mmol）和二氯甲烷(5ml)加入到50ml單口燒瓶中，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，冷卻至室溫，加入到水中，過濾，烘干。將所得固體進(jìn)行柱層析(二氯甲烷:甲醇=15:1)純化，得到白色產(chǎn)物，即為本發(fā)明所述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針，產(chǎn)率33%。

上述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hno的熒光探針的¹hnmr圖譜見圖1。

實(shí)施例2

本發(fā)明所述熒光探針在不同hno濃度下的熒光光譜

本專利采用hno在水溶液中供應(yīng)hno。預(yù)先準(zhǔn)備10份5ml的5μm探針緩沖溶液，含5%甲醇，所加入的hno濃度為0到100μm。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)（λex=580nm）；計(jì)算各體系中熒光強(qiáng)度；通過分析638nm處的熒光強(qiáng)度與hno濃度的關(guān)系，評(píng)估該探針對(duì)hno的響應(yīng)性能（見圖2和圖3）。圖2表明，隨著hno濃度的增大，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。圖3表明，當(dāng)hno濃度在0~60μm范圍內(nèi)，溶液的熒光強(qiáng)度和hno的濃度呈較好的線性關(guān)系，可采用公式y(tǒng)=4.34*x+7.50表示，其中y為638nm出的熒光強(qiáng)度，x為hno的濃度。

實(shí)施例3

熒光探針與不同物質(zhì)反應(yīng)后的熒光光譜

預(yù)先準(zhǔn)備10份5ml的5μm探針緩沖溶液(含5%甲醇，ph=7.4)，然后分別向該體系中依次加入50μl濃度為200μm的hcys、no、h2o2、naclo、cys、gsh、nano2、vc等小分子的pbs溶液。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)（λex=580nm）；計(jì)算各體系中熒光強(qiáng)度；評(píng)估該不同物質(zhì)對(duì)熒光探針溶液的干擾性（見圖4）。從圖中看出，當(dāng)然探針溶液中加入hcys、no、h2o2、naclo、cys、gsh、nano2、vc等小分子時(shí)，只有hno可以導(dǎo)致溶液產(chǎn)生顯著的熒光，而加入其他小分子時(shí)溶液的熒光基本沒有變化，這表示該探針只對(duì)hno有響應(yīng)，而基本不受其他小分子的干擾。此外，檢測(cè)探針加入hno之后的雙光子吸收截面（見圖5）。從圖中看出，該探針可通過雙光子熒光對(duì)hno進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例4

熒光探針在活細(xì)胞中的成像應(yīng)用

將hela細(xì)胞放在培養(yǎng)基(dmem培養(yǎng)液和10%胎牛血清)中，放置于條件為37℃、5%co2和20%o2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。用微量進(jìn)樣器吸取本發(fā)明所述熒光探針(10μm)注入含有hela細(xì)胞的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。加入100μμhno溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30min。之后用pbs(磷酸鹽緩沖溶液)沖洗培養(yǎng)細(xì)胞3次，進(jìn)行熒光成像。

結(jié)果見圖6。從a、b、c和d圖中看出，只加入探針時(shí)，細(xì)胞基本無熒光；從e、f、g和h圖中看出，加入10μm和100μmhno探針，細(xì)胞有明顯的紅色熒光產(chǎn)生，這表示該探針可通過雙光子成像檢測(cè)細(xì)胞中的hno。