一組用于驢源性的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的特異性引物和探針的制作方法

本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組用于驢源性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的特異性引物和探針。

背景技術(shù)：

隨著人們生活水平的提高及健康意識的增強(qiáng)，人們越來越關(guān)心食品的真?zhèn)涡?，食品中動物源性成分鑒別成為社會關(guān)注的焦點(diǎn)之一，消費(fèi)者對肉制品質(zhì)量與安全性的要求越來越高。目前，國內(nèi)市場上在肉及肉制品的生產(chǎn)銷售過程中，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費(fèi)者而牟取暴利的事件頻出。這不僅僅涉及食品安全、營養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值等問題，更關(guān)系到消費(fèi)者健康、宗教信仰等問題。因此，對食品中原料肉進(jìn)行摻假、摻雜檢驗(yàn)顯得尤為重要。

到目前為止，對瘋牛病尚無有效的治療方法，也沒有有效的生前檢測手段,一般是通過尸檢腦組織，經(jīng)病理檢驗(yàn)而確診的。由于該病潛伏期長(一般2～8年)，但是一旦癥狀出現(xiàn)，進(jìn)行性就加重，一般只需2個(gè)星期到6個(gè)月，瘋牛就以死亡而告終。而瘋牛病能否傳染給其他種屬的動物包括人類，則是人們一直關(guān)心的問題。因?yàn)檫^去已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛食用了羊瘙癢病因子的飼料后，經(jīng)過一段時(shí)間就引發(fā)了瘋牛病，而其他一些動物食用了這些飼料也會患類似的病。因此，科學(xué)家認(rèn)為瘋牛病很可能是通過食用帶羊瘙癢病的飼料而獲得的。隨著飼料及其添加劑國際貿(mào)易的飛速發(fā)展，飼料產(chǎn)品的多樣性和雜合性已經(jīng)引發(fā)了使用動物源性飼料的安全問題，也必將給人類的肉食安全帶來挑戰(zhàn)。為了防止瘋牛病、癢病的傳入，醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)所設(shè)計(jì)的一對引物可以專一地從混合性DNA模板中擴(kuò)增到馬或驢的mtDNA片段，檢出限達(dá)到0.3%，再通過酶切鑒定就能夠準(zhǔn)確判定片段是源于馬還是源于驢。該方法對馬、驢源性成分的檢測準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高，將來必定可以投入到進(jìn)出口飼料馬、驢源性成分檢測或者是飼料品種鑒定的工作當(dāng)中，為明確飼料的成分和來源，為全面防御瘋牛病、癢病的傳入提供堅(jiān)實(shí)的后盾。

過去用于肉食中物種的鑒別主要依賴于電泳法，免疫法，ELISA等蛋白質(zhì)分析法。蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于生肉的鑒別，但當(dāng)肉類經(jīng)過切碎、混合、蒸煮和熏烤等加工工藝處理后，將改變?nèi)忸惖鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而破壞物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定簇，影響其檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。而且，這些方法在實(shí)際應(yīng)用中存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、成本高等問題，已不能滿足現(xiàn)代肉類安全檢測的需求，而PCR技術(shù)基于其反應(yīng)時(shí)間短，具有較高靈敏性、特異性成為鑒別加工食品中物種的優(yōu)先選擇。但傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在定量和大批量檢測中局限性較大。因此，急于發(fā)現(xiàn)一種新的技術(shù)可以精確地辨別物種并實(shí)現(xiàn)快速、大容量的實(shí)時(shí)定量檢測，而新興的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以很好的滿足要求，正廣泛的應(yīng)用于食品中驢源性成分的檢測。

本發(fā)明中根據(jù)驢線粒體DNA 細(xì)胞色素b 基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，旨在建立一種快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的驢源性成分定性檢測的實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，以滿足當(dāng)前相關(guān)食品摻假摻雜檢驗(yàn)的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于設(shè)計(jì)一組驢源性特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應(yīng)用于驢制品和肉骨粉中驢源性成分檢測的快速、靈敏、特異性好的熒光定量PCR檢測的方法。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，將驢源性DNA的cytb基因種內(nèi)保守片段插入到載體pMD18-T中，獲得含有cytb基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)驢源性cytb的基因片段編碼基因序列設(shè)計(jì)并合成一組特異性引物和探針，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進(jìn)行評估。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組用于驢源性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的特異性引物和探針，所述特異性引物和探針的核苷酸序列為（1）或（2）中的一種：

