一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用的制作方法

技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實(shí)時(shí)定量檢測(cè)霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：弧菌屬(Vibrio)中霍亂弧菌(V.cholerae)可引起一種烈性腸道傳染病，發(fā)病急、傳染性強(qiáng)、病死率高，屬于國(guó)際檢疫傳染病。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經(jīng)口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進(jìn)入小腸后，依靠鞭毛的運(yùn)動(dòng)，穿過粘膜表面的粘液層，可能藉菌毛作用粘附于腸壁上皮細(xì)胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經(jīng)過短暫的潛伏期后便急驟發(fā)病。該菌不侵入腸上皮細(xì)胞和腸腺，也不侵入血流，僅在局部繁殖和產(chǎn)生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細(xì)胞與腸腺使腸液過度分泌，從而患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈"米泔水樣"并含大量弧菌，此為本病典型的特征。居住擁擠，衛(wèi)生狀況差，特別是公用水源是造成暴發(fā)流行的重要因素。人與人之間的直接傳播不常見。在正常胃酸條件下，如以水為載體，需飲入大于1010個(gè)細(xì)菌方能引起感染；如以食物作為載體，由于食物高強(qiáng)度的緩沖能力，感染劑量可減少到102~104個(gè)細(xì)菌。任何能降低胃中酸度的藥物或其他原因，都可使人對(duì)霍亂弧菌感染的敏感性增加。對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)，有利于臨床上快速做出治療應(yīng)對(duì)措施，對(duì)食品進(jìn)行霍亂弧菌檢測(cè)，切除傳染源，對(duì)保障公共衛(wèi)生安全有重大意義。目前，霍亂弧菌的檢測(cè)技術(shù)主要有常規(guī)方法和分子生物學(xué)方法。常規(guī)方法是通過對(duì)細(xì)菌的表型特征和生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定。從樣品中分離病原菌需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和相對(duì)苛刻的操作環(huán)境條件，且分離率低。鑒定霍亂弧菌的生化指標(biāo)主要包括：革蘭氏染色、氧化酶實(shí)驗(yàn)、過氧化氧酶實(shí)驗(yàn)、V-P反應(yīng)(福格斯-普利斯考爾)產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)，生化試驗(yàn)通常耗時(shí)24-72小時(shí)。目前也有PCR檢測(cè)方法報(bào)道。通常以霍亂腸毒素(choleraenterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。然而，一些非產(chǎn)毒株(如環(huán)境來源的菌株)有可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測(cè)ctx基因容易造成漏檢。此外，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因(tcpA)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達(dá)調(diào)控基因(toxR)等也被選用為PCR的靶基因。雖然PCR方法較常規(guī)方法快速準(zhǔn)確，但需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，成本較高，不適合基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，此外，在結(jié)果判定上需要先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再使用紫外透射儀照射進(jìn)行判定，且通過肉眼判定具有人為主觀因素，還容易造成實(shí)驗(yàn)室污染。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡(jiǎn)便、快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)霍亂弧菌的方法，公開一種快速、實(shí)時(shí)定量的定量檢測(cè)霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為：一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，該試劑盒包括LAMP引物、2×反應(yīng)緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測(cè)試劑、超純水和霍亂弧菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3與B3和內(nèi)引物是FIP與BIP；其中引物的序列分別為：F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；所述的2×反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。以上所述的霍亂弧菌DNA模板是使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的霍亂弧菌DNA。以上所述的熒光目視檢測(cè)試劑采用鈣黃綠素?zé)晒庠噭?，熒光試劑在反?yīng)前加入。以上所述的2×反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL35-55mM、KCL18-32mM、MgSO415-25mM、(NH4)2SO422-28mM、Tween200.3-0.6℅、Betaine1.5-3M和dNTPs3-4.5mM，其配制方法在pH為9.0條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的應(yīng)用，用于快速檢測(cè)樣品中是否存在霍亂弧菌污染，以及對(duì)疑似霍亂弧菌進(jìn)行鑒定，具體檢測(cè)步驟包括：（1）LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成（2）霍亂弧菌DNA模板的提取（3）LAMP反應(yīng)體系建立（4）LAMP檢測(cè)方法。以上所述的LAMP反應(yīng)體系建立LAMP反應(yīng)體系以25μl計(jì)，2×反應(yīng)緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍亂弧菌DNA2μL超純水補(bǔ)足25μL。