利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法與流程

本發(fā)明涉及一種利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法。

本發(fā)明還涉及由此方法而制得的衍生物。

背景技術(shù)：

氨基酚類一般是制造糖類化合物衍生物的重要中間產(chǎn)物，同時(shí)也在制造染料及其他藥物的中間化學(xué)體時(shí)使用。此外，4-氨基苯酚在代謝過(guò)程中的容易氧化成細(xì)胞毒性物質(zhì)，會(huì)引起腎臟鄰近血管的多種疾病。(Lock etc., Studies on the mechanism of 4-aminophenol-induced toxicity to renal proximal tubules. Hum. Exp.Toxicol. 12(5), 383-388, 1993.)

現(xiàn)有技術(shù)中已對(duì)4-氨基苯酚衍生物的有機(jī)合成方法進(jìn)行了一定的研究。例如，4-[2-(5-甲基)]-氨基噻唑-2，3-D-tert-丁基酚（日本專利，專利號(hào)：67023/1987）和3-甲基-4-羥基-5-n-丙烯-7-氟苯并呋喃（日本專利，專利號(hào)：53980/1987）是以2-乙氧甲?；蛘?-甲酸芐酯作為誘導(dǎo)前體合成的。而且，上述兩種化合物是制備治療哮喘等過(guò)敏性疾病藥物的有效成分。同時(shí)，2，6-二氯-4-氨基苯酚衍生物和2，6-二氯-4-（3，4，5-三甲氧基苯甲酰）氨基苯酚衍生物被認(rèn)為是具有免疫活性的優(yōu)良物質(zhì)，并且能有效抵抗PCA（過(guò)敏反應(yīng)）（日本專利 專利號(hào)：271268/1986）。另外，4-（十二烷基氨基苯酚）-2-乙二醇-6-tert-丁基酚，4-（十八烷基氨基苯酚）-2，6-D-tert-丁基酚被認(rèn)為是具有良好的防止酸化的活性，同時(shí)也是有顯著效果的穩(wěn)定劑（日本專利 專利號(hào)：24782/1971）。

氨基酚類物質(zhì)在食品、化妝品、醫(yī)藥品行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，然而這類物質(zhì)往往具有水溶解性低，易被光或熱分解或氧化生成有毒化合物質(zhì)等缺點(diǎn)。因此，為了提高這類化合物的功能性，改善并增強(qiáng)其穩(wěn)定性成為研究的熱點(diǎn)。

此外，已知對(duì)苯二酚和熊果苷具有良好的美白效果，通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性來(lái)抑制黑色素的生成，因而可改善雀斑和皮膚老化等問(wèn)題。然而，這類活性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的功能性存在一定損傷，會(huì)產(chǎn)生副作用。因此，本發(fā)明的目的是尋求新的合成方法制備酪氨酸酶抑制劑對(duì)苯二酚和熊果苷的衍生物，使其在細(xì)胞內(nèi)能夠穩(wěn)定地發(fā)揮作用而避免副作用的產(chǎn)生。嘗試的方法包括化學(xué)方法（Wang etc. A new synthesis of α-arbutin via Lewis acid catalyzed selective glycosylation of tetra-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl trichloroacetimidate with hydroquinone, 341, 1945-1947, 2006）和酶合成方法（Sugimoto etc. Enzymatic Synthesis of α-arbutin by α-anomer-selective glucosylation of hydroquinone using lyophilized cells of xanthomonas campestris WU-9701, 93, 328-330, 2002; Sugimoto etc. Synthesis of α-arbutin-α-glycosides and their inhibitory effects on human tyrosinase, 99, 272-276, 2005）。但是，由于制備合成α-1~4結(jié)構(gòu)物質(zhì)的淀粉酶價(jià)格過(guò)于昂貴。