（1）、上游引物：5'-GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'

下游引物：5'- GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA -3'

探針：5'- CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG-3'

所述引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.3；

（2）、與（1）所述序列互補(bǔ)的序列。

作為優(yōu)選，所述探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供驢源性的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒為驢源性的定性或定量檢測試劑盒；所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物和探針；

作為優(yōu)選，所述定量檢測試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：將驢源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含有驢源性保守基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品；所述驢源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2；

作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述驢源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列為模板，使用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的：

上游引物：5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'

下游引物：5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3'；

作為優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述特異性引物和探針在制備定性或定量檢測驢源性的試劑盒中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述應(yīng)用是分別以標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品DNA為模板，利用特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值判定結(jié)果。

作為優(yōu)選，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供驢源性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實(shí)施對象，步驟如下：

（1）制備標(biāo)準(zhǔn)品：將驢源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含有驢源性保守基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品；所述驢源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2；

（2）使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；

（4）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值進(jìn)行驢源性的快速定量檢測。

作為優(yōu)選，步驟（1）中所述驢源性保守基因片段是通過以下引物擴(kuò)增得到的：

上游引物為5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'；

下游引物為5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3'；

作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增所述驢源性保守基因片段的條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；

作為優(yōu)選，步驟（2）中所述引物和探針的用量均為1.6μl；

作為優(yōu)選，步驟（2）中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供驢源性的定性PCR檢測方法，所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實(shí)施對象，步驟如下：

（1）使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

（2）通過待測樣品的Ct值對驢源性進(jìn)行定性檢測：當(dāng)Ct值小于38時(shí)，為陽性；否則，為陰性；

作為優(yōu)選，步驟（1）中所述引物和探針的用量均為1.6μl；

作為優(yōu)選，步驟（1）中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明提供用于對驢源性進(jìn)行定性、定量檢測的引物和探針，通過提取待檢測樣品的DNA結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，可達(dá)到準(zhǔn)確定量或定性檢測驢制品和肉骨粉中驢源性含量的目的。本發(fā)明所提供的引物和探針可對驢制品和肉骨粉中的驢源性含量進(jìn)行定性、定量分析，對判斷驢制品和肉骨粉中驢源性含量具有重要意義，本發(fā)明將在食品微生物檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為引物和探針體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中：a代表引物為1.6μl，探針為1.6 μl；b代表引物為1.0μl，探針為1.6 μl；c代表引物為1.0μl，探針為0.8 μl；d代表引物為2.0μl，探針為0.8 μl；e代表引物為1.6μl，探針為0.8 μl；f代表引物為2.0μl，探針為1.0 μl；g代表引物為1.0μl，探針為0.8 μl；h代表引物為1.0μl，探針為1.0 μl；i代表引物為2.0μl，探針為1.6 μl；

圖2為靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中：a代表質(zhì)粒濃度分別為1.00×10⁸copies/ml、b代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁷copies/ml、c代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁶copies/ml、d代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁵copies/ml、e代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁴copies/ml、f代表質(zhì)粒濃度為1.00×10³copies/ml、g代表質(zhì)粒濃度為1.00×10²copies/ml和陰性對照；

圖3為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的為驢，未出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的為牛、羊、狗、魚、雞、鴨、鵝、兔、豬、蛙、鼠、陰性對照；

圖4為驢源性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方案對本發(fā)明做更詳細(xì)闡述。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

實(shí)施例1 cytb基因標(biāo)準(zhǔn)品的制備

要建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)包含高度保守、特異的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。動物線粒體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)保守、熱穩(wěn)定性好、不易降解的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和母系遺傳、拷貝數(shù)多、進(jìn)化速度快、不發(fā)生重組的遺傳特點(diǎn)，其中線粒體細(xì)胞色素b（cytb）基因序列最為保守型。cytb基因檢測驢源性，有較高的敏感性和特異性。本發(fā)明主要采用PCR技術(shù)擴(kuò)增驢源性cytb基因，利用基因重組技術(shù)將其連接到質(zhì)粒載體pMD18-T中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMD18-T-donkeycytb，并進(jìn)行相應(yīng)的PCR鑒定和測序鑒定，最后經(jīng)定量作為待建立方法的標(biāo)準(zhǔn)品，為下一步的方法及評估奠定基礎(chǔ)。