以上所述的LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法。以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用LoopampLA-320C實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行密閉全程監(jiān)控，反應(yīng)溫度為63℃、反應(yīng)在35-40分鐘出現(xiàn)擴(kuò)增。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步是：1）特異性強(qiáng)所檢測(cè)的陰性對(duì)照細(xì)菌和水對(duì)照均無陽(yáng)性結(jié)果出來，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。且操作簡(jiǎn)便、快速獲得檢測(cè)結(jié)果、無需昂貴復(fù)雜的儀器。2）靈敏度高普通的PCR檢測(cè)方法的靈敏度為2.05×10-1ng/μL數(shù)量級(jí)，而使用本發(fā)明檢測(cè)方法，檢測(cè)限約為2.05×10-2ng/μL，是普通PCR的10倍左右。3）迅速得出結(jié)果普通的PCR整個(gè)過程在24小時(shí)左右才能得出結(jié)果，目前多數(shù)建立的LAMP反應(yīng)方法在反應(yīng)結(jié)束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，從細(xì)菌基因組DNA提取到獲取試驗(yàn)結(jié)果，需要4-5小時(shí)左右。本發(fā)明提供的LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)在35-40分鐘間出現(xiàn)擴(kuò)增，60分鐘內(nèi)即可完成擴(kuò)增，且結(jié)果判定方式簡(jiǎn)便—擴(kuò)增結(jié)束即可判斷結(jié)果，不需要再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析，從基因組DNA提取到獲得最終結(jié)果可在2-3小時(shí)內(nèi)完成。4）不造成污染目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應(yīng)后加入，但顯色法只能是反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入熒光染料進(jìn)行顯色反應(yīng)，觀察是否有顯色來判讀試驗(yàn)結(jié)果，或者通過跑電泳的方法進(jìn)行結(jié)果判定，無法區(qū)分特異性擴(kuò)增與非特異性擴(kuò)增，因此增加了假陽(yáng)性診斷結(jié)果的幾率；而且對(duì)于弱陽(yáng)性反應(yīng)，通過人為肉眼判讀的方式很可能誤判為陰性；通過電泳的方法來判讀結(jié)果的方式，增加了試驗(yàn)成本、耗時(shí)間且容易造成實(shí)驗(yàn)室污染。而本發(fā)明的LAMP熒光檢測(cè)方法，熒光染料是在反應(yīng)前加入，不需要開蓋，能有效避免氣溶膠污染。此外，本發(fā)明的LAMP檢測(cè)方法在結(jié)果判定上，可以直接通過濁度儀檢測(cè)反應(yīng)管的濁度值來判定結(jié)果，可不進(jìn)行熒光染料法檢測(cè)結(jié)果或者進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。5）可實(shí)時(shí)定量本發(fā)明利用Tubidimeterreal-timeLA-320濁度儀來實(shí)時(shí)分析LAMP反應(yīng)的結(jié)果，不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì)應(yīng)的濁度值的時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可進(jìn)行定量檢測(cè)。附圖說明圖1是本發(fā)明LAMP方法特異性檢測(cè)結(jié)果，其中A1、霍亂弧菌1；A2、霍亂弧菌2；A3、嗜水氣單胞菌；A4、維氏氣單胞菌；A5、鮰愛德華氏單胞菌；A6、哈氏孤菌；A7、創(chuàng)傷孤菌；A8、水對(duì)照；結(jié)果顯示2株霍亂弧菌反應(yīng)管出現(xiàn)濁度的上升曲線，為陽(yáng)性結(jié)果，5株陰性對(duì)照菌反應(yīng)管和水對(duì)照反應(yīng)均無擴(kuò)增。圖2和圖3分別是本發(fā)明LAMP方法及傳統(tǒng)PCR方法的敏感性檢測(cè)結(jié)果；其中1：2.05×101ng/Μl；2：2.05×100ng/μL；3：2.05×10-1ng/μL；4：2.05×10-2ng/μL；5：2.05×10-3ng/μL；6：2.05×10-4ng/μL；7：2.05×10-5ng/μL；8：2.05×10-6ng/μL；9：2.05×10-7ng/μL?；魜y弧菌模板DNA的起始濃度為2.05×101ng/μL，經(jīng)10倍倍比稀釋后進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示LAMP法檢測(cè)限約為2.05×10-2ng/μL，而PCR法檢測(cè)限為2.05×10-1ng/μL。圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果：右管為以霍亂弧菌基因組DNA為模板的反應(yīng)情況，為陽(yáng)性結(jié)果，左管為陰性對(duì)照的反應(yīng)情況，為陰性結(jié)果。圖5是本發(fā)明定量檢測(cè)霍亂弧菌LAMP方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì)應(yīng)的濁度值對(duì)時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可進(jìn)行定量檢測(cè)。具體實(shí)施方式1、材料的準(zhǔn)備霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏單胞菌、哈氏孤菌、創(chuàng)傷孤菌，為廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)所分離鑒定和保存。LAMP法DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京藍(lán)譜生物科技有限公司，貨號(hào)SLP204，細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW0522。