因此，需要提供一種新的技術(shù)方案來(lái)解決上述問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種由此方法而制得的衍生物。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法，包括以下步驟：在含糖濃度為0.1-1M的溶液中添加糖基轉(zhuǎn)移酶，使反應(yīng)釜的最終活性濃度達(dá)到0.1-3.0 U/mL后，然后在15-50℃的反應(yīng)釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，對(duì)苯二酚及熊果苷構(gòu)成的組中所選擇的至少一種的糖基受體，使最終活性濃度達(dá)到質(zhì)量百分含量0.01-3%并使其反應(yīng)，反應(yīng)是在28-37℃下經(jīng)過(guò)1-18小時(shí)而形成的，糖的葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移到上述的受體中最后經(jīng)醋酸酸化可得到糖類化合物衍生物。注意，上述反應(yīng)中糖會(huì)在15-50℃的條件下進(jìn)行分解，而處于28-37℃的條件下時(shí)，在1-18小時(shí)內(nèi)是不完全分解的。

進(jìn)一步的，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是由葡聚糖蔗糖酶及果聚糖蔗糖酶形成族群中選擇出來(lái)的。

進(jìn)一步的，所述葡聚糖蔗糖酶是從腸系膜明串珠菌菌株或銀耳菌絲體中獲取的；將其接種到含有K₂HPO₄和糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)人工發(fā)酵培養(yǎng)后得到菌液，將上述菌液進(jìn)行分離純化，采用離子交換色譜的方式得到葡聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前獲得該酶的通用方法。

葡聚糖蔗糖酶可從腸系膜明串珠菌NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-512, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中獲得，但本發(fā)明選用的是腸系膜明串珠菌(Leuconostoc mensenteroides) NRRL B-1299菌株。

所述果聚糖蔗糖酶是從腸系膜明串珠菌菌株中獲取的。將該菌株其接種到含有K₂HPO₄和糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)人工發(fā)酵培養(yǎng)后得到菌液，將上述菌液進(jìn)行分離純化，采用離子交換色譜的方式得到果聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前獲得該酶的通用方法。

果聚糖蔗糖酶可從腸系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830), NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中獲得，但本發(fā)明選用的是腸系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830)菌株。

進(jìn)一步的，糖基轉(zhuǎn)移酶是果聚糖蔗糖酶時(shí)，糖的果糖基轉(zhuǎn)移到上述糖的受體中；糖基轉(zhuǎn)移酶是葡聚糖蔗糖酶時(shí)，糖的葡萄糖轉(zhuǎn)移到上述糖的受體中。

進(jìn)一步的，添加的糖基轉(zhuǎn)移酶使反應(yīng)釜的最終活性濃度達(dá)到0.5-2.0 U/mL。

利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法制得的衍生物，糖的受體是N-氨基酸時(shí)，生成N-氨基酸衍生物，N的取值2-4。

進(jìn)一步的，糖基轉(zhuǎn)移酶是葡聚糖蔗糖酶，上述的糖的受體是對(duì)苯二酚時(shí)，生成下述化學(xué)式Ⅳ的對(duì)苯二酚衍生物。

進(jìn)一步的，糖基轉(zhuǎn)移酶是果聚糖蔗糖酶，上述的糖的受體是對(duì)苯二酚時(shí)，生成下述化學(xué)式Ⅴ的對(duì)苯二酚衍生物。

進(jìn)一步的，糖基轉(zhuǎn)移酶是葡聚糖蔗糖酶，糖的受體是熊果苷時(shí)，生成下述化學(xué)式Ⅵ的熊果苷衍生物。

進(jìn)一步的，生成的熊果苷衍生物經(jīng)醋酸酸化以后可生成下述化學(xué)式Ⅹ的五乙酰熊果苷。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明中選取2-氨基苯酚、3-氨基苯酚、4-氨基苯酚、對(duì)苯二酚及熊果苷等物質(zhì)作為糖受體，在葡聚糖蔗糖酶以及果聚糖蔗糖酶的催化作用下，利用反應(yīng)基質(zhì)中擴(kuò)散分布的糖，使得選取的受糖體與糖發(fā)生反應(yīng)，形成新的化合物。反應(yīng)所得到的衍生物，其水溶解性以及光、熱穩(wěn)定性均得以加強(qiáng)，功能性質(zhì)得到改善，在食品添加劑、化妝品、醫(yī)藥品以及老年癡呆的治療等方面體現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為蔗糖溶液中，不同種類的氨基苯酚誘導(dǎo)物在葡聚糖這趟作用下反應(yīng)所得產(chǎn)物的TLC分析的物質(zhì)分布結(jié)果圖。