一、模板DNA的制備

提取驢肝臟組織基因組DNA，用作cytb基因PCR擴(kuò)增的模板；提取基因組DNA的試劑盒為細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），采購自百泰克生物技術(shù)有限公司；

（1）取1.5g新鮮驢肝臟組織用液氮研磨成粉末，加到5ml離心管中，加入4ml SE緩沖液，混勻，4500 r/mim離心15min；

（2）吸取上清，4℃ 12000 r/min離心20min，棄上清，收集沉淀；

（3）加入400μl Buffer Digestion ，震蕩混勻。65℃水浴1-3h至細(xì)胞完全裂解 （注意：1、水浴過程中，每10分鐘顛倒混勻一次，可促進(jìn)樣品裂解?；旌弦鹤兂吻逋该鳛榱呀馔耆?。如溶液未變澄清，說明細(xì)胞裂解不徹底，應(yīng)當(dāng)延長水浴時(shí)間，否則將可能降低DNA的得率或?qū)е绿崛〉腄NA不純。2、如需得到無RNA的DNA，可在水浴后加入20μl的Rnase A，室溫放置2-5分鐘）加入200μl Buffer PA，充分顛倒混勻，置于-20℃冰箱放置5min；

（4）4℃ 10000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新管中；

（5）加入等體積的異丙醇，顛倒5-8次使之充分混勻-20℃，放置20min；

（6）4℃ 10000rpm離心10分鐘，棄上清；

（7）加入1ml預(yù)冷的75%的乙醇，漂洗1-3min，4℃ 10000rpm離心2分鐘，棄上清；

（8）開蓋室溫倒置10-20min，至殘留的乙醇完全揮發(fā)。得到的DNA用30-50μl純凈水溶解；

（9）提取的DNA可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或－20℃保存。

二、cytb基因片段的PCR擴(kuò)增

1、引物的設(shè)計(jì)與合成

本發(fā)明通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中驢cytb全序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對分析，選取適合設(shè)計(jì)引物和探針的保守片段序列為靶目標(biāo)，應(yīng)用Primer express 3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設(shè)計(jì)了一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針以及一組相關(guān)序列的外圍引物。

本專利選取的擴(kuò)增序列如下：

該外圍引物序列如下：

上游引物：donkeycytb422F：5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'

下游引物：donkeycytb804R：5'-ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA-3'

擴(kuò)增片段大小為：405bp。

2、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

以DNA為模板，以上述外圍引物donkeycytb422F/ donkeycytb804R為擴(kuò)增引物，采用下述體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：

10×PCR buffer 5μl

dNTP（2.5μM） 2μl

引物F（10μM） 2μl

引物R（10μM） 2μl

模板 2.4μl

Taq酶（5U） 1.6μl

ddH₂O 35μl

總體積 50μl。

其中引物采用donkeycytb422F/ donkeycytb804R，Taq酶采用北京百泰克Power Taq Plus DNA Polymerse，PCR擴(kuò)增儀為北京百泰克iCycling系列96梯度PCR儀。

擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件：

94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，檢測PCR產(chǎn)物大小，然后采用Axygen公司生產(chǎn)的DNA凝膠回收試劑盒純化回收剩余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

三、重組質(zhì)粒pMD18-T-donkeycytb的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

1、連接反應(yīng)：將上述純化得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T（大連寶生物公司）進(jìn)行連接，采用如下連接體系進(jìn)行配制：

pMD18-T vector 1μL

回收DNA 2μL

SolutionⅠ 5μL

ddH₂O 2μL

總體積 10μL。

配制完成后置于16℃進(jìn)行過夜連接反應(yīng)。

2、pMD18-T-donkeycytb質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及PCR鑒定

（1）從-70℃的超低溫冰箱中取出凍存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰盒上使其自然解凍；