2、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中的霍亂弧菌Mdh序列，利用LAMP法引物輔助設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV4軟件設(shè)計(jì)一套LAMP引物，其中F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi)引物，其中F3、B3為霍亂弧菌PCR檢測(cè)引物，其中F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；3、細(xì)菌基因組DNA提取使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取受試細(xì)菌的基因組DNA。4、LAMP反應(yīng)體系建立按照試劑盒說明書，按25μl體系配置：2×反應(yīng)緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍亂弧菌DNA2μL超純水補(bǔ)足25μL。LAMP反應(yīng)在以實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進(jìn)行密閉全程監(jiān)控的形式監(jiān)測(cè)本方法的檢出情況，濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增情況，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過獲得未知樣品達(dá)到0.1濁度值對(duì)應(yīng)的時(shí)間值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)，反應(yīng)溫度以試劑盒推薦的63℃做為反應(yīng)溫度。5、LAMP檢測(cè)方法1）特異性檢測(cè)分別提取霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏單胞菌、哈氏孤菌、創(chuàng)傷孤菌的基因組DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，檢驗(yàn)LAMP方法的特異性。2）敏感性檢測(cè)以提取的霍亂弧菌基因組DNA為模板，測(cè)定其濃度，用RNA-FreeWater連續(xù)10倍倍比稀釋成8個(gè)稀釋度，取各稀釋度2μL作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增，對(duì)比兩種檢測(cè)方法的敏感性。3）熒光可視化檢測(cè)根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，加入熒光染料，熒光染料在反應(yīng)前加入，加入的染料為鈣黃綠素商用染料，63℃下反應(yīng)60分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。實(shí)施例1LAMP檢測(cè)方法的特異性結(jié)果對(duì)2株霍亂弧菌、5株陰性對(duì)照菌和水對(duì)照進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，霍亂弧菌反應(yīng)管在33分鐘左右出現(xiàn)濁度的上升曲線，為陽(yáng)性結(jié)果，5株陰性對(duì)照菌反應(yīng)管和水對(duì)照反應(yīng)管曲線均無擴(kuò)增情況出現(xiàn)，為陰性結(jié)果。實(shí)施例2LAMP檢測(cè)方法的敏感性結(jié)果霍亂弧菌DNA模板起始濃度為2.05×101ng/μL，經(jīng)10倍倍比稀釋后進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2和圖3所示，結(jié)果顯示LAMP法檢測(cè)限約為2.05×10-2ng/μL，而PCR法檢測(cè)限為2.05×10-1ng/μL。實(shí)施例3LAMP檢測(cè)方法的熒光可視化檢測(cè)結(jié)果根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，反應(yīng)器加入熒光染料，63℃反應(yīng)60分鐘后，在紫外燈下觀察，圖4為觀察結(jié)果，左管為陰性對(duì)照，右管為以霍亂弧菌為模板的反應(yīng)情況，表明建立的方法可以方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設(shè)計(jì)的LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來保持63℃60分鐘，即可快速觀察結(jié)果，且無需開蓋，避免了污染。實(shí)施例4霍亂弧菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制設(shè)置對(duì)照：濃度為2.05×101ng/μL、2:2.05×100ng/μL、2.05×10-1ng/μL、4:2.05×10-2ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)樣品濃度的負(fù)對(duì)數(shù)值與其擴(kuò)增濁度值為0.1的時(shí)間值成線性關(guān)系，所以可以將濁度儀捕捉到的值與時(shí)間（如表1）做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，y=0.1772x-6.9253，如圖5所示。從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來看相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，呈良好的線性關(guān)系。以時(shí)間為X值，可求出Y值即濃度的負(fù)次方數(shù)，則濃度為10-y，再乘以基數(shù)2.05，即為2.05×10-yng/μL。如某試驗(yàn)樣品達(dá)到濁度值為0.1的時(shí)間為35分鐘時(shí)，帶入所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出Y等于-0.7233，則濃度為100.7233，再乘以基數(shù)2.05，即為該樣品的濃度2.05×100.7233ng/μL，從而達(dá)到定量的效果。表1時(shí)間(min)33.938.943.950.9標(biāo)準(zhǔn)值（-LOG）-1012<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所<120>一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1CTGAAACCTTTGTTGCCGC<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GCCCATAGAAAGAGTCGCTG<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>3GGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCG<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>4TTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3