其中，S為蔗糖；F為果糖。

條帶1，0.3M蔗糖+ 2-aminophenol + L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶；條帶2，0.3M蔗糖+ 3-aminophenol + L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶；條帶3，0.3M 蔗糖+ 4-aminophenol +L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶。

圖2 對(duì)苯二酚在葡聚糖蔗糖酶作用下生成物質(zhì)的TLC分析結(jié)果圖。

其中，S為蔗糖；F為果糖。

條帶1，對(duì)苯二酚；

條帶2，0.3M蔗糖+緩沖液+ L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶；

條帶3，0.3M蔗糖+對(duì)苯二酚+ L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶。

圖3 對(duì)苯二酚在果聚糖蔗糖酶作用下生成物質(zhì)的TLC分析結(jié)果圖。

其中，S為蔗糖；F為果糖。

條帶1，對(duì)苯二酚；條帶2, 0.3M蔗糖+緩沖液+L. mesenteroides NRRL 512 果聚糖蔗糖酶；條帶3, 0.3M蔗糖+對(duì)苯二酚+L. mesenteroides NRRL 512 果聚糖蔗糖酶。

圖4 熊果苷在葡聚糖蔗糖酶的作用下得到產(chǎn)物的TLC分析結(jié)果圖。

其中，S為蔗糖；F為果糖。

條帶1，0.3M 蔗糖+ 緩沖溶液+ L. mesenteroides NRRL 1299葡聚糖蔗糖酶；條帶2，0.3M 蔗糖 +熊果苷 + L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶。

圖5 本反應(yīng)中的熊果苷與糖類物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果分析圖。

條帶1，果糖；條帶2，酶反應(yīng)物（無(wú)熊果苷）；條帶3，酶反應(yīng)物（有熊果苷）；條帶4，熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品；上述色譜分析結(jié)果用箭頭標(biāo)明物質(zhì)。

圖6a這個(gè)發(fā)明實(shí)例中得到的經(jīng)提純后的分離物質(zhì)熊果苷-G1的HPLC色譜分析圖譜圖。

圖6b這個(gè)發(fā)明實(shí)例中得到的經(jīng)提純后的分離物質(zhì)熊果苷-G2的HPLC色譜分析圖譜圖。

具體實(shí)施方式

為了加深對(duì)本發(fā)明的理解，下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的限定。

下面實(shí)施例1-4是方法的實(shí)施例。

實(shí)施例1

本發(fā)明的利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法，包括以下步驟：在含糖濃度為0.1M的溶液中添加糖基轉(zhuǎn)移酶，使反應(yīng)釜的最終活性濃度達(dá)到0.1U/mL后，然后在15℃的反應(yīng)釜里添加2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，對(duì)苯二酚及熊果苷構(gòu)成的組中所選擇的至少一種的糖基受體，使最終活性濃度達(dá)到質(zhì)量百分含量0.01-3%并使其反應(yīng)，反應(yīng)是在28℃下經(jīng)過(guò)1小時(shí)而形成的，糖的葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移到上述的受體中最后經(jīng)醋酸酸化可得到糖類化合物衍生物。

實(shí)施例2

利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法，包括以下步驟：在含糖濃度為0.3M的溶液中添加糖基轉(zhuǎn)移酶，使反應(yīng)釜的最終活性濃度達(dá)到0.5 U/mL后，然后在20℃的反應(yīng)釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，對(duì)苯二酚及熊果苷構(gòu)成的組中所選擇的至少一種的糖基受體，使最終活性濃度達(dá)到質(zhì)量百分含量0.01-3%并使其反應(yīng)，反應(yīng)是在32℃下經(jīng)過(guò)8小時(shí)而形成的，糖的葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移到上述受體中最后經(jīng)醋酸酸化可得到糖類化合物衍生物。