（2）取連接產(chǎn)物10μL加入50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘；

（3）42℃水浴中熱休克90秒，熱休克后立即置冰上冷卻2min；

（4）向1.5ml EP管中加入預(yù)冷的400μl的LB液體培養(yǎng)基（不含氨芐青霉素）混勻后，37℃ 200轉(zhuǎn)/分輕搖培養(yǎng)1h；

（5）將上述培養(yǎng)液搖勻后取100μl涂布于含100mg/ml Amp、24mg/ml IPTG、20 mg/ml X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜；

（6）次日觀察，從平板上挑取白色單克隆菌落于100μL LB液體培養(yǎng)基（含100mg/ml氨芐青霉素）的PCR管中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。吸取2μL作為模板進(jìn)行PCR鑒定，剩余的菌液加入到20ml的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)搖。

（7）用載體通用引物RV-M/M13-47擴(kuò)增上述稀釋菌液，PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，通過檢測PCR產(chǎn)物大小鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

引物RV-M/M13-47序列如下：

引物 RV-M: 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

引物 M13-47: 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR反應(yīng)體系如下：

10×PCR buffer 2.5μL

dNTP（2.5μM） 0.5μL

引物F（10μM） 0.5μL

引物R（10μM） 0.5μL

模板 2μL

Taq 酶（5U） 0.5μL

ddH₂O 18.5μL

總體積 25μL。

擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。

（8）采用Axygen公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒，測定濃度和純度，同時(shí)吸取一部分純化質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，確定插入片段的基因序列與目的序列一致。

四、標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量

1、將步驟三得到的含有重組質(zhì)粒pMD18-T- donkeycytb的大腸桿菌DH5α100μL轉(zhuǎn)種于5mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 200rpm過夜搖培；

2、取1ml培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)種于30ml LB液體培養(yǎng)基，200rpm 增菌培養(yǎng)2-3小時(shí)，然后采用Axygen公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取質(zhì)粒；

3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可見分光光度計(jì)（ND5000）對提取的質(zhì)粒進(jìn)行測定，測定A₂₆₀、A₂₈₀，根據(jù)A₂₆₀/A₂₈₀判斷質(zhì)粒的純度。

4、質(zhì)粒pMD18-T- donkeycytb濃度（拷貝數(shù)）計(jì)算

（1）質(zhì)粒的分子量=3097bp×660（每對堿基的平均分子量）

（2）測得質(zhì)粒濃度為116.48ng/μl，質(zhì)粒純度A₂₆₀/A₂₈₀=2.05，A₂₆₀/A₂₃₀=1.95。因在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，需要以“拷貝數(shù)”為單位，因此需要將單位轉(zhuǎn)換成copies/ml。

質(zhì)粒 copies/ml=阿伏伽德羅常數(shù)×質(zhì)粒摩爾數(shù)

其中阿伏伽德羅常數(shù)=6.02×10²³copies/mol。

因此提取的質(zhì)粒濃度copies/ml=116.48×10^-9g/ml×6.02×10²³copies/mol÷（3097bp×660g/bp·mol）=3.4×10¹⁰copies/m0l

10μl質(zhì)粒+24μl的無菌水就得到濃度為1.00×10¹⁰copies/ml的質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒進(jìn)行10倍比稀釋就可得到一系列濃度的質(zhì)粒，作為系列標(biāo)準(zhǔn)品，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驢源性方法的建立

一、特異性引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

以上述選取的驢的cytb基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用Primer express 3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設(shè)計(jì)了一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針。

作為本發(fā)明的核心，一組用于驢源性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的引物和探針核苷酸序列如下：

上游引物：donkeycytb422F：5’- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3’

下游引物：donkeycytb552R: 5’- GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA -3’

探針：pigcytb444P: 5’-CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG-3’

探針5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

該引物和探針擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為：

二、待測樣本的制備

1.驢制品樣本的制備

（1）取5g驢制品用液氮研磨成粉末，加到15ml離心管中，加入10ml SE緩沖液，混勻，4500 r/mim離心15min；

（2）吸取上清，4℃ 12000 r/min離心20min，棄上清，收集沉淀；

（3）加入800μl Buffer Digestion，震蕩混勻。65℃水浴1-3h至細(xì)胞完全裂解（注意：1、水浴過程中，每10分鐘顛倒混勻一次，可促進(jìn)樣品裂解?；旌弦鹤兂吻逋该鳛榱呀馔耆?。如溶液未變澄清，說明細(xì)胞裂解不徹底，應(yīng)當(dāng)延長水浴時(shí)間，否則將可能降低DNA的得率或?qū)е绿崛〉腄NA不純。2、如需得到無RNA的DNA，可在水浴后加入20μl的Rnase A，室溫放置2-5分鐘）加入200μl Buffer PA，充分顛倒混勻，置于-20℃冰箱放置5min；