實(shí)施例3

本發(fā)明的利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法，包括以下步驟：在含糖濃度為0.5M的溶液中添加糖基轉(zhuǎn)移酶，使反應(yīng)釜的最終活性濃度達(dá)到2.0 U/mL后，然后在25℃的反應(yīng)釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，對(duì)苯二酚及熊果苷構(gòu)成的組中所選擇的至少一種的糖基受體，使最終活性濃度達(dá)到質(zhì)量百分含量0.01-3%并使其反應(yīng)，反應(yīng)是在34℃下經(jīng)過(guò)10小時(shí)而形成的，糖的葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移到上述的受體中最后經(jīng)醋酸酸化可得到糖類化合物衍生物。

實(shí)施例4

本發(fā)明的利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法，包括以下步驟：在含糖濃度為1M的溶液中添加糖基轉(zhuǎn)移酶，使反應(yīng)釜的最終活性濃度達(dá)到3.0 U/mL后，然后在50℃的反應(yīng)釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，對(duì)苯二酚及熊果苷構(gòu)成的組中所選擇的至少一種的糖基受體，使最終活性濃度達(dá)到質(zhì)量百分含量0.01-3%并使其反應(yīng)，反應(yīng)是在37℃下經(jīng)過(guò)18小時(shí)而形成的，糖的葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移到上述的受體中最后經(jīng)醋酸酸化可得到糖類化合物衍生物。

糖基轉(zhuǎn)移酶是由葡聚糖蔗糖酶及果聚糖蔗糖酶形成族群中選擇出來(lái)的。

糖基轉(zhuǎn)移酶是果聚糖蔗糖酶時(shí)，糖的果糖基轉(zhuǎn)移到上述糖的受體中；糖基轉(zhuǎn)移酶是葡聚糖蔗糖酶時(shí)，糖的葡萄糖轉(zhuǎn)移到上述糖的受體中。

上述受糖體反應(yīng)結(jié)束后所生成衍生物混合物經(jīng)由凝膠滲透色譜層析柱（Gel permeation chromatography）進(jìn)行初步分離，再用專用于右旋糖苷的P-2以及LH-20色度分析柱進(jìn)行凝膠滲透色譜層析。然后，利用高效液相色譜(High performance Liquid Chromatography)將各受糖體的衍生物單獨(dú)分離出來(lái)。接著，利用核磁共振（NMR）和間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOP）等技術(shù)對(duì)各精制的糖類化合物衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

下面實(shí)施例5-10是衍生物的實(shí)施例。

本發(fā)明的利用糖基轉(zhuǎn)移酶的糖類化合物衍生物的制造方法制得的衍生物，糖的受體是N-氨基酸時(shí)，生成N-氨基酸衍生物，N的取值2-4。

葡聚糖蔗糖酶的酶反應(yīng)液中，除了糖類物質(zhì)以外，還添加了其它化合物。溶液中添加的蔗糖作為底物在酶的作用下，產(chǎn)生帶羥基的葡萄糖游離分子。此時(shí)，再向反應(yīng)液中添加選取的受糖體，受糖體在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在這個(gè)反應(yīng)中，酶的種類不同，轉(zhuǎn)移到受糖體上的糖基種類也不同，與此同時(shí)，酶和受糖體的物質(zhì)濃度配比不同也會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)物的種類。

實(shí)施例5

糖的受體是2-氨基酸時(shí)，生成化學(xué)式Ⅰ的2-氨基酸衍生物。

[化學(xué)式Ⅰ]

2-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖

（2-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide）

（上式 n取0-5）

實(shí)施例6

糖的受體是3-氨基酸時(shí)，生成化學(xué)式Ⅱ的3-氨基酸衍生物。

[化學(xué)式Ⅱ]

3-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖

（3-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide）

（上式 n取0-5）

實(shí)施例7

糖的受體是4-氨基酸時(shí)，生成化學(xué)式Ⅲ的4-氨基酸衍生物。[化學(xué)式Ⅲ]

4-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖

（4-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide）

（上式 n取0-5）

實(shí)施例8

糖基轉(zhuǎn)移酶是葡聚糖蔗糖酶，上述的糖的受體是對(duì)苯二酚時(shí)，生成下述化學(xué)式Ⅳ的對(duì)苯二酚衍生物。

[化學(xué)式Ⅳ]

對(duì)苯二酚-O-α-D-低聚異麥芽糖

(Hydroquinone-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

（上式 n取0-5）

實(shí)施例9

糖基轉(zhuǎn)移酶是果聚糖蔗糖酶，上述的糖的受體是對(duì)苯二酚時(shí)，生成下述化學(xué)式Ⅴ的對(duì)苯二酚衍生物。

[化學(xué)式Ⅴ]

對(duì)苯二酚-O-α-D-低果聚糖

(Hydroquinone-O-α-D-fructooligosaccharide)

（上式 n取0-5）

實(shí)施例10

糖基轉(zhuǎn)移酶是葡聚糖蔗糖酶，糖的受體是熊果苷時(shí)，生成下述化學(xué)式Ⅵ的熊果苷衍生物。

[化學(xué)式Ⅵ]

熊果苷-O-α-D-低聚異麥芽糖

(Arbutin-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

（上式 n取0-5）

即當(dāng)受糖體為2-氨基苯酚，則2-氨基苯酚在葡聚糖蔗糖酶的作用下，結(jié)合多個(gè)葡萄糖，生成2-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖（化學(xué)式Ⅰ）；當(dāng)受糖體為3-氨基苯酚，則3-氨基苯酚(m-aminophenol)在葡聚糖蔗糖酶的作用下，結(jié)合多個(gè)葡萄糖，生成3-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖（化學(xué)式Ⅱ）；當(dāng)受糖體為4-氨基苯酚，則4-氨基苯酚在葡聚糖蔗糖酶的作用下，結(jié)合多個(gè)葡萄糖，生成4-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖（化學(xué)式Ⅲ）。另外，對(duì)苯二酚在葡聚糖蔗糖酶的作用下，結(jié)合多個(gè)葡萄糖，生成對(duì)苯二酚-O-α-D-低聚異麥芽糖（化學(xué)式Ⅳ）；而對(duì)苯二酚在果聚糖蔗糖酶的作用下，結(jié)合多個(gè)果糖，生成對(duì)苯二酚-O-α-D-低果聚糖（化學(xué)式Ⅴ）。當(dāng)受糖體為熊果苷，則熊果苷會(huì)在葡聚糖蔗糖酶的作用下生成熊果苷-O-α-D-低聚異麥芽糖（化學(xué)式Ⅵ）。

區(qū)別在于，當(dāng)選取的受糖體生成如化學(xué)式Ⅰ~Ⅵ中的糖類化合物衍生物，根據(jù)n值在2~5的取值不同，認(rèn)為產(chǎn)生的糖類化合物衍生物的種類也不同。

這些經(jīng)轉(zhuǎn)糖基作用生成的氨基酚類衍生物，其水溶解性得以提高，且具有耐光、耐熱分解的作用，能夠有效地防止光分解和熱分解。例如，就氨基苯酚而言，當(dāng)其在光照或受熱條件下容易發(fā)生分解或出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。本發(fā)明所得到的氨基苯酚衍生物的溶解性好，對(duì)光、對(duì)熱穩(wěn)定性好。故可用于食品添加劑、化妝品、醫(yī)藥品以及老年癡呆癥藥物研究。此外，用上述糖類化合物衍生物所制備的功能性物質(zhì)有助于改善生物的代謝途徑。本發(fā)明所得到的糖基化合物衍生物在食品、化妝品、醫(yī)藥品及老年癡呆型藥物中的使用含量限定在總重的0.001~10%之間。