（4）4℃ 10000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新管中；

（5）加入等體積的異丙醇，顛倒5-8次使之充分混勻-20℃，放置20min；

（6）4℃ 10000rpm離心10分鐘，棄上清；

（7）加入1ml預(yù)冷的75%的乙醇，漂洗1-3min，4℃ 10000rpm離心2分鐘，棄上清；

（8）開蓋室溫倒置10-20min，至殘留的乙醇完全揮發(fā)。得到的DNA用30-50μl純凈水溶解；

（9）提取的DNA可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。

2.肉骨粉樣本的制備

（1）稱取0.5-2g肉骨粉樣品于10ml離心管中，加入適量含10%SDS(采購自百泰克生物技術(shù)有限公司)和10μg/ml蛋白酶K（蛋白酶K采購自百泰克生物技術(shù)有限公司）的裂解液，37℃保溫過夜；

（2）2000g離心5min。取離心上清液，加等體積酚/氯仿/異戊醇（三者的體積比為25/24/1）(采購自大連寶生生物技術(shù)有限公司)混勻，靜置5min；

（3）8000g離心5min。取離心上清液加0.65倍體積的異丙醇（異丙醇含量≥99%，采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），混勻，12000g 4℃離心10min；

（4）棄上清液，加500μL 70%冰乙醇（采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；

（5）12000g 4℃離心5min。取沉淀，吹干。加50μL TE或ddH₂O溶解白色沉淀，此即為DNA提取物。

三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化

以濃度為1.00×10⁶copies/ml的陽性質(zhì)粒為模板，采用百泰克公司生產(chǎn)的2×real-time PCR Premixture（probe）實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為蘇州百源基因技術(shù)有限公司的ASA-9600實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。反應(yīng)體系采用20μl 體系，其中引物和探針的量采用表1組合進(jìn)行反應(yīng)。

表1 PCR反應(yīng)體系中引物和探針不同用量

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果參照圖1，數(shù)據(jù)顯示20μl 體系時(shí)，引物（5μM）和探針（5μM）分別加入1.6μl，Ct值最小，熒光信號最強(qiáng)。

四、方法評估

1、靈敏度實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例1制備得到的一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選取濃度為1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml等作為梯度模板。反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.6μl

Primer R（5μM） 1.6μl

Probe（5μM） 1.6μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)儀器所檢測到的熒光信號經(jīng)軟件處理獲得熒光曲線，觀察熒光曲線的信號，結(jié)果參照圖2，數(shù)據(jù)顯示當(dāng)質(zhì)粒濃度達(dá)到1.00×10³copies/ml時(shí)依然有熒光信號，但質(zhì)粒濃度達(dá)到1.00×10²copies/ml時(shí)未檢測到熒光信號，因此該方法的靈敏度為1.00×10³copies/ml。

由圖1和圖2還可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線光滑。

2、特異性實(shí)驗(yàn)

為了證實(shí)本發(fā)明對驢源性檢測的特異性，我們選取了常見的11種動物做特異性實(shí)驗(yàn)，選取的動物包括：牛、羊、狗、魚、雞、鴨、鵝、兔、豬、蛙、鼠。

該特異性試驗(yàn)包括用上述樣本的基因組DNA為模板進(jìn)行的試驗(yàn)。反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.5μl

Primer R（5μM） 1.5μl

Probe（5μM） 1.5μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)儀器所檢測到的熒光信號經(jīng)軟件處理獲得熒光曲線，觀察熒光曲線的信號，分析特異性。結(jié)果參考圖3，具體結(jié)果僅驢組織檢測為陽性，其余動物均為陰性，表明本發(fā)明具有很好的特異性。檢測結(jié)果如表2所示。