葡聚糖蔗糖酶是從腸系膜明串珠菌菌株或銀耳菌絲體中獲取的；將其接種到含有K₂HPO₄和糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)人工發(fā)酵培養(yǎng)后得到菌液，將上述菌液進(jìn)行分離純化，采用離子交換色譜的方式得到葡聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前獲得該酶的通用方法。

葡聚糖蔗糖酶可從腸系膜明串珠菌NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-512, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中獲得，但本發(fā)明選用的是腸系膜明串珠菌(Leuconostoc mensenteroides) NRRL B-1299菌株。

（一）酶液的制備：

例如1：將L.mesenteroides NRRL B-1299接種到1L含有5g酵母提取物、5g胨、20gK₂HPO₄、20g蔗糖的LB培養(yǎng)基，并在28℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。從上述培養(yǎng)液中分理出含有葡聚糖蔗糖酶的酶液，提純后備用。酶的純化采用DEAE瓊脂糖凝膠（DEAE-Sepharose）進(jìn)行，用濃度為20mM的緩沖液（pH 6.8）提前沖洗濾柱，使柱內(nèi)壓力平衡。然后將用約3倍的緩沖溶液作為流動(dòng)相，帶動(dòng)酶液進(jìn)入液相裝置中，除去不需要的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。類似的操作，用準(zhǔn)備好的相同緩沖液配置的0~1M濃度的NaCl溶液吸附需要分離得到的酶。用緩沖液反復(fù)洗滌粗提取的葡聚糖蔗糖酶液三次，得到精制的葡聚糖蔗糖酶。

果聚糖蔗糖酶是從腸系膜明串珠菌菌株中獲取的。將該菌株其接種到含有K₂HPO₄和糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)人工發(fā)酵培養(yǎng)后得到菌液，將上述菌液進(jìn)行分離純化，采用離子交換色譜的方式得到果聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前獲得該酶的通用方法。

果聚糖蔗糖酶可從腸系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830), NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中獲得，但本發(fā)明選用的是腸系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830)菌株。

例如2：將L.mesenteroides NRRL B-512 LWG型葡聚糖蔗糖酶按照0.3%（w/v）的固液比接種到液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)基中還含有胨、0.3%（w/v）K₂HPO₄和礦物質(zhì)溶液(2% MgSO₄·7H₂O、0.1%NaCl、 0.1%Fe SO₄·7H₂O、0.1% MnSO₄·H₂O,、0.13% CaCl₂·2H₂O、2% (w/v)葡萄糖）培養(yǎng)12-16小時(shí)，OD600值為3.0。培養(yǎng)結(jié)束后，用DEAE瓊脂糖凝膠柱（DEAE-Sepharose）（規(guī)格為2.5×35cm）或CM-Sepharose（2.5×35cm）來(lái)分離提純果聚糖蔗糖酶。

（二）酶的反應(yīng)過(guò)程

例1中的葡聚糖蔗糖酶是在濃度為0.3M的糖溶液中合成新的糖類化合物衍生物的。

當(dāng)氨基苯酚類物質(zhì)的反應(yīng)在葡聚糖蔗糖酶的作用下進(jìn)行，其中葡聚糖蔗糖酶、濃度為0.3M的蔗糖溶液以及0.5%的氨基苯酚物質(zhì)以1：1：1（v/v/v）的比例添加，且在反應(yīng)器中充分混勻后于28℃下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)要保證28℃的條件下，在糖完全消耗之前（約3個(gè)小時(shí)）進(jìn)行。

對(duì)苯二酚的反應(yīng)條件是，葡聚糖蔗糖酶/果聚糖蔗糖酶、濃度為0.3M的蔗糖溶液以及1%對(duì)苯二酚按照1：1：1（v/v/v）的比例進(jìn)行，將反應(yīng)物充分混勻后在28℃條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)務(wù)必保證在糖完全消耗之前（約3小時(shí)）進(jìn)行。熊果苷的反應(yīng)條件是葡聚糖蔗糖酶、濃度為0.3M的蔗糖溶液以及0.5%的受糖體以1：1：1（v/v/v）的比例添加，充分混勻后于28℃下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)務(wù)必保證在糖完全消耗之前（約3小時(shí)）進(jìn)行。熊果苷的合成反應(yīng)條件是在20mM濃度的醋酸鈉緩沖液（pH 5.2 60ml）、12.25mM濃度的熊果苷、100mM濃度的糖溶液，還有2U/ml B-1299葡聚糖蔗糖酶，最終反應(yīng)在28℃下進(jìn)行到糖被耗盡之前，對(duì)反應(yīng)液煮沸8分鐘，以滅酶活。

當(dāng)反應(yīng)物氨基苯酚在葡聚糖蔗糖酶作用下反應(yīng)結(jié)束時(shí)，葡聚糖蔗糖酶的活性為1U/ml。1U是指酶在1min內(nèi)分解1ml果糖溶液的μmol數(shù)。運(yùn)用下述方法鑒別酶作用生成糖類化合物衍生物的反應(yīng)是否結(jié)束。取1μl生成物，用Merck K6F TLC薄層色譜法進(jìn)行分析鑒定：取硝基甲烷：丙醇：水=2：5：1.5（v/v/v）的混合溶液或者乙腈：水=85：15（v/v）的混合液與1μl生成物在點(diǎn)滴板中混合，然后展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，觀察反應(yīng)情況。反應(yīng)一會(huì)后，采用HPTLC(High pressure thin layer chromatograph)薄層色譜法鑒定分離物質(zhì)，此鑒定方法中所用的顯色劑含有0.5%（w/v）的α-萘酚和5%（v/v）的H₂SO₄。

（三）反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確定

利用HPLC、NMR以及MALDI-TOP等分析方法來(lái)確定上述過(guò)程生成的產(chǎn)品的分子結(jié)構(gòu)。反應(yīng)產(chǎn)物用Bio Gel P-2柱來(lái)進(jìn)行精制，將樣品溶液注入柱中，通過(guò)TLC來(lái)確認(rèn)流出的分離物。分離得到的目標(biāo)物質(zhì)經(jīng)真空濃縮后，再次用TLC來(lái)確認(rèn)成分?？傊?，合成產(chǎn)品的成分組成由TLC、NMR、MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometer)等來(lái)加以確定鑒別，反應(yīng)的結(jié)果如圖1~4所顯示的。

從Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299菌株中得到的葡聚糖蔗糖酶作用于不同氨基苯酚受糖體分別得到以下氨基苯酚衍生物：2-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖（圖1-P1）、3-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖（圖1-P2）以及4-氨基苯酚-O-α-D-低聚異麥芽糖（圖1-P3）。對(duì)苯二酚經(jīng)葡聚糖蔗糖酶作用得到產(chǎn)物如圖2所示，所得衍生物對(duì)苯二酚-O-α-D-低聚異麥芽糖 （圖2-P4），對(duì)苯二酚經(jīng)果聚蔗糖酶作用得到產(chǎn)物如圖3所示，所得衍生物對(duì)苯二酚-O-α-D-低果聚糖（圖3-P5）。另外，熊果苷在葡聚糖蔗糖酶的作用下得到產(chǎn)物如圖4所示，產(chǎn)物為熊果苷的衍生物熊果苷-O-α-D-低聚異麥芽糖（圖4-P6、P7）。