表2 特異性實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)得到驢源性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為待測樣品定量測定的參照標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果參考圖4。由圖4可知，Ct值和拷貝數(shù)呈較好的線性關(guān)系；以模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線原始方程為y=a+bx，本次標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=44.60-3.41x，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合實(shí)時(shí)熒光PCR定量的要求。

4、待測樣品的定量檢測

以待測樣品DNA和標(biāo)準(zhǔn)品的DNA為模板，用驢的特異性引物，以相同的體系同時(shí)進(jìn)行驢cytb的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.6μl

Primer R（5μM） 1.6μl

Probe（5μM） 1.6μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值進(jìn)行驢制品和肉骨粉中驢源性的快速定量檢測。

5、待測樣品的定性檢測

以待測樣品DNA為模板，用驢的特異性引物，對待測樣品DNA進(jìn)行驢cytb的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.6μl

Primer R（5μM） 1.6μl

Probe（5μM） 1.6μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。通過待測樣品的Ct值對驢制品和肉骨粉中驢源性進(jìn)行定性判斷：當(dāng)Ct值小于38時(shí)，為陽性；否則，為陰性。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 蘇州百源基因技術(shù)有限公司

<120> 一組用于驢源性的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的特異性引物和探針

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacaaaca tccgaaaatc ccacccgcta attaaaatca tcaatcactc ttttatcgac 60

ctgccaaccc cctcaaacat ttcatcatga tgaaactttg gctccctcct aggaatctgc 120

ctaatcctcc aaatcctaac aggcctattc ctagccatac actacacatc agacactaca 180

actgccttct catccgtcac ccatatctgc cgagacgtta actacggatg aatcattcgc 240

tacctccatg ccaacggagc atccatattt ttcatctgcc tctttatcca cgtagggcgc 300

ggcctctact atggctccta cacattccta gaaacatgaa acattggaat tatcctactt 360

ttcacagtaa tagccacagc attcataggc tatgtcctac catgaggaca aatatccttc 420

tgaggagcaa cggtcattac aaacctccta tcagcaatcc cctacatcgg tactacgctc 480

gtcgaatgaa tctgaggtgg attctcagta gacaaagcca cccttacccg attttttgcc 540

ttccacttta ttctaccctt tatcatcaca gccctggtaa tcgtccatct actattcctc 600

cacgaaacag gatccaacaa cccctcagga atcccatctg acatagacaa aatcccattc 660

cacccgtact acacaattaa agacatccta ggacttctcc tcctagtcct actcctacta 720

accctagtat tattctcccc tgacctccta ggagacccag acaactacac cccagctaac 780

cccctcagca ctccccctca tattaagcca gaatggtatt tcctatttgc ttacgccatc 840

ctacgctcca ttcccaacaa actaggtggt gtattagccc ttatcctttc catcttaatc 900

ctagcactca tccctaccct acacatgtca aaacaacgaa gcataatgtt ccgacccctt 960

agtcaatgcg tgttctgact cttagtagca gacttactaa cactaacatg aattggtggc 1020

caaccagtag aacacccata cgtaatcatc ggccaactgg cctcaatcct ctacttctcc 1080

ctaattctca tcttcatacc actcgcaagc accatcgaaa acaaccttct aaagtgaaga 1140

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggagcaac ggtcattaca aacctcctat cagcaatccc ctacatcggt actacgctcg 60

tcgaatgaat ctgaggtgga ttctcagtag acaaagccac ccttacccga ttttttgcct 120

tccactttat tctacccttt atcatcacag ccctggtaat cgtccatcta ctattcctcc 180

acgaaacagg atccaacaac ccctcaggaa tcccatctga catagacaaa atcccattcc 240

acccgtacta cacaattaaa gacatcctag gacttctcct cctagtccta ctcctactaa 300

ccctagtatt attctcccct gacctcctag gagacccaga caactacacc ccagctaacc 360

ccctcagcac tccccctcat attaagccag aatggtattt cctat 405

<210> 3

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggagcaac ggtcattaca aacctcctat cagcaatccc ctacatcggt actacgctcg 60

tcgaatgaat ctgaggtgga ttctcagtag acaaagccac ccttacccga ttttttgcct 120

tccactttat tctacccttt atcatcacag ccc 153