另一方面，各分離樣品在47℃下經(jīng)蒸發(fā)器濃縮，再利用HPLC進(jìn)行各成分的純度確定。此時(shí)使用的分析柱為hypersil APS-2 NH₂型（4.6×250mm Bio-Rad），流動(dòng)相是體積比為4：1或3：1的乙腈/甲醇溶液，流動(dòng)速率為0.5ml/min。在室溫條件下，利用RI檢波器對(duì)HPLC純化得到的樣品進(jìn)行色譜圖分析，如圖5所示。經(jīng)生物凝膠P-2色度分離得到的熊果苷經(jīng)HPLC分析后確認(rèn)含有G1物質(zhì)和G2物質(zhì)，且兩種物質(zhì)分別占原樣品的23.8%和3.3%。 精制后的各樣品的分子量由MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析。將制備得到的熊果苷衍生物（3mg/ml）用去離子水稀釋，然后與2，5-二羥-苯甲酸（1mg/ml）混合，將混合好的溶液按1：1的比例溶入有機(jī)試劑乙腈中，取最終的混合液1μl滴入不銹鋼容器中，在室溫下緩慢干燥。利用MALDI-TOF-MS(Voyager DE-STR; Appled Bio Systems, USA)進(jìn)行正像模式的質(zhì)譜分析，此時(shí)附加65KV的電壓加快分析速度。取精制的熊果苷衍生物2~3mg，溶解于250μl的重水（D₂O）中，通入NMR（直徑 3mm）管中，使用Unity Inova 500 spectrometer(Varian Inc., USA)進(jìn)行分析。在500 MHz的電壓用¹H核磁共振，在125 MHz下用¹³C核磁共振進(jìn)行分析。結(jié)果如下表1所示。

[表1]

熊果苷及熊果苷衍生物的¹³C和¹H核磁共振成像數(shù)據(jù)(單位：ppm)

熊果苷-G1物質(zhì)

熊果苷-G1分子的m/z（質(zhì)荷比）是457。從表1中我們可以看到，在4.89ppm(J=7.0Hz)觀察到熊果苷芳香族物質(zhì)中的以β結(jié)合方式結(jié)合的葡萄糖的異頭構(gòu)型信號(hào)。用HMBC（異核多鍵相關(guān)譜）確定了4.83ppm(J=3.5Hz)信號(hào)處的以α方式結(jié)合的葡萄糖分子。熊果苷衍生物的熊果苷信號(hào)是利用熊果苷分子結(jié)構(gòu)上的碳來(lái)確定的（化學(xué)式Ⅶ）。和其他位置的碳相比，除了65.55ppm處的C-6’以外，其它的δ₁-δ的值都為負(fù)的。上述差異是因?yàn)?.15ppm處的C-6’與葡萄糖分子發(fā)生結(jié)合，從而帶來(lái)了變化。利用HMBC也確認(rèn)了，在65.55ppm處的葡萄糖的H-1’’與熊果苷C-6’之間發(fā)生耦合作用，以此確認(rèn)熊果苷-G1結(jié)構(gòu)含有4-羥基苯酰和β-異麥芽糖結(jié)構(gòu)（化學(xué)式Ⅷ）。

[化學(xué)式Ⅶ]

[化學(xué)式Ⅷ]

熊果苷-G2物質(zhì)

熊果苷-G2分子的m/z（質(zhì)荷比）是610。從表1可以看出，在4.94ppm(J=7.0Hz)觀察到熊果苷芳香族物質(zhì)中的以β結(jié)合方式結(jié)合的葡萄糖的異頭構(gòu)型信號(hào)，同樣，用HMBC也可以得到相同的結(jié)論。在4.86ppm(J=3.5Hz)處和4.81ppm(J=3.5Hz)處可看到有兩個(gè)葡萄糖分子結(jié)合在熊果苷上。表1中66.83ppm處的C-6’和64.29ppm處的C-6”分別對(duì)應(yīng)2.43ppm和4.97ppm。葡萄糖基與熊果苷中的C-6’相結(jié)合，而葡萄糖與熊果苷中的C-6”相結(jié)合。利用HMBC也確認(rèn)了，在65.83ppm處的葡萄糖的H-1”與熊果苷C-6’之間發(fā)生耦合作用，而在65.20ppm處熊果苷的C-6”與葡萄糖H-1”’發(fā)生結(jié)合。以此確認(rèn)熊果苷-G1結(jié)構(gòu)含有4-羥基苯酰和β-低聚葡萄糖結(jié)構(gòu)。

[化學(xué)式Ⅸ]

最后生成的熊果苷衍生物經(jīng)醋酸酸化以后可生成下述化學(xué)式Ⅹ的五乙酰熊果苷。

[化學(xué)式Ⅹ]

五乙酰熊果